Name: pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform
Uploaded: 2022-08-17T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Zhangyong Ming e ao Sr. Rongji Hou por seus conselhos sobre a aplicação expandida lims. Este estudo é apoiado pelo PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) e Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).

Todos os protocolos e a biópsia do trophectoderm (TE) (seção 1.1.1.1) aplicada neste estudo foram revisados e aprovados pelo comitê de ética em pesquisa humana do hospital nº 924 em 18 de setembro de 2017 (NO: PLA924-2017-59). Os pacientes/participantes forneceram seu consentimento por escrito informado para participar deste estudo.
1. Isolamento de DNA da biópsia humana e amplificação genômica total
<ol><li>Protocolo para amplificação total do genoma<sup class="...

<ol>
	<li>Driscoll, D. A., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Hong, K. 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Qubit&#174; 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf</a> (2014)</li><li>Ion AmpliSeq&#8482; DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf</a> (2019)</li><li>Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf</a> (2015)</li><li>Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Torrent+sequencing+for+conducting+genome-wide+scans+for+mutation+mapping+analysis.">Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis.</a> Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).</li><li>Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+testing+for+aneuploidy:+what+technology+should+you+use+and+what+are+the+differences.">Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).</li><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+improving+access+to+variant+interpretations+and+supporting+evidence.">ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence.</a> Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).</li><li>Genomes Project, C, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+reference+for+human+genetic+variation.">A global reference for human genetic variation.</a> Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).</li><li>McKusick, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+inheritance+in+man+and+its+online+version,+OMIM.">Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM.</a> American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).</li><li>Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANNOVAR:+functional+annotation+of+genetic+variants+from+high-throughput+sequencing+data.">ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).</li><li>Zhao, M., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNVannotator:+A+comprehensive+annotation+server+for+copy+number+variation+in+the+human+genome.">CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome.</a> PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+next-generation+sequencing+in+pre-implantation+genetic+diagnosis+cycles+for+Robertsonian+and+reciprocal+translocations.">Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+allele+with+resolved+carrier+status+of+Robertsonian+and+reciprocal+translocation+in+human+pre-implantation+embryos.">Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).</li></ol>

A aneuploide cromossômica dos embriões é a causa de uma grande proporção de perda de gravidez, concebida naturalmente ou in vitro (FIV). Na prática clínica da FIV, propõe-se que a triagem da aneuploidia do embrião e a transferência do embrião euploidy possam melhorar o resultado da FIV. Fluorescência na hibridização situ é a técnica mais antiga adotada para seleção sexual e PGT-A; no entanto, essa técnica requer mais conhecimento técnico do pessoal do laboratório e é relativamente ...

Aneuploidia é a anormalidade no número de cromossomos pela presença de um ou mais cromossomos extras ou a ausência de um ou mais cromossomos. Embriões que carregam algum tipo de aneuploidia, como a perda de um cromossomo X (síndrome de Turner), cópias extras de autossósmos, como trissomias de autossóssomo 21 (síndrome de Down), 13 (síndrome de Patau) e 18 (síndrome de Edwards), ou cromossomos sexuais extras como 47, XXY (síndrome de Klinefelter) e 47, XXX (síndrome do X triplo), podem sobreviver a termo com defeitos de nascimento1. A aneuploidia é a principal causa de abortos no primeiro trimestre e falha na fertilização in vitro (FIV)2. Relata-se que a taxa de aneuploidia pode variar de 25,4%a 84,5% através das diferentes camadas etárias do ciclo natural e do grupo de controle medicado na práticade FIV 3.
A tecnologia de sequenciamento de última geração está se tornando extremamente aplicada na determinação de informações genéticas clinicamente; proporciona acesso prático à sequência de genomas com eficiência e alto rendimento. Particularmente, o sequenciamento de próxima geração também revolucionou o diagnóstico de distúrbios com fatores genéticos e testes de abnormidade no genoma4. Usando a tecnologia de sequenciamento de semicondutores para transferir diretamente sinais químicos no sequenciamento da bio-reação em dados digitais, o sistema de sequência baseado em semicondutores fornece uma detecção direta e em tempo real para sequenciar dados em 3-7 h 5,6.
Em um procedimento de FIV, o teste genético pré-implantação (PGT) investiga o perfil genético do embrião antes de ser transferido para o útero para melhorar o resultado da FIV e reduzir o risco de desordens genéticas em recém-nascidos 1,7. Em PGT combinado com técnicas de NGS, o material genético extraído de menos de 10 células é amplificado com kits inteiros de amplificação do genoma ou um reagente de amplificação de genoma inteiro desenvolvido de forma independente. Isso requer apenas uma etapa na fase de amplificação e não requer pré-amplificação, para obter produtos de amplificação de genoma inteiro. Primers ou painéis para variante de número de cópia e sequenciamento especial de loci genético são projetados e aplicados na biblioteca construída.
Um fluxo de trabalho típico de teste genético pré-implantação-aneuploidia (PGT-A) em NGS envolve procedimentos seriais, e requer uma carga de trabalho intensa do pessoal de laboratório8. Alguns erros de operação causaram o retrocesso do procedimento pode levar à perda indesejada de tempo e recursos do laboratório. Um procedimento operacional padrão conciso e claro (SOP) para o fluxo de trabalho PGS-NGS é útil; no entanto, os protocolos de formato de texto não podem apresentar informações mais detalhadas sobre processamento de amostras, manipulação de dispositivos e configurações de instrumentos, que podem ser visualizadas em um protocolo de vídeo. Neste artigo, um fluxo de trabalho validado combinado com uma demonstração visualizada de detalhes operacionais poderia oferecer protocolos de referência mais diretos e intuitivos na prática pgt em uma plataforma de sequenciamento de semicondutores.
O protocolo aqui descreve um método que suporta loteamento de até 16 biópsias de embriões em paralelo. Para lotes maiores, recomenda-se o uso de um protocolo comercial baseado em kit para sequenciamento de semicondutores, como o Reproes-PGS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Syringe Filter Unit</td>
			<td>Merkmillipore</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mLDNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anstart Tap DNA Polymerase</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis buffer</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM &#946;-glycerophosphate, 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinVar</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA elution buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1016L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>P031-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Independently developed whole genome amplification reagents</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>The reagents consist of the following components: 
			1. Cell Lysis 
			2. Amplification Pre-mixed solution 
			&#160;&#160;&#160; 1) Primer WGA-P2 (10 &#956;M) 
			&#160;&#160;&#160; 2) dNTP (10 mM) 
			&#160;&#160;&#160; 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 
			3. Amplification Enzyme 
			&#160;&#160;&#160; 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/&#956;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26434</td>
			<td>Kit mentioned in step 4.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4476610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Server System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4487118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Preparation Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>114</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo WGA-P2</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN 
			NNNNATGTGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTouch 2 System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4474779</td>
			<td>&#160;Template amplification and enrichment system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Kit</td>
			<td>Takara Bio USA</td>
			<td>R300671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Quality Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Mini Centrifuge LX-300</td>
			<td>Qilinbeier</td>
			<td>E0122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer server system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Torrent Suite Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Reactions Universal Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>113</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html 
			This kit contains the following components: 
			1. Template Preparation Kit Set 
			 
			1.1 Template Preparation Kit: 
			Emulsion PCR buffer 
			Emulsion PCR enzyme mix 
			Template carrier solution 
			 
			1.2 Template Preparation solutions: 
			Template preparation reaction oil I 
			emulsifier breaking solution II 
			Template Preparation Reaction Oil II 
			Nuclease-free water 
			Tween solution 
			Demulsification solution I 
			Template washing solution 
			C1 bead washing solution 
			C1 bead resuspension solution 
			Template resuspension solution 
			 
			1.3 Template Preparation Materials: 
			Reagent tube I 
			connector 
			Collection tube 
			Reagent tube pipette I 
			Amplification plate 
			8 wells strip 
			Dedicated tips 
			Template preparation washing adapter 
			Template preparation filter 
			 
			2. Sequencing Kit Set 
			 
			2.1 Sequencing Kit: 
			dGTP 
			dCTP 
			dATP 
			dTTP 
			Sequencing enzyme solution 
			Sequencing primers 
			Quality control templates 
			 
			2.2&#160; Sequencing Solutions: 
			Sequencing solution II 
			Sequencing solution IIII 
			Annealing buffer 
			Loading buffer 
			Foaming agent 
			Chlorine tablets 
			C1 bead 
			 
			2.3 Sequencing Materials: 
			Reagent Tube II 
			Reagent tube cap 
			Reagent tube sipper&#160; II 
			Reagent bottle sipper 
			Reagent bottles 
			 
			3. Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform

O sequenciamento de última geração ganhou cada vez mais importância na aplicação clínica na determinação de variantes genéticas. No teste genético pré-implantação, essa técnica tem suas vantagens únicas em escalabilidade, throughput e custo. Para o teste genético pré-implantação para análise de aneuploide, o sistema de sequenciamento de última geração (NGS) baseado em semicondutores apresentado aqui fornece uma abordagem abrangente para determinar variantes genéticas estruturais a uma resolução mínima de 8 Mb. Desde a aquisição da amostra até o relatório final, o processo de trabalho requer múltiplas etapas com adesão próxima aos protocolos. Uma vez que várias etapas críticas poderiam determinar o resultado da amplificação, qualidade da biblioteca, cobertura de leituras e saída de dados, informações descritivas com demonstração visual diferente das palavras poderiam oferecer mais detalhes para a operação e manipulação, o que pode ter um grande impacto nos resultados de todas as etapas críticas. Os métodos aqui apresentados exibirão os procedimentos envolvidos em toda a amplificação do genoma (WGA) de células biópsias de Trophectoderme (TE), construção de biblioteca genômica, gerenciamento de sequenciadores e, finalmente, gerando relatórios de variantes de número de cópia.

À medida que o plano de sequências termina após o processo de execução na máquina, o sistema de servidor de sequência relata o resumo com informações descritivas dos dados gerados, status do chip, taxa de carregamento isp e qualidade da biblioteca, como mostrado na Figura 2. Nesta demonstração de resultados, foram obtidos dados de 17,6 G na base total, e a taxa global de carregamento de ISP foi de 88% no total de poços do chip; o mapa de calor mostrou que a amostra foi carregada ...

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Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

O protocolo apresenta os procedimentos gerais em laboratório necessários em testes genéticos pré-implantação para aneuploide em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração baseada em semicondutores. Aqui apresentamos as etapas detalhadas de amplificação completa do genoma, seleção de fragmentos de DNA, construção de bibliotecas, preparação de modelos e sequenciamento do fluxo de trabalho com resultados representativos.

Teste genético pré-implantação para aneuploidia em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração baseada em semicondutores

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...

Este protocolo apresenta o procedimento desde a amplificação de célula única até os dados finais de relatórios no teste genético pré-implantação para aneuploidia em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração baseada em semicondutores. Este procedimento pode ajudar os espectadores a ter uma boa compreensão do fluxo de trabalho experimental do sequenciamento PGT-A e replicar essa técnica em um laboratório de diagnóstico com uma plataforma NGS baseada em semicondutores. Comece por tubos de 25 microlitadores de todo o genoma produtos de amplificação e transferindo-os para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro pré-carregado com 25 microliters de água livre nuclease.Vórtice e misture as contas de purificação de DNA. Alíquota 50 microliters desta solução em cada tubo amostral. Vórtice e centrífuga brevemente por cinco segundos.Coloque o tubo por cinco minutos em temperatura ambiente para o processo de ligação de DNA. Insira o tubo de centrífuga de 1,5 mililitro em um rack magnético. Então, espere até que todas as contas magnéticas sejam atraídas para a parede lateral do tubo.Transfira cuidadosamente o supernasal em um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Evite estoizar as contas. De acordo com o volume original da amostra.Pipeta 30 microliters de contas magnéticas, vórtice e centrífuga brevemente por cinco segundos. Coloque o tubo por cinco minutos em temperatura ambiente para o processo de ligação de DNA. Insira os tubos de centrifugação de 1,5 milímetros no rack magnético.Então, espere até que todas as contas magnéticas sejam atraídas para a parede lateral do tubo. Remova cuidadosamente e descarte o supernaspe. Evite encanar as contas.Pipeta 300 microliters de 70% de etanol no tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, gire suavemente o tubo duas vezes em um ângulo de 180 graus e mova as contas ao longo da parede do tubo para uma lavagem completa. Pipeta e descarte o supernaspe.Evite encanar as contas. Repita o procedimento de lavagem uma vez. Coloque uma nova placa de amplificação no sistema assim que o programa limpo estiver concluído.Insira os tubos de coleta, cada um pré-preenchido com 150 microliters quebrando a solução dois no rotor, em seguida, coloque a ponte sobre os tubos de coleta. Adicione o óleo de reação à metade do tubo e a solução de quebra do emulsificador a um terço do tubo. Coloque um novo filtro para a preparação do modelo em um rack de tubo com o portal de amostra posicionado para cima.Vórtice a solução por cinco segundos e centrífuga brevemente por cinco segundos. Em seguida, transfira a solução para o portal de amostras do filtro após a pipetação de 800 microliters três vezes. Centrifugar o tubo para diminuir bolhas antes da última injeção.Evite injetar ar no filtro. Injete 200 microliters de óleo de reação dois, seguindo a solução mista. Gire o portal de amostras do filtro para baixo e substitua a adaptação de lavagem pelo filtro.Insira a agulha da amostra no orifício central da tampa do rotor e, em seguida, pressione a agulha até o fundo. Clique no botão Executar na tela e escolha o programa de acordo com o kit correspondente. Em seguida, selecione Assistido para verificar todas as etapas.Clique em Next até que a execução seja iniciada. A corrida levará aproximadamente 4,5 horas para terminar. Selecione Next quando o programa terminar.O sistema iniciará um processo de centrifugação de 10 minutos. Após a centrifugação, clique no botão Abrir tampa e mova os tubos de coleta para racks. Se o procedimento não passar para a próxima etapa em 15 minutos, pressione o giro final para re-centrífugas.Remova o supernatante no tubo de coleta, deixando 100 microliters de solução no tubo. Misture a amostra restante por pipetação e transfira a amostra para o novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro marcado OT. Ao pipetar o supernatante, evite tocar na parte inferior do tubo ao longo dos lados. Pipeta 100 microliters de água livre de nuclease em cada tubo de coleta e transferir a solução para o tubo OT lavado por tubulação repetida.Adicione 600 microliters de água livre de nuclease ao tubo OT para compor o volume total de um mililitro. Vórtice por 30 segundos em centrífuga a 15.500 vezes G por oito minutos. Remova suavemente o supernatante deixando 100 microliters de solução no tubo OT.Use a ponta para descartar completamente a camada de óleo. Adicione 900 microliters de água livre de nuclease, vórtice por 30 segundos e centrífuga a 15.500 vezes G por oito minutos. Remova o supernatante até 20 microliters da solução permanece e adicione a solução de resususus pendentes do modelo para compor o volume de 100 microliters.Em seguida, vórtice por 30 segundos e brevemente centrífuga por dois segundos. Prossiga para o próximo passo dentro de 12 horas após o processamento da amostra Carregar 100 microliters da biblioteca diluída, 130 microliters de contas C1, 300 microliters de três x solução de lavagem de modelo, e 300 microliters da solução de derretimento para as oito tiras de poço. Instale as oito tiras de poço no Módulo de Enriquecimento, carregue a ponta de pipetação e coloque o tubo de centrífugas de 200 microliters na posição de coleta.Clique em Iniciar para executar o programa. Pipeta 55 microliters da solução amostral e injetá-la no orifício amostral do chip. Coloque o chip na centrífuga.Mantenha o entalhe para o lado de fora e o portal de amostras dentro. Em seguida, equilibre-o com outro chip usado e centrífuga por 10 minutos. Prepare a solução de carregamento conforme descrito no manuscrito do texto.Sopre 100 microliters de ar na solução de espuma. Pipeta a solução repetidamente até que as bolhas estejam em um estado denso, espumando e mantenha o volume de espuma para aproximadamente 250 microliters. Coloque o chip no banco após a centrífuga.Injete 100 microliters de espuma no orifício da amostra e remova a solução extrudada no portal de saída. Em seguida, centrifugar o chip brevemente por 30 segundos. Repita este processo uma vez.Injete 100 microliters a 50% de tampão de lavagem duas vezes e remova a solução extrudada no portal out após cada injeção. Em seguida, injete 100 microliters a 50% de corte de buffer três vezes e remova a solução extrudada no portal out após cada injeção. Injete 65 microliters no buffer de reação de 50% de enzimas, evitando bolhas e remova a solução extrudada no portal out.Estabilize o chip carregado em temperatura ambiente por cinco minutos e instale o chip no portal do chip sequenciador. Escolha o programa planejado, verifique as informações e inicie a execução. A corrida representativa obteve um total de 17,6 gigabytes de dados e a taxa de carregamento global da partícula da esfera de íon foi de 88% no total de poços do chip.O mapa de calor confirmou até mesmo o carregamento de amostras na área total do chip. 77% do total de leituras eram utilizáveis. Todos os poços carregados com ISP mostraram 100% de enriquecimento de modelos em que 78% eram clonais.De todos os modelos clonais, 97% foram qualificados como biblioteca final. O comprimento médio da leitura foi de 177 pares de base, enquanto a mediana e o modo foram 176 e 174 pares de base, respectivamente. As contagens máximas de timina, citosina e adenina nos modelos foram de aproximadamente 76 sobre a linha de corte qualificada de 50.Em todos os poços endereçados com ISPs vivos 99,5% qualificados como biblioteca construída e 20% de bibliotecas policlonais e de baixa qualidade foram filtrados, enquanto 76,6% dos ISPs foram qualificados para análise suplementar. O resultado da variação do número de cópia de uma única amostra retratou um segmento de 182,16 pares de megabases de mosaico de P 16,3 a Q 35,2 no cromossomo quatro e um segmento monossomia de 33 pontos 13 megabases de Q 11,1 a Q 13,33 no Cromossomo 22. Ao realizar a seleção de fragmentos, os intervalos de tempo entre as etapas devem ser modificados de acordo com o tamanho das amostras no mesmo lote para evitar excesso e falta de exposição para amostras frontais e traseiras.

Research

JoVE Journal

Genetics

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Avaliação da contaminação de DNA em amostras de RNA com base no ADN ribossómico

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Genética

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Otimização e Análise Comparativa de Métodos de Enriquecimento de DNA de Plantas Organizadas Adequado para Seqüenciamento de Próxima Geração

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Sequenciamento de nova geração direcionado e fluxo de análises de bioinformática para avaliar determinantes genéticos de doenças constitucionais

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplificação de perto completos provírus HIV-1 para a próxima geração de sequenciamento

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Engenharia genética de células de Dictyostelium discoideum com base na seleção e crescimento de bactérias

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Espectrometria de massa-baseado Proteomics análises usando banco de dados OpenProt para desvendar novas proteínas traduzidas de Frames de leitura abertos não-canônicos

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

Sequenciamento de nova geração de RNA e um fluxo de análise de bioinformática para identificar expressão de LINE-1s a nível locus-específico

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...