Name: pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform
Uploaded: 2022-08-17T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Чжанъюн Мина и г-на Жунцзи Хоу за их советы по расширенному применению LIMS. Это исследование поддерживается Специальными исследовательскими проектами НОАК по планированию семьи (17JS008, 20JSZ08), Фондом Гуансийской ключевой лаборатории исследований метаболических заболеваний (No 20-065-76) и Научно-техническим исследовательским проектом гражданского здравоохранения Гуанчжоу (201803010034).

Все протоколы и биопсия трофэктодермы (TE) (раздел 1.1.1.1), примененные в этом исследовании, были рассмотрены и одобрены комитетом по этике исследований человека больницы No 924 18 сентября 2017 года (NO: PLA924-2017-59). Пациенты/участники предоставили свое письменное информированное согласие на участи...

<ol>
	<li>Driscoll, D. A., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Hong, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+aneuploidy+rates+are+equivalent+in+natural+cycles+and+gonadotropin-stimulated+cycles.">Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles.</a> Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).</li><li>Adams, D. R., Eng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+to+diagnose+suspected+genetic+disorders.">Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).</li><li>Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+ion+torrent+semiconductor+chip+based+sequencing.">Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing.</a> Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).</li><li>Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-implantation+genetic+screening+techniques:+Implications+for+clinical+prenatal+diagnosis.">Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis.</a> Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).</li><li>Dilliott, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+next-generation+sequencing+and+bioinformatics+pipeline+to+evaluate+genetic+determinants+of+constitutional+disease.">Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).</li><li>Ion ReproSeq&#8482; PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf</a> (2017)</li><li>PicoPLEX&#174; Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf">https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf</a> (2019)</li><li>. Qubit&#174; 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf</a> (2014)</li><li>Ion AmpliSeq&#8482; DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf</a> (2019)</li><li>Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf</a> (2015)</li><li>Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html">https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html</a> (2017)</li><li>Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Bayesian+inference+of+copy+number+variants+using+Hidden+Markov+models+with+wavelet+compression.">Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression.</a> PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).</li><li>Rubio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-implantation+genetic+screening+using+fluorescence+in+situ+hybridization+in+patients+with+repetitive+implantation+failure+and+advanced+maternal+age:+two+randomized+trials.">Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials.</a> Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).</li><li>Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+screening+(PGS)+still+in+search+of+a+clinical+application:+a+systematic+review.">Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).</li><li>Bono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+semiconductor+next-generation+sequencing-based+protocol+for+pre-implantation+genetic+diagnosis+of+reciprocal+translocations.">Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations.</a> Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).</li><li>Handyside, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=24-chromosome+copy+number+analysis:+a+comparison+of+available+technologies.">24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).</li><li>Wells, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utilisation+of+a+rapid+low-pass+whole+genome+sequencing+technique+for+the+diagnosis+of+aneuploidy+in+human+embryos+prior+to+implantation.">Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).</li><li>El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequence+assembly:+Four+stages+of+data+processing+and+computational+challenges.">Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges.</a> PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).</li><li>Jennings, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+validation+of+next-generation+sequencing-based+oncology+panels:+A+joint+consensus+recommendation+of+the+Association+for+Molecular+Pathology+and+College+of+American+Pathologists.">Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists.</a> The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).</li><li>de Bourcy, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+comparison+of+single-cell+whole+genome+amplification+methods.">A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods.</a> PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).</li><li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+next-generation+sequencing+technology+for+comprehensive+aneuploidy+screening+of+blastocysts+in+clinical+pre-implantation+genetic+screening+cycles.">Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles.</a> Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).</li><li>Damerla, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Torrent+sequencing+for+conducting+genome-wide+scans+for+mutation+mapping+analysis.">Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis.</a> Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).</li><li>Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+testing+for+aneuploidy:+what+technology+should+you+use+and+what+are+the+differences.">Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).</li><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+improving+access+to+variant+interpretations+and+supporting+evidence.">ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence.</a> Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).</li><li>Genomes Project, C, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+reference+for+human+genetic+variation.">A global reference for human genetic variation.</a> Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).</li><li>McKusick, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+inheritance+in+man+and+its+online+version,+OMIM.">Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM.</a> American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).</li><li>Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANNOVAR:+functional+annotation+of+genetic+variants+from+high-throughput+sequencing+data.">ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).</li><li>Zhao, M., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNVannotator:+A+comprehensive+annotation+server+for+copy+number+variation+in+the+human+genome.">CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome.</a> PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+next-generation+sequencing+in+pre-implantation+genetic+diagnosis+cycles+for+Robertsonian+and+reciprocal+translocations.">Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+allele+with+resolved+carrier+status+of+Robertsonian+and+reciprocal+translocation+in+human+pre-implantation+embryos.">Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).</li></ol>

Хромосомная анеуплоидия эмбрионов является причиной большой доли потери беременности, будь то естественное оплодотворение или экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО). В клинической практике ЭКО предполагается, что скрининг анеуплоидии эмбриона и перенос эмбриона эуплоидии мож...

Анеуплоидия — это аномалия в количестве хромосом при наличии одной или нескольких лишних хромосом или отсутствии одной или нескольких хромосом. Эмбрионы, которые несут некоторый тип анеуплоидии, такой как потеря одной Х-хромосомы (синдром Тернера), дополнительные копии аутосом, таких как трисомы аутосомы 21 (синдром Дауна), 13 (синдром Патау) и 18 (синдром Эдвардса), или дополнительные половые хромосомы, такие как 47, XXY (синдром Клайнфельтера) и 47, XXX (синдром Тройного X), могут дожить до срока с врожденными дефектами1. Анеуплоидия является основной причиной выкидышей в первом триместре и неудачи экстракорпорального оплодотворения (ЭКО)2. Сообщается, что частота анеуплоидии может варьироваться от 25,4% до 84,5% через различные возрастные слои естественного цикла и медикаментозную контрольную группу в практике ЭКО3.
Технология секвенирования следующего поколения получает широкое применение при клиническом определении генетической информации; он обеспечивает практический доступ к последовательности генома с эффективностью и высокой пропускной способностью. В частности, секвенирование следующего поколения также произвело революцию в диагностике расстройств с генетическими факторами и тестах на аномалию в геноме4. Используя технологию секвенирования полупроводников для непосредственной передачи химических сигналов при секвенировании биореакций в цифровые данные, система последовательностей на основе полупроводников обеспечивает прямое обнаружение в режиме реального времени для последовательности данных за 3-7 ч 5,6.
В процедуре ЭКО предимплантационное генетическое тестирование (PGT) исследует генетический профиль эмбриона перед переносом в матку для улучшения результатов ЭКО и снижения риска генетических нарушений у новорожденных 1,7. В PGT в сочетании с методами NGS генетический материал, извлеченный из менее чем 10 клеток, амплментируется с помощью наборов для амплификации всего генома или независимо разработанного реагента амплификации всего генома. Это требует только одного шага в фазе амплификации и не требует предварительной амплификации для получения продуктов амплификации всего генома. В построенной библиотеке разработаны и применены праймеры или панели для варианта номера копии и специального секвенирования локусов генов.
Типичный рабочий процесс предимплантационного генетического тестирования-анеуплоидии (PGT-A) в NGS включает в себя последовательные процедуры и требует интенсивной рабочей нагрузки лабораторного персонала8. Некоторая неправильная работа, вызванная откатом процедуры, может привести к нежелательной потере как времени, так и ресурсов лаборатории. Полезна краткая и четкая стандартная операционная процедура (СОП) для рабочего процесса PGS-NGS; однако протоколы текстового формата не могут предоставлять более подробную информацию об обработке образцов, манипулировании устройствами и настройках инструментов, которая может быть визуализирована в видеопротоколе. В этой статье проверенный рабочий процесс в сочетании с визуализированной демонстрацией рабочих деталей может предложить более прямые и интуитивно понятные ссылающиеся протоколы в практике PGT на платформе секвенирования полупроводников.
Протокол здесь описывает метод, который поддерживает пакетирование до 16 биопсий эмбрионов параллельно. Для больших партий рекомендуется использовать коммерческий протокол секвенирования полупроводников на основе комплектов, такой как Reproes-PGS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Syringe Filter Unit</td>
			<td>Merkmillipore</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mLDNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anstart Tap DNA Polymerase</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis buffer</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM &#946;-glycerophosphate, 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinVar</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA elution buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1016L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>P031-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Independently developed whole genome amplification reagents</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>The reagents consist of the following components: 
			1. Cell Lysis 
			2. Amplification Pre-mixed solution 
			&#160;&#160;&#160; 1) Primer WGA-P2 (10 &#956;M) 
			&#160;&#160;&#160; 2) dNTP (10 mM) 
			&#160;&#160;&#160; 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 
			3. Amplification Enzyme 
			&#160;&#160;&#160; 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/&#956;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26434</td>
			<td>Kit mentioned in step 4.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4476610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Server System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4487118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Preparation Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>114</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo WGA-P2</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN 
			NNNNATGTGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTouch 2 System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4474779</td>
			<td>&#160;Template amplification and enrichment system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Kit</td>
			<td>Takara Bio USA</td>
			<td>R300671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Quality Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Mini Centrifuge LX-300</td>
			<td>Qilinbeier</td>
			<td>E0122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer server system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Torrent Suite Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Reactions Universal Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>113</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html 
			This kit contains the following components: 
			1. Template Preparation Kit Set 
			 
			1.1 Template Preparation Kit: 
			Emulsion PCR buffer 
			Emulsion PCR enzyme mix 
			Template carrier solution 
			 
			1.2 Template Preparation solutions: 
			Template preparation reaction oil I 
			emulsifier breaking solution II 
			Template Preparation Reaction Oil II 
			Nuclease-free water 
			Tween solution 
			Demulsification solution I 
			Template washing solution 
			C1 bead washing solution 
			C1 bead resuspension solution 
			Template resuspension solution 
			 
			1.3 Template Preparation Materials: 
			Reagent tube I 
			connector 
			Collection tube 
			Reagent tube pipette I 
			Amplification plate 
			8 wells strip 
			Dedicated tips 
			Template preparation washing adapter 
			Template preparation filter 
			 
			2. Sequencing Kit Set 
			 
			2.1 Sequencing Kit: 
			dGTP 
			dCTP 
			dATP 
			dTTP 
			Sequencing enzyme solution 
			Sequencing primers 
			Quality control templates 
			 
			2.2&#160; Sequencing Solutions: 
			Sequencing solution II 
			Sequencing solution IIII 
			Annealing buffer 
			Loading buffer 
			Foaming agent 
			Chlorine tablets 
			C1 bead 
			 
			2.3 Sequencing Materials: 
			Reagent Tube II 
			Reagent tube cap 
			Reagent tube sipper&#160; II 
			Reagent bottle sipper 
			Reagent bottles 
			 
			3. Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform

Секвенирование следующего поколения приобретает все большее значение в клиническом применении при определении генетических вариантов. В предимплантационном генетическом тесте этот метод имеет свои уникальные преимущества в масштабируемости, пропускной способности и стоимости. Для предимплантационного генетического теста для анализа анеуплоидии представленная здесь полупроводниковая система секвенирования следующего поколения (NGS) обеспечивает комплексный подход к определению структурных генетических вариантов с минимальным разрешением 8 Мб. От получения образца до окончательного отчета рабочий процесс требует нескольких этапов с строгим соблюдением протоколов. Поскольку различные критические шаги могут определять результат усиления, качество библиотеки, охват чтения и вывод данных, описательная информация с визуальной демонстрацией, отличной от слов, может предложить более подробную информацию об операции и манипуляции, что может оказать большое влияние на результаты всех критических шагов. Способы, представленные в настоящем описании, будут отображать процедуры, участвующие в амплификации всего генома (WGA) биопсий клеток трофэктодермы (TE), построении геномной библиотеки, управлении секвенсорами и, наконец, генерации отчетов о вариантах номеров копий.

Поскольку план последовательностей завершается после запуска процесса на машине, система сервера последовательностей сообщает сводку с описательной информацией о сгенерированных данных, состоянии чипа, скорости загрузки ISP и качестве библиотеки, как показано на рисунке 2<...

Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

Протокол представляет общие лабораторные процедуры, необходимые для предимплантационного генетического тестирования на анеуплоидию на основе полупроводниковой платформы секвенирования следующего поколения. Здесь мы представляем подробные этапы амплификации всего генома, выбора фрагментов ДНК, построения библиотеки, подготовки шаблонов и секвенирования рабочего потока с репрезентативными результатами.

Предимплантационное генетическое тестирование анеуплоидии на платформе секвенирования следующего поколения на основе полупроводников

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...

Этот протокол представляет процедуру от амплификации одиночных клеток до окончательных отчетных данных в предимплантационном генетическом тестировании на анеуплоидию на платформе секвенирования следующего поколения на основе полупроводников. Эта процедура может помочь зрителям хорошо понять экспериментальный рабочий процесс секвенирования PGT-A и воспроизвести этот метод в диагностической лаборатории с платформой NGS на основе полупроводников. Начните с пипетирования 25 микролитров продуктов амплификации всего генома и переноса их в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку, предварительно загруженную 25 микролитрами воды без нуклеазы.Вихрь и смешайте бусины очистки ДНК. Aliquot 50 микролитров этого раствора в каждую пробирку. Вихрь и центрифуга ненадолго в течение пяти секунд.Установите трубку на пять минут при комнатной температуре для процесса связывания ДНК. Вставьте 1,5-миллилитровую центрифужную трубку в магнитную стойку. Затем подождите, пока все магнитные шарики притянутся к боковой стенке трубки.Осторожно перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую центрифужную трубку. Избегайте пипетки бусин. По первоначальному объему образца.Пипетка 30 микролитров магнитных шариков, вихрь и центрифуга ненадолго в течение пяти секунд. Установите трубку на пять минут при комнатной температуре для процесса связывания ДНК. Вставьте 1,5-миллиметровые центрифужные трубки в магнитную стойку.Затем подождите, пока все магнитные шарики притянутся к боковой стенке трубки. Осторожно удалите и выбросьте супернатант. Избегайте пипетки бусин.Пипетка 300 микролитров 70% этанола в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку. Затем осторожно поверните трубку дважды под углом 180 градусов и переместите бусины вдоль стенки трубки для тщательной промывки. Пипетку и выбросьте супернатант.Избегайте пипетки бусин. Повторите процедуру умывания один раз. Поместите новую усилительную пластину в систему после завершения очистки программы.Вставьте в ротор коллекторные трубки, каждая из которых предварительно заполнена 150 микролитрами, разбивая раствор два, затем поместите мост на трубы сбора. Добавьте реакционное масло к половине трубки, а эмульгатор разрушает раствор к одной трети трубки. Поместите новый фильтр для подготовки шаблона на стойку для трубок с порталом образца, расположенным вверху.Вращайте раствор в течение пяти секунд и центрифугируйте ненадолго в течение пяти секунд. Затем перекладывают раствор в образец портала фильтра после пипетки 800 микролитров три раза. Центрифугируйте трубку, чтобы уменьшить пузырьки перед последней инъекцией.Избегайте нагнетания воздуха в фильтр. Вводят 200 микролитров реакционного масла два, следуя за смешанным раствором. Поверните портал образца фильтра вниз и замените моющий приспособлен фильтром.Вставьте иглу образца в центральное отверстие крышки ротора, а затем прижмите иглу к дну. Нажмите на кнопку Run на экране и выберите программу согласно соответствующему комплекту. Затем выберите Assisted (С помощью assisted), чтобы проверить все шаги.Нажмите кнопку Далее, пока запуск не начнется. Пробег займет примерно 4,5 часа. Нажмите кнопку Далее после завершения работы программы.Система запустит 10-минутный процесс центрифугирования. После центрифугирования нажмите кнопку «Открыть крышку» и переместите коллекционные трубки в стойки. Если процедура не переходит к следующему шагу в течение 15 минут, нажмите на заключительный отжим для повторной центрифуги.Удалите супернатант в пробирке для сбора, оставив в трубке 100 микролитров раствора. Смешайте оставшийся образец путем пипетирования и перенесите образец в новую 1,5-миллилитровую центрифужную трубку с маркировкой OT. При пипетке супернатанта избегайте касания дна трубки по бокам. Пипетка 100 микролитров свободной от нуклеазы воды в каждую сборную трубку и перекладывает раствор в отеверженную трубку, промытую повторным пипетированием.Добавьте 600 микролитров воды без нуклеазы в трубку ОТ, чтобы составить общий объем одного миллилитра. Вихрь в течение 30 секунд в центрифуге при 15, 500 раз G в течение восьми минут. Аккуратно удалите супернатант, оставив 100 микролитров раствора в отеновой трубке.Используйте наконечник, чтобы полностью отбросить слой масла. Добавьте 900 микролитров воды без нуклеазы, вихрь в течение 30 секунд и центрифугу в 15, 500 раз g в течение восьми минут. Удалите супернатант до тех пор, пока не останется 20 микролитров раствора, и добавьте шаблон повторного использования раствора, чтобы он составил объем 100 микролитров.Затем вихрь в течение 30 секунд и кратковременно центрифугировать в течение двух секунд. Переходим к следующему этапу в течение 12 часов после обработки образца Загрузите 100 микролитров разбавленной библиотеки, 130 микролитров бусин С1, 300 микролитров трех растворов для промывки шаблонов x и 300 микролитров расплава раствора на восемь полос скважины. Установите восемь полос колодца на модуль обогащения, загрузите наконечник для дозирования и установите трубку центрифуги мощностью 200 микролитров в положение сбора.Нажмите кнопку Пуск, чтобы запустить программу. Пипетка 55 микролитров образца раствора и впрыскивание его в отверстие образца чипа. Установите чип на центрифугу.Держите выемку снаружи и портал образца внутри. Затем сбалансируйте его с помощью другого использованного чипа и центрифуги в течение 10 минут. Подготовьте загрузочный раствор, как описано в тексте рукописи.Вдуйте 100 микролитров воздуха в пенящийся раствор. Пипетку раствором многократно до тех пор, пока пузырьки не придут в плотное, вспенивающееся состояние и сохраняйте объем пены примерно до 250 микролитров. Поместите чип на скамейку после центрифуги.Введите 100 микролитров пены в отверстие для образца и удалите экструдированный раствор в наружный портал. Затем центрифугируйте чип ненадолго в течение 30 секунд. Повторите этот процесс один раз.Дважды вводят 100 микролитров в 50% промывочный буфер и удаляют экструдированный раствор в наружный портал после каждой инъекции. Затем вводят 100 микролитров в 50% буфер отжига три раза и удаляют экструдированный раствор в наружный портал после каждой инъекции. Вводят 65 микролитров в 50% буфер реакции ферментов, избегая пузырьков и удаляя экструдированный раствор в наружном портале.Стабилизируйте загруженный чип при комнатной температуре в течение пяти минут и установите чип на портал чипа секвенсора. Выберите Запланированную программу, проверьте информацию и запустите запуск. Репрезентативный прогон получил в общей сложности 17,6 гигабайт данных, а общая скорость загрузки частицы ионной сферы составила 88% в общих скважинах чипа.Тепловая карта подтвердила даже загрузку образцов на общую площадь чипа. 77% от общего числа прочитанных материалов были пригодны для использования. Все скважины, загруженные ISP, показали 100% обогащение шаблонов, в которых 78% были клональными.Из всех клональных шаблонов 97% были квалифицированы как окончательная библиотека. Средняя длина считывания составила 177 пар оснований, в то время как медиана и режим составили 176 и 174 пары оснований соответственно. Пиковое количество тимина, цитозина и аденина в шаблонах составило примерно 76 по сравнению с квалифицированной линией отсечения 50.Во всех адресуемых скважинах с живыми интернет-провайдерами 99,5% квалифицировались как построенная библиотека и 20% поликлональных и низкокачественных библиотек были отфильтрованы, в то время как 76,6% интернет-провайдеров были квалифицированы для дальнейшего анализа. Результат дисперсии числа копий от одного образца изобразил мозаичную трисомию пар мегабаз 182,16 от P 16,3 до Q 35,2 на хромосоме четыре и 33 точечных 13 пара мегабазовых пар моносомного сегмента от Q 11,1 до Q 13,33 на хромосоме 22. При выполнении отбора фрагментов временные интервалы между этапами должны быть изменены в соответствии с размером образцов в одной и той же партии, чтобы предотвратить чрезмерное и отсутствие экспозиции для образцов переднего и заднего торцев.

Research

JoVE Journal

Genetics

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Оценка загрязнения ДНК в образцах РНК, основанный на рибосомной ДНК

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Оптимизация и сравнительный анализ методов обогащения органической ДНК растений, подходящих для последующей последовательности следующего поколения

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Высокая пропускная способность на основе последовательности техника для выявления поздно репликации областей генома

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Секвенирование нового поколения и биоинформатики трубопровода для оценки генетических детерминант конституционных болезни

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Усиление возле полнометражного ВИЧ-1 Proviruses для виртуализации нового поколения

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Генная инженерия сапротрофные discoideum клетки на основе выбора и роста бактерий

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Полупроводниковое секвенирование для предимплантационного генетического тестирования на анеуплоидию

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Масса на основе спектрометрии протеомики анализа с использованием базы данных OpenProt откроет новые белки перевод с неканоническим открытом чтения фреймов

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

РНК секвенирования следующего поколения и трубопровод биоинформатики для идентификации выраженных линий-1S на уровне Локус

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...