Name: pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform
Uploaded: 2022-08-17T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

Vi vill tacka Dr. Zhangyong Ming och Mr. Rongji Hou för deras råd om LIMS utökade ansökan. Denna studie stöds av PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) och Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).

Alla protokoll och trophectoderm (TE) biopsi (1.1.1.1 avsnitt) som tillämpas i denna studie granskades och godkändes av den mänskliga forskningsetiska kommittén för nr 924 sjukhus den 18 september 2017 (NR: PLA924-2017-59). Patienterna/deltagarna gav sitt skriftliga informerade samtycke till att delta i denna studie.
1. DNA-isolering från human embryobiopsi och helgenomisk förstärkning
<ol><li>Protokoll för förstärkning av hela genomet <sup...

<ol>
	<li>Driscoll, D. A., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Hong, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+aneuploidy+rates+are+equivalent+in+natural+cycles+and+gonadotropin-stimulated+cycles.">Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles.</a> Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).</li><li>Adams, D. R., Eng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+to+diagnose+suspected+genetic+disorders.">Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).</li><li>Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+ion+torrent+semiconductor+chip+based+sequencing.">Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing.</a> Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).</li><li>Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-implantation+genetic+screening+techniques:+Implications+for+clinical+prenatal+diagnosis.">Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis.</a> Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).</li><li>Dilliott, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+next-generation+sequencing+and+bioinformatics+pipeline+to+evaluate+genetic+determinants+of+constitutional+disease.">Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).</li><li>Ion ReproSeq&#8482; PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf</a> (2017)</li><li>PicoPLEX&#174; Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf">https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf</a> (2019)</li><li>. Qubit&#174; 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf</a> (2014)</li><li>Ion AmpliSeq&#8482; DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf</a> (2019)</li><li>Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf</a> (2015)</li><li>Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html">https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html</a> (2017)</li><li>Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Bayesian+inference+of+copy+number+variants+using+Hidden+Markov+models+with+wavelet+compression.">Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression.</a> PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).</li><li>Rubio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-implantation+genetic+screening+using+fluorescence+in+situ+hybridization+in+patients+with+repetitive+implantation+failure+and+advanced+maternal+age:+two+randomized+trials.">Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials.</a> Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).</li><li>Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+screening+(PGS)+still+in+search+of+a+clinical+application:+a+systematic+review.">Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).</li><li>Bono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+semiconductor+next-generation+sequencing-based+protocol+for+pre-implantation+genetic+diagnosis+of+reciprocal+translocations.">Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations.</a> Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).</li><li>Handyside, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=24-chromosome+copy+number+analysis:+a+comparison+of+available+technologies.">24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).</li><li>Wells, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utilisation+of+a+rapid+low-pass+whole+genome+sequencing+technique+for+the+diagnosis+of+aneuploidy+in+human+embryos+prior+to+implantation.">Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).</li><li>El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequence+assembly:+Four+stages+of+data+processing+and+computational+challenges.">Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges.</a> PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).</li><li>Jennings, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+validation+of+next-generation+sequencing-based+oncology+panels:+A+joint+consensus+recommendation+of+the+Association+for+Molecular+Pathology+and+College+of+American+Pathologists.">Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists.</a> The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).</li><li>de Bourcy, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+comparison+of+single-cell+whole+genome+amplification+methods.">A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods.</a> PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).</li><li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+next-generation+sequencing+technology+for+comprehensive+aneuploidy+screening+of+blastocysts+in+clinical+pre-implantation+genetic+screening+cycles.">Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles.</a> Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).</li><li>Damerla, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Torrent+sequencing+for+conducting+genome-wide+scans+for+mutation+mapping+analysis.">Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis.</a> Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).</li><li>Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+testing+for+aneuploidy:+what+technology+should+you+use+and+what+are+the+differences.">Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).</li><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+improving+access+to+variant+interpretations+and+supporting+evidence.">ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence.</a> Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).</li><li>Genomes Project, C, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+reference+for+human+genetic+variation.">A global reference for human genetic variation.</a> Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).</li><li>McKusick, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+inheritance+in+man+and+its+online+version,+OMIM.">Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM.</a> American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).</li><li>Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANNOVAR:+functional+annotation+of+genetic+variants+from+high-throughput+sequencing+data.">ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).</li><li>Zhao, M., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNVannotator:+A+comprehensive+annotation+server+for+copy+number+variation+in+the+human+genome.">CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome.</a> PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+next-generation+sequencing+in+pre-implantation+genetic+diagnosis+cycles+for+Robertsonian+and+reciprocal+translocations.">Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+allele+with+resolved+carrier+status+of+Robertsonian+and+reciprocal+translocation+in+human+pre-implantation+embryos.">Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).</li></ol>

Kromosomal aneuploidi hos embryon är orsaken till en stor del av graviditetsförlusten, oavsett om den är tänkt naturligt eller in vitro-befruktning (IVF). I klinisk praxis för IVF föreslås att screening av embryot aneuploidi och överföring av euploidiembryot kan förbättra resultatet av IVF. Fluorescens in situ hybridisering är den tidigaste tekniken som antagits för könsselektion och PGT-A; Denna teknik kräver dock mer teknisk expertis från laboratoriepersonal och är relativt arbetsinte...

Aneuploidi är abnormiteten i antalet kromosomer genom närvaron av en eller flera extra kromosomer eller frånvaron av en eller flera kromosomer. Embryon som bär någon typ av aneuploidi, såsom förlust av en X-kromosom (Turners syndrom), extra kopior av autosomer, som trisomier av autosom 21 (Downs syndrom), 13 (Patau syndrom) och 18 (Edwards syndrom) eller extra könskromosomer som 47, XXY (Klinefelters syndrom) och 47, XXX (Triple X syndrom), kan överleva till termin med fosterskador1. Aneuploidi är den främsta orsaken till missfall i första trimestern och provrörsbefruktning (IVF) misslyckande2. Det rapporteras att aneuploidihastigheten kan variera från 25,4% -84,5% genom de olika åldersskikten i den naturliga cykeln och den medicinska kontrollgruppen i IVF-övning3.
Nästa generations sekvenseringsteknik blir vilt tillämpad vid bestämning av genetisk information kliniskt; Det ger praktisk tillgång till genomsekvens med effektivitet och hög genomströmning. Särskilt nästa generations sekvensering revolutionerade också diagnosen störningar med genetiska faktorer och tester för abnormitet i genomet4. Med hjälp av halvledarsekvenseringsteknik för att direkt överföra kemiska signaler vid sekvensering av bioreaktion till digitala data, ger det halvledarbaserade sekvenssystemet en direkt realtidsdetektering för sekvensdata i 3-7 h 5,6.
I ett IVF-förfarande undersöker preimplantatorisk genetisk testning (PGT) embryots genetiska profil innan det överförs till livmodern för att förbättra IVF-resultatet och minska risken för genetiska störningar hos nyfödda 1,7. I PGT i kombination med NGS-tekniker förstärks genetiskt material extraherat från mindre än 10 celler med helgenomförstärkningssatser eller ett oberoende utvecklat helgenomförstärkningsreagens. Detta kräver bara ett steg i förstärkningsfasen och kräver inte förförstärkning för att erhålla helgenomförstärkningsprodukter. Primers eller paneler för copy number variant och speciell gene loci sekvensering designas och tillämpas i det bibliotek som konstruerats.
Ett typiskt arbetsflöde för preimplantatorisk genetisk testning-aneuploidi (PGT-A) i NGS involverar seriella procedurer och kräver en intensiv arbetsbelastning av laboratoriepersonal8. Vissa feloperationer orsakade proceduråterställning kan leda till oönskad förlust av både tid och resurser för labbet. En kortfattad och tydlig standardprocedur (SOP) för PGS-NGS-arbetsflöde är till hjälp; Word-formatprotokoll kan dock inte presentera mer detaljerad information om provbearbetning, enhetsmanipulation och instrumentinställningar, som kan visualiseras i ett videoprotokoll. I den här artikeln kan ett validerat arbetsflöde i kombination med en visualiserad demonstration av driftsdetaljer erbjuda mer direkta och intuitiva hänvisningsprotokoll i PGT-praxis på en halvledarsekvenseringsplattform.
Protokollet beskriver här en metod som stöder batchning av upp till 16 embryobiopsier parallellt. För större satser rekommenderas att man använder ett kommersiellt kitbaserat protokoll för halvledarsekvensering, till exempel Reproes-PGS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Syringe Filter Unit</td>
			<td>Merkmillipore</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mLDNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anstart Tap DNA Polymerase</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis buffer</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM &#946;-glycerophosphate, 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinVar</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA elution buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1016L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>P031-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Independently developed whole genome amplification reagents</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>The reagents consist of the following components: 
			1. Cell Lysis 
			2. Amplification Pre-mixed solution 
			&#160;&#160;&#160; 1) Primer WGA-P2 (10 &#956;M) 
			&#160;&#160;&#160; 2) dNTP (10 mM) 
			&#160;&#160;&#160; 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 
			3. Amplification Enzyme 
			&#160;&#160;&#160; 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/&#956;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26434</td>
			<td>Kit mentioned in step 4.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4476610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Server System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4487118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Preparation Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>114</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo WGA-P2</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN 
			NNNNATGTGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTouch 2 System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4474779</td>
			<td>&#160;Template amplification and enrichment system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Kit</td>
			<td>Takara Bio USA</td>
			<td>R300671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Quality Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Mini Centrifuge LX-300</td>
			<td>Qilinbeier</td>
			<td>E0122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer server system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Torrent Suite Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Reactions Universal Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>113</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html 
			This kit contains the following components: 
			1. Template Preparation Kit Set 
			 
			1.1 Template Preparation Kit: 
			Emulsion PCR buffer 
			Emulsion PCR enzyme mix 
			Template carrier solution 
			 
			1.2 Template Preparation solutions: 
			Template preparation reaction oil I 
			emulsifier breaking solution II 
			Template Preparation Reaction Oil II 
			Nuclease-free water 
			Tween solution 
			Demulsification solution I 
			Template washing solution 
			C1 bead washing solution 
			C1 bead resuspension solution 
			Template resuspension solution 
			 
			1.3 Template Preparation Materials: 
			Reagent tube I 
			connector 
			Collection tube 
			Reagent tube pipette I 
			Amplification plate 
			8 wells strip 
			Dedicated tips 
			Template preparation washing adapter 
			Template preparation filter 
			 
			2. Sequencing Kit Set 
			 
			2.1 Sequencing Kit: 
			dGTP 
			dCTP 
			dATP 
			dTTP 
			Sequencing enzyme solution 
			Sequencing primers 
			Quality control templates 
			 
			2.2&#160; Sequencing Solutions: 
			Sequencing solution II 
			Sequencing solution IIII 
			Annealing buffer 
			Loading buffer 
			Foaming agent 
			Chlorine tablets 
			C1 bead 
			 
			2.3 Sequencing Materials: 
			Reagent Tube II 
			Reagent tube cap 
			Reagent tube sipper&#160; II 
			Reagent bottle sipper 
			Reagent bottles 
			 
			3. Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform

Nästa generations sekvensering har fått allt större betydelse i den kliniska tillämpningen vid bestämning av genetiska varianter. I det preimplantatoriska genetiska testet har denna teknik sina unika fördelar i skalbarhet, genomströmning och kostnad. För det preimplantationsgenetiska testet för aneuploidianalys ger det halvledarbaserade nästa generations sekvenseringssystemet (NGS) som presenteras här ett omfattande tillvägagångssätt för att bestämma strukturella genetiska varianter med en minsta upplösning på 8 Mb. Från provförvärv till slutrapport kräver arbetsprocessen flera steg med nära efterlevnad av protokoll. Eftersom olika kritiska steg kan avgöra resultatet av förstärkning, bibliotekets kvalitet, täckning av läsningar och utmatning av data, kan beskrivande information med annan visuell demonstration än ord ge mer detaljer till operationen och manipulationen, vilket kan ha stor inverkan på resultaten av alla kritiska steg. Metoderna som presenteras häri kommer att visa de procedurer som är involverade i helgenomförstärkning (WGA) av biopsierade Trophectoderm (TE) -celler, genomisk bibliotekskonstruktion, sequencerhantering och slutligen generera kopieringsnummervarianters rapporter.

När sekvensplanen avslutas efter körningsprocessen i maskinen rapporterar sekvensserversystemet sammanfattningen med beskrivande information om genererade data, chipstatus, ISP-laddningshastighet och bibliotekskvalitet, som visas i figur 2. I denna resultatdemonstration erhölls 17,6 G-data i den totala basen och den totala laddningshastigheten för ISP var 88% i chipets totala brunnar; värmekartan visade att provet var jämnt belastat på chipets totala yta (figur 2A...

Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

Protokollet presenterar de övergripande procedurerna i labbet som krävs vid genetisk testning före implantation för aneuploidi på en halvledarbaserad nästa generations sekvenseringsplattform. Här presenterar vi de detaljerade stegen för helgenomförstärkning, DNA-fragmentval, bibliotekskonstruktion, mallberedning och sekvensering av arbetsflöde med representativa resultat.

Preimplantation genetisk testning för aneuploidi på en halvledarbaserad nästa generations sekvenseringsplattform

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...

Detta protokoll presenterar proceduren från encellsförstärkning till slutrapporteringsdata i den preimplantationsgenetiska testningen för aneuploidi på en halvledarbaserad nästa generations sekvenseringsplattform. Denna procedur kan hjälpa tittarna att få en god förståelse för det experimentella arbetsflödet för PGT-A-sekvensering och replikera denna teknik i ett diagnostiskt laboratorium med en halvledarbaserad NGS-plattform. Börja med att pipettera 25 mikroliter av hela genomförstärkningsprodukterna och överföra dem till ett 1,5 ml centrifugrör förinstallerat med 25 mikroliter nukleasfritt vatten.Vortex och blanda DNA-reningspärlorna. Alikvotera 50 mikroliter av denna lösning i varje provrör. Vortex och centrifugera kort i fem sekunder.Ställ in röret i fem minuter vid rumstemperatur för DNA-bindningsprocessen. Sätt i 1,5 ml centrifugröret i ett magnetiskt ställ. Vänta sedan tills alla magnetiska pärlor lockas till rörets sidovägg.Överför försiktigt supernatanten till ett nytt 1,5 ml centrifugrör. Undvik att pipettera ut pärlorna. Enligt den ursprungliga provvolymen.Pipettera 30 mikroliter magnetiska pärlor, virvel och centrifug kort i fem sekunder. Ställ in röret i fem minuter vid rumstemperatur för DNA-bindningsprocessen. Sätt i centrifugrören på 1,5 millimeter i magnetstället.Vänta sedan tills alla magnetiska pärlor lockas till rörets sidovägg. Ta försiktigt bort och kassera supernatanten. Undvik att pipettera ut pärlorna.Pipettera 300 mikroliter 70% etanol i 1,5 ml centrifugröret. Rotera sedan röret försiktigt två gånger i 180 graders vinkel och flytta pärlorna längs rörväggen för en noggrann tvätt. Pipettera och kassera supernatanten.Undvik att pipettera ut pärlorna. Upprepa tvättproceduren en gång. Placera en ny förstärkningsplatta i systemet när rengöringsprogrammet är klart.Sätt i uppsamlingsrören, var och en förfylld med 150 mikroliter brytlösning två i rotorn, placera sedan bron på uppsamlingsrören. Tillsätt reaktionsoljan till hälften av röret och emulgeringslösningen till en tredjedel av röret. Placera ett nytt filter för mallberedning på ett rörställ med provportalen placerad uppåt.Vortex lösningen i fem sekunder och centrifugera kort i fem sekunder. Överför sedan lösningen till filterets provportal efter pipettering av 800 mikroliter tre gånger. Centrifugera röret för att minska bubblorna före den sista injektionen.Undvik att injicera luft i filtret. Injicera 200 mikroliter reaktionsolja två, efter den blandade lösningen. Vrid filterets provportal nedåt och byt ut tvättanpassningen med filtret.För in provnålen i rotorlockets mitthål och tryck sedan nålen mot botten. Klicka på knappen Kör på skärmen och välj programmet enligt motsvarande kit. Välj sedan Assisterad för att kontrollera alla steg.Klicka på Nästa tills körningen startas. Körningen tar cirka 4,5 timmar att slutföra. Välj Nästa när programmet är klart.Systemet startar en 10-minuters centrifugeringsprocess. Efter centrifugering klickar du på knappen Öppna locket och flyttar uppsamlingsrören till rack. Om proceduren inte går vidare till nästa steg på 15 minuter, tryck på den sista snurrningen för att centrifugera igen.Ta bort supernatanten i uppsamlingsröret och lämna 100 mikroliter lösning i röret. Blanda det återstående provet genom pipettering och överför provet till det nya 1,5 ml centrifugröret märkt OT. När du pipetterar supernatanten, undvik att röra rörets botten längs sidorna. Pipettera 100 mikroliter nukleasfritt vatten i varje uppsamlingsrör och överför lösningen till OT-röret tvättat genom upprepad pipettering.Tillsätt 600 mikroliter nukleasfritt vatten till OT-röret för att kompensera den totala volymen på en milliliter. Vortex i 30 sekunder i centrifug vid 15 500 gånger G i åtta minuter. Ta försiktigt bort supernatanten och lämna 100 mikroliter lösning i OT-röret.Använd spetsen för att kasta oljeskiktet helt. Tillsätt 900 mikroliter nukleasfritt vatten, virvel i 30 sekunder och centrifugera vid 15 500 gånger G i åtta minuter. Ta bort supernatanten tills 20 mikroliter av lösningen återstår och lägg till mallens återsuspenderande lösning för att kompensera volymen på 100 mikroliter.Virvla sedan i 30 sekunder och centrifugera kort i två sekunder. Fortsätt till nästa steg inom 12 timmar efter provbearbetning Ladda 100 mikroliter av det utspädda biblioteket, 130 mikroliter C1-pärlor, 300 mikroliter tre x malltvättlösning och 300 mikroliter smältlösning till de åtta brunnsremsorna. Montera de åtta brunnsremsorna på anrikningsmodulen, ladda pipettspetsen och ställ in centrifugröret på 200 mikroliter i uppsamlingsläget.Klicka på Start för att köra programmet. Pipettera 55 mikroliter av provlösningen och injicera den i chipets provhål. Ställ in chipet på centrifugen.Håll skåran mot utsidan och exempelportalen inuti. Balansera sedan det med ett annat använt chip och centrifugera i 10 minuter. Förbered laddningslösningen enligt beskrivningen i textmanuskriptet.Blås 100 mikroliter luft i skumlösningen. Pipettera lösningen upprepade gånger tills bubblorna är i ett tätt, skummande tillstånd och håll skumvolymen till cirka 250 mikroliter. Placera chipet på bänken efter centrifug.Injicera 100 mikroliter skum i provhålet och ta bort den extruderade lösningen i utportalen. Centrifugera sedan chipet kort i 30 sekunder. Upprepa denna process en gång.Injicera 100 mikroliter vid 50% tvättbuffert två gånger och ta bort den extruderade lösningen i utportalen efter varje injektion. Injicera sedan 100 mikroliter vid 50% glödgningsbuffert tre gånger och ta bort den extruderade lösningen i utportalen efter varje injektion. Injicera 65 mikroliter vid 50% enzymreaktionsbuffert, undvik bubblor och ta bort den extruderade lösningen i utportalen.Stabilisera det laddade chipet vid rumstemperatur i fem minuter och installera chipet på sequencerchipportalen. Välj det planerade programmet kontrollera informationen och starta körningen. Den representativa körningen erhöll totalt 17,6 gigabyte data och den totala laddningshastigheten för jonsfärpartikeln var 88% i chipets totala brunnar.Värmekartan bekräftade jämn provbelastning på den totala spånytan. 77% av de totala läsningarna var användbara. Alla brunnar laddade med ISP visade 100% mallberikning där 78% var klonala.Av alla klonala mallar kvalificerades 97% som det slutliga biblioteket. Den genomsnittliga längden på avläsningen var 177 baspar medan medianen och läget var 176 respektive 174 baspar. Toppantalet tymin, cytosin och adenin i mallarna var cirka 76 över den kvalificerade cutoff-linjen på 50.I alla adresserbara brunnar med live-internetleverantörer kvalificerades 99,5 % som det konstruerade biblioteket och 20 % av biblioteken av polyklonal och låg kvalitet filtrerades bort medan 76,6 % av internetleverantörerna var kvalificerade för vidare analys. Resultatet av kopieringsnummervariansen från ett enda prov visade en mosaiktrisomi på 182,16 megabaspar av P 16,3 till Q 35,2 på kromosom fyra och ett 33-punkts 13 megabaspar monosomisegment av Q 11,1 till Q 13,33 på kromosom 22. Vid fragmenturval bör tidsintervallen mellan stegen ändras beroende på storleken på proverna i samma sats för att förhindra över- och bristande exponering för prover fram och bak.

Research

JoVE Journal

Genetics

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Bedömning av DNA kontaminering i RNA-prover baserat på Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimering och jämförande analys av organellära DNA-berikningsmetoder lämpliga för nästa generations sekvensering

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: En hög genomströmning sekvensering-baserad teknik för att identifiera sent replikera regioner i genomet

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Riktade nästa generations sekvensering och bioinformatik Pipeline för att utvärdera genetiska determinanter av konstitutionella sjukdom

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Förstärkning av nära fullängds HIV-1 Proviruses för nästa generations sekvensering

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genteknik Dictyostelium discoideum celler baserat på urval och tillväxt på bakterier

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Halvledar sekvensering för preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidi

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Mass Spectrometry-baserad proteomik analyser med hjälp av databasen OpenProt att avslöja nya proteiner översatt från icke-kanoniska öppen läsning ramar

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

RNA nästa generations sekvensering och en bioinformatik pipeline för att identifiera uttryckta LINE-1s på Locus-specifik nivå

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...