Name: pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform
Uploaded: 2022-08-17T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

Dr. Zhangyong Ming ve Bay Rongji Hou'ya LIMS genişletilmiş uygulaması hakkındaki tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma PLA Aile Planlaması Özel Araştırma Projeleri (17JS008, 20JSZ08), Guangxi Anahtar Metabolik Hastalıklar Araştırma Laboratuvarı Fonu (No.20-065-76) ve Guangzhou Vatandaş Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Araştırma Projesi (201803010034) tarafından desteklenmektedir.

Bu çalışmada uygulanan tüm protokoller ve trofektoderm (TE) biyopsisi (1.1.1.1 bölümü) 18 Eylül 2017 tarihinde 924 No'lu hastanenin insan araştırmaları etik kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (NO: PLA924-2017-59). Hastalar/katılımcılar bu çalışmaya katılmak için yazılı bilgilendirilmiş onamlarını vermişlerdir.
1. İnsan embriyo biyopsisinden DNA izolasyonu ve tüm genomik amplifikasyon
<ol><li>Tüm genom amplifikasyonu için ...

<ol>
	<li>Driscoll, D. A., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Hong, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+aneuploidy+rates+are+equivalent+in+natural+cycles+and+gonadotropin-stimulated+cycles.">Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles.</a> Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).</li><li>Adams, D. R., Eng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+to+diagnose+suspected+genetic+disorders.">Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).</li><li>Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+ion+torrent+semiconductor+chip+based+sequencing.">Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing.</a> Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).</li><li>Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-implantation+genetic+screening+techniques:+Implications+for+clinical+prenatal+diagnosis.">Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis.</a> Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).</li><li>Dilliott, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+next-generation+sequencing+and+bioinformatics+pipeline+to+evaluate+genetic+determinants+of+constitutional+disease.">Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).</li><li>Ion ReproSeq&#8482; PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf</a> (2017)</li><li>PicoPLEX&#174; Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf">https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf</a> (2019)</li><li>. Qubit&#174; 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf</a> (2014)</li><li>Ion AmpliSeq&#8482; DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf</a> (2019)</li><li>Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf</a> (2015)</li><li>Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html">https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html</a> (2017)</li><li>Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Bayesian+inference+of+copy+number+variants+using+Hidden+Markov+models+with+wavelet+compression.">Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression.</a> PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).</li><li>Rubio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-implantation+genetic+screening+using+fluorescence+in+situ+hybridization+in+patients+with+repetitive+implantation+failure+and+advanced+maternal+age:+two+randomized+trials.">Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials.</a> Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).</li><li>Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+screening+(PGS)+still+in+search+of+a+clinical+application:+a+systematic+review.">Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).</li><li>Bono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+semiconductor+next-generation+sequencing-based+protocol+for+pre-implantation+genetic+diagnosis+of+reciprocal+translocations.">Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations.</a> Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).</li><li>Handyside, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=24-chromosome+copy+number+analysis:+a+comparison+of+available+technologies.">24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).</li><li>Wells, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utilisation+of+a+rapid+low-pass+whole+genome+sequencing+technique+for+the+diagnosis+of+aneuploidy+in+human+embryos+prior+to+implantation.">Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).</li><li>El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequence+assembly:+Four+stages+of+data+processing+and+computational+challenges.">Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges.</a> PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).</li><li>Jennings, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+validation+of+next-generation+sequencing-based+oncology+panels:+A+joint+consensus+recommendation+of+the+Association+for+Molecular+Pathology+and+College+of+American+Pathologists.">Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists.</a> The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).</li><li>de Bourcy, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+comparison+of+single-cell+whole+genome+amplification+methods.">A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods.</a> PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).</li><li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+next-generation+sequencing+technology+for+comprehensive+aneuploidy+screening+of+blastocysts+in+clinical+pre-implantation+genetic+screening+cycles.">Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles.</a> Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).</li><li>Damerla, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Torrent+sequencing+for+conducting+genome-wide+scans+for+mutation+mapping+analysis.">Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis.</a> Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).</li><li>Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+testing+for+aneuploidy:+what+technology+should+you+use+and+what+are+the+differences.">Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).</li><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+improving+access+to+variant+interpretations+and+supporting+evidence.">ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence.</a> Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).</li><li>Genomes Project, C, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+reference+for+human+genetic+variation.">A global reference for human genetic variation.</a> Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).</li><li>McKusick, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+inheritance+in+man+and+its+online+version,+OMIM.">Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM.</a> American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).</li><li>Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANNOVAR:+functional+annotation+of+genetic+variants+from+high-throughput+sequencing+data.">ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).</li><li>Zhao, M., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNVannotator:+A+comprehensive+annotation+server+for+copy+number+variation+in+the+human+genome.">CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome.</a> PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+next-generation+sequencing+in+pre-implantation+genetic+diagnosis+cycles+for+Robertsonian+and+reciprocal+translocations.">Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+allele+with+resolved+carrier+status+of+Robertsonian+and+reciprocal+translocation+in+human+pre-implantation+embryos.">Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).</li></ol>

Embriyoların kromozomal anöploidisi, doğal olarak veya in vitro fertilizasyon (IVF) olarak gebe kalmış olsun, gebelik kaybının büyük bir kısmının nedenidir. IVF'nin klinik pratiğinde, embriyo anöploidisinin taranması ve öploidi embriyosunun transferinin IVF'nin sonucunu iyileştirebileceği önerilmektedir. Floresan in situ hibridizasyon, cinsiyet seçimi ve PGT-A için benimsenen en eski tekniktir; Bununla birlikte, bu teknik laboratuvar personelinden daha fazla teknik uzmanlık gerekti...

Anöploidi, bir veya daha fazla ekstra kromozomun varlığı veya bir veya daha fazla kromozomun yokluğu ile kromozom sayısındaki anormalliktir. Bir X kromozomunun kaybı (Turner sendromu), otozom 21 (Down sendromu), 13 (Patau sendromu) ve 18 (Edwards sendromu) trizomileri gibi otozomların ekstra kopyaları veya 47, XXY (Klinefelter sendromu) ve 47, XXX (Triple X sendromu) gibi ekstra cinsiyet kromozomları gibi bir tür anöploidi taşıyan embriyolar, doğum kusurları1 ile terim olarak hayatta kalabilir. Anöploidi, ilk trimester düşüklerinin ve in vitro fertilizasyon (IVF) başarısızlığının birincil nedenidir2. IVF pratiğinde anöploidi oranının doğal siklus ve ilaçlı kontrol grubunun farklı yaş katmanları boyunca %25.4-%84.5 arasında değişebileceği bildirilmektedir3.
Yeni nesil dizileme teknolojisi, genetik bilginin klinik olarak belirlenmesinde çılgınca uygulanmaktadır; verimlilik ve yüksek verim ile genom dizisine pratik erişim sağlar. Özellikle, yeni nesil dizileme, genetik faktörlere sahip bozuklukların teşhisinde ve genomdaki anormallik testlerinde de devrim yarattı4. Biyo-reaksiyon dizilemedeki kimyasal sinyalleri doğrudan dijital verilere aktarmak için yarı iletken dizileme teknolojisini kullanan yarı iletken tabanlı dizileme sistemi, verileri 3-7 saat 5,6'da sıralamak için doğrudan, gerçek zamanlı bir algılama sağlar.
Bir IVF prosedüründe, implantasyon öncesi genetik test (PGT), IVF sonucunu iyileştirmek ve yenidoğanlarda genetik bozukluk riskini azaltmak için uterusa transfer edilmeden önce embriyonun genetik profilini araştırır 1,7. PGT'de NGS teknikleri ile kombine edildiğinde, 10'dan az hücreden ekstrakte edilen genetik materyal, tüm genom amplifikasyon kitleri veya bağımsız olarak geliştirilmiş bir bütün genom amplifikasyon reaktifi ile çoğaltılır. Bu, amplifikasyon aşamasında sadece bir adım gerektirir ve tüm genom amplifikasyon ürünlerini elde etmek için ön amplifikasyon gerektirmez. Kopya numarası varyantı ve özel gen lokus dizilimi için astarlar veya paneller tasarlanmış ve oluşturulan kütüphanede uygulanmıştır.
NGS'de implantasyon öncesi genetik test-anöploidi (PGT-A) tipik bir iş akışı seri prosedürleri içerir ve laboratuvar personelinin yoğun bir iş yükünü gerektirir8. Prosedürün geri alınmasına neden olan bazı yanlış işlemler, laboratuvarın hem zamanının hem de kaynaklarının istenmeyen şekilde kaybedilmesine neden olabilir. PGS-NGS iş akışı için kısa ve net bir standart çalışma prosedürü (SOP) yararlıdır; ancak, sözcük biçimindeki protokoller, bir video protokolünde görselleştirilebilen örnek işleme, cihaz manipülasyonu ve enstrümanların ayarları hakkında daha ayrıntılı bilgi sunamaz. Bu makalede, çalışma detayının görselleştirilmiş bir gösterimi ile birleştirilmiş doğrulanmış bir iş akışı, yarı iletken bir sıralama platformunda PGT uygulamasında daha doğrudan ve sezgisel yönlendirme protokolleri sunabilir.
Buradaki protokol, paralel olarak 16 embriyo biyopsisine kadar parti yapılmasını destekleyen bir yöntemi açıklamaktadır. Daha büyük partiler için, Reproes-PGS gibi yarı iletken dizileme için ticari kit tabanlı bir protokol kullanılması önerilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Syringe Filter Unit</td>
			<td>Merkmillipore</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mLDNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anstart Tap DNA Polymerase</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis buffer</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM &#946;-glycerophosphate, 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinVar</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA elution buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1016L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>P031-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Independently developed whole genome amplification reagents</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>The reagents consist of the following components: 
			1. Cell Lysis 
			2. Amplification Pre-mixed solution 
			&#160;&#160;&#160; 1) Primer WGA-P2 (10 &#956;M) 
			&#160;&#160;&#160; 2) dNTP (10 mM) 
			&#160;&#160;&#160; 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 
			3. Amplification Enzyme 
			&#160;&#160;&#160; 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/&#956;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26434</td>
			<td>Kit mentioned in step 4.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4476610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Server System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4487118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Preparation Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>114</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo WGA-P2</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN 
			NNNNATGTGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTouch 2 System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4474779</td>
			<td>&#160;Template amplification and enrichment system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Kit</td>
			<td>Takara Bio USA</td>
			<td>R300671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Quality Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Mini Centrifuge LX-300</td>
			<td>Qilinbeier</td>
			<td>E0122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer server system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Torrent Suite Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Reactions Universal Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>113</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html 
			This kit contains the following components: 
			1. Template Preparation Kit Set 
			 
			1.1 Template Preparation Kit: 
			Emulsion PCR buffer 
			Emulsion PCR enzyme mix 
			Template carrier solution 
			 
			1.2 Template Preparation solutions: 
			Template preparation reaction oil I 
			emulsifier breaking solution II 
			Template Preparation Reaction Oil II 
			Nuclease-free water 
			Tween solution 
			Demulsification solution I 
			Template washing solution 
			C1 bead washing solution 
			C1 bead resuspension solution 
			Template resuspension solution 
			 
			1.3 Template Preparation Materials: 
			Reagent tube I 
			connector 
			Collection tube 
			Reagent tube pipette I 
			Amplification plate 
			8 wells strip 
			Dedicated tips 
			Template preparation washing adapter 
			Template preparation filter 
			 
			2. Sequencing Kit Set 
			 
			2.1 Sequencing Kit: 
			dGTP 
			dCTP 
			dATP 
			dTTP 
			Sequencing enzyme solution 
			Sequencing primers 
			Quality control templates 
			 
			2.2&#160; Sequencing Solutions: 
			Sequencing solution II 
			Sequencing solution IIII 
			Annealing buffer 
			Loading buffer 
			Foaming agent 
			Chlorine tablets 
			C1 bead 
			 
			2.3 Sequencing Materials: 
			Reagent Tube II 
			Reagent tube cap 
			Reagent tube sipper&#160; II 
			Reagent bottle sipper 
			Reagent bottles 
			 
			3. Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform

Yeni nesil dizileme, genetik varyantların belirlenmesinde klinik uygulamada giderek daha fazla önem kazanmıştır. İmplantasyon öncesi genetik testte, bu tekniğin ölçeklenebilirlik, verim ve maliyet açısından benzersiz avantajları vardır. Anöploidi analizi için implantasyon öncesi genetik test için, burada sunulan yarı iletken tabanlı yeni nesil dizileme (NGS) sistemi, yapısal genetik varyantları minimum 8 Mb çözünürlükte belirlemek için kapsamlı bir yaklaşım sunmaktadır. Örnek alımından nihai rapora kadar, çalışma süreci protokollere sıkı sıkıya bağlı kalarak birden fazla adım gerektirir. Çeşitli kritik adımlar amplifikasyonun sonucunu, kütüphanenin kalitesini, okumaların kapsamını ve verilerin çıktısını belirleyebildiğinden, kelimeler dışında görsel gösterim içeren açıklayıcı bilgiler, tüm kritik adımların sonuçları üzerinde büyük bir etkisi olabilecek işlem ve manipülasyon için daha fazla ayrıntı sunabilir. Burada sunulan yöntemler, biyopsi yapılan Trofektoderm (TE) hücrelerinin tüm genom amplifikasyonunda (WGA), genomik kütüphane yapımında, sıralayıcı yönetiminde ve son olarak kopya numarası varyantlarının raporlarının oluşturulmasında yer alan prosedürleri gösterecektir.

Makinede çalıştırma işleminden sonra dizi planı sona erdiğinde, dizi sunucusu sistemi, Şekil 2'de gösterildiği gibi, oluşturulan verilerin, çip durumunun, ISS yükleme hızının ve kitaplık kalitesinin açıklayıcı bilgileriyle özeti raporlar. Bu sonuç gösteriminde, toplam bazda 17.6 G veri elde edildi ve çipin toplam kuyularında ISP'nin toplam yükleme oranı% 88 idi; ısı haritası, numunenin çipin toplam alanına eşit olarak yüklendiğini göstermiştir (<strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

Protokol, yarı iletken tabanlı yeni nesil dizileme platformunda anöploidi için implantasyon öncesi genetik testlerde gerekli olan genel laboratuvar içi prosedürleri sunar. Burada tüm genom amplifikasyonunun, DNA fragmanı seçiminin, kütüphane yapımının, şablon hazırlamanın ve dizileme çalışma akışının ayrıntılı adımlarını temsili sonuçlarla sunuyoruz.

Yarı İletken Tabanlı Yeni Nesil Dizileme Platformunda Anöploidi için İmplantasyon Öncesi Genetik Test

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...

Bu protokol, yarı iletken tabanlı yeni nesil dizileme platformunda anöploidi için implantasyon öncesi genetik testte tek hücreli amplifikasyondan nihai raporlama verilerine kadar prosedürü sunar. Bu prosedür, izleyicilerin PGT-A diziliminin deneysel iş akışını iyi anlamalarına ve bu tekniği yarı iletken tabanlı bir NGS platformuna sahip bir teşhis laboratuvarında çoğaltmalarına yardımcı olabilir. Tüm genom amplifikasyon ürünlerinin 25 mikrolitresini pipetleyerek, bunları 25 mikrolitre nükleaz içermeyen su ile önceden yüklenmiş 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktararak başlayın.Vorteks ve DNA saflaştırma boncuklarını karıştırın. Aliquot Bu çözeltinin 50 mikrolitresi her numune tüpüne girer. Vorteks ve santrifüj beş saniye boyunca kısaca.DNA bağlama işlemi için tüpü oda sıcaklığında beş dakika bekletin. 1,5 mililitrelik santrifüj tüpünü manyetik bir rafa yerleştirin. Ardından, tüm manyetik boncuklar tüpün yan duvarına çekilene kadar bekleyin.Süpernatantı dikkatlice yeni bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Boncukları pipetlemekten kaçının. Orijinal numune hacmine göre.Pipet 30 mikrolitre manyetik boncuk, vorteks ve santrifüj ile beş saniye kısaca santrifüj yapar. DNA bağlama işlemi için tüpü oda sıcaklığında beş dakika bekletin. 1,5 milimetrelik santrifüj tüplerini manyetik rafa yerleştirin.Ardından, tüm manyetik boncuklar tüpün yan duvarına çekilene kadar bekleyin. Süper natantı dikkatlice çıkarın ve atın. Boncukları pipetlemekten kaçının.Pipet 300 mikrolitrelik %70 etanol ile 1,5 mililitrelik santrifüj tüpü içine alınır. Ardından, tüpü 180 derecelik bir açıyla iki kez yavaşça döndürün ve iyice yıkamak için boncukları tüp duvarı boyunca hareket ettirin. Pipet takın ve süpernatanı atın.Boncukları pipetlemekten kaçının. Yıkama prosedürünü bir kez tekrarlayın. Temiz program tamamlandıktan sonra sisteme yeni bir amplifikasyon plakası yerleştirin.Her biri 150 mikrolitre kırma çözeltisi iki ile önceden doldurulmuş toplama tüplerini rotora yerleştirin, ardından köprüyü toplama tüplerinin üzerine yerleştirin. Reaksiyon yağını tüpün yarısına ve emülgatör kırma çözeltisini tüpün üçte birine ekleyin. Şablon hazırlama için yeni bir filtreyi, örnek portalı yukarı doğru konumlandırılmış bir tüp rafına yerleştirin.Çözeltiyi beş saniye boyunca vorteksleyin ve beş saniye boyunca kısa bir süre santrifüj yapın. Ardından, 800 mikrolitreyi üç kez pipetledikten sonra çözeltiyi filtrenin numune portalına aktarın. Son enjeksiyondan önce kabarcıkları azaltmak için tüpü santrifüj edin.Filtreye hava enjekte etmekten kaçının. Karışık çözeltiyi takiben 200 mikrolitre reaksiyon yağı iki enjekte edin. Filtrenin örnek portalını aşağı doğru çevirin ve yıkama adaptasyonunu filtreyle değiştirin.Numune iğnesini rotor kapağının orta deliğine yerleştirin ve ardından iğneyi tabana bastırın. Ekrandaki Çalıştır düğmesine tıklayın ve programı ilgili kite göre seçin. Ardından tüm adımları kontrol etmek için Yardımlı'yı seçin.Koşu başlayana kadar İleri'ye tıklayın. Koşunun tamamlanması yaklaşık 4,5 saat sürecektir. Program bittiğinde İleri'yi seçin.Sistem 10 dakikalık bir santrifüjleme işlemine başlayacaktır. Santrifüjlemeden sonra, Kapağı Aç düğmesine tıklayın ve toplama tüplerini raflara taşıyın. Prosedür 15 dakika içinde bir sonraki adıma geçmezse, yeniden santrifüj yapmak için son dönüşe basın.Süpernatantı toplama tüpünde çıkarın ve tüpte 100 mikrolitre çözelti bırakın. Kalan numuneyi pipetle karıştırın ve numuneyi OT işaretli yeni 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Süper nanattı pipetlediğinizde, borunun dibine yanlar boyunca dokunmaktan kaçının. Pipet 100 mikrolitre nükleaz içermeyen suyu her toplama tüpüne aktarır ve çözeltiyi OT tüpüne tekrar tekrar pipetleme ile yıkayarak aktarır.Toplam bir mililitre hacmini oluşturmak için OT tüpüne 600 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Vorteks, sekiz dakika boyunca 15, 500 kez G'de santrifüjde 30 saniye boyunca. OT tüpünde 100 mikrolitre çözelti bırakarak süpernatantı yavaşça çıkarın.Yağ tabakasını tamamen atmak için ucu kullanın. 900 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin, 30 saniye boyunca vorteks yapın ve sekiz dakika boyunca 15.500 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı çözeltinin 20 mikrolitresi kalana kadar çıkarın ve 100 mikrolitre hacmini oluşturmak için şablon askıya alma çözeltisini ekleyin.Sonra 30 saniye boyunca vorteks ve iki saniye boyunca kısaca santrifüj yapın. Numune işlemeden sonraki 12 saat içinde bir sonraki adıma geçin Seyreltilmiş kütüphanenin 100 mikrolitresini, 130 mikrolitre C1 boncuğunu, 300 mikrolitre üç x şablon yıkama çözeltisini ve 300 mikrolitre eritme çözeltisini sekiz kuyucuk şeridine yükleyin. Sekiz kuyucuk şeridini Zenginleştirme Modülüne takın, pipetleme ucunu yükleyin ve 200 mikrolitrelik santrifüj tüpünü toplama konumuna getirin.Programı çalıştırmak için Başlat'a tıklayın. Pipet, numune çözeltisinin 55 mikrolitresini alır ve çipin numune deliğine enjekte eder. Çipi santrifüj üzerine yerleştirin.Çentiği dışarıya ve örnek portalı içeriye doğru tutun. Ardından, kullanılmış başka bir talaş ve santrifüjle 10 dakika boyunca dengeleyin. Yükleme çözümünü metin makalesinde açıklandığı şekilde hazırlayın.Köpüklenme çözeltisine 100 mikrolitre hava üfleyin. Kabarcıklar yoğun, köpüren bir duruma gelene kadar çözeltiyi tekrar tekrar pipetleyin ve köpük hacmini yaklaşık 250 mikrolitrede tutun. Çipi santrifüjden sonra tezgahın üzerine yerleştirin.Numune deliğine 100 mikrolitre köpük enjekte edin ve ekstrüde edilmiş çözeltiyi çıkış portalına çıkarın. Ardından, çipi 30 saniye boyunca kısaca santrifüj yapın. Bu işlemi bir kez tekrarlayın.İki kez% 50 yıkama tamponunda 100 mikrolitre enjekte edin ve her enjeksiyondan sonra ekstrüde edilmiş çözeltiyi çıkış portalından çıkarın. Daha sonra% 50 tavlama tamponuna üç kez 100 mikrolitre enjekte edin ve her enjeksiyondan sonra ekstrüde edilmiş çözeltiyi çıkış portalında çıkarın. % 50 enzim reaksiyon tamponuna 65 mikrolitre enjekte edin, kabarcıklardan kaçının ve ekstrüde edilmiş çözeltiyi çıkış portalından çıkarın.Yüklenen çipi oda sıcaklığında beş dakika boyunca stabilize edin ve çipi sıralayıcı çip portalına takın. Planlanan programı seçin, bilgileri kontrol edin ve çalıştırmayı başlatın. Temsili çalışma toplam 17.6 gigabayt veri elde etti ve iyon küresi parçacığının toplam yükleme oranı, çipin toplam kuyularında% 88 idi.Isı haritası, toplam talaş alanına numune yüklemesini bile doğruladı. Toplam okumaların %77'si kullanılabilirdi. ISP yüklü tüm kuyular,% 78'inin klonal olduğu% 100 şablon zenginleştirmesi gösterdi.Tüm klonal şablonların% 97'si son kütüphane olarak nitelendirildi. Okumanın ortalama uzunluğu 177 baz çifti iken, medyan ve mod sırasıyla 176 ve 174 baz çifti idi. Şablonlardaki timin, sitozin ve adenin tepe sayıları, 50'lik nitelikli kesme çizgisi üzerinde yaklaşık 76 idi.Canlı ISS'lerin bulunduğu tüm adreslenebilir kuyularda% 99,5'i inşa edilmiş kütüphane olarak nitelendirildi ve poliklonal ve düşük kaliteli kütüphanelerin% 20'si filtrelenirken, ISS'lerin% 76,6'sı daha fazla analiz için kalifiye edildi. Tek bir örneklemden alınan kopya sayısı varyansının sonucu, kromozom dört üzerinde P 16.3 ila Q 35.2'nin 182.16 megabaz çifti mozaik trizomisini ve Kromozom 22'de Q 11.1 ila Q 13.33'ün 33 nokta 13 megabaz çifti monozomi segmentini göstermiştir. Parça seçimi yapılırken, adımlar arasındaki zaman aralıkları, ön ve arka uç numuneler için fazla maruz kalma ve maruz kalmamayı önlemek için aynı partideki numunelerin boyutuna göre değiştirilmelidir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Yeni nesil Sıralama için Uygun Bitki Organelleri DNA Zenginleştirme Yöntemlerinin Optimizasyonu ve Karşılaştırmalı Analizi

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Hedef yeni nesil sıralama ve Biyoinformatik boru hattı anayasal hastalığı genetik belirleyicileri değerlendirmek için

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetik Mühendisliği hücreleri Dictyostelium discoideum alan seçimi ve bakteri büyüme

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Aneuploidi için Preimplantasyon Genetik Test için Yarı iletken Sıralama

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizleri roman proteinler açıklayacak OpenProt veritabanı kullanarak kanonik olmayan açık okuma çerçevesi tercüme

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

RNA yeni nesil sıralamayı ve Biyoinformatik boru hattını Locus 'a özgü düzeyde Ifade eden SATıRı-1s tanımlamak için

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...