Name: exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology
Uploaded: 2022-03-31T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Denne forskning blev støttet af en bevilling fra Binational Science Foundation (BSF) til S.K.S. og N.Q.

BEMÆRK: De rekombinante proteiner, der blev anvendt i denne undersøgelse, Hsp90 og Cdc37, blev kommercielt opnået (se tabel over materialer).
1. Chip aktivering
BEMÆRK: Alle materialer, der skal bruges i eksperimentet, er angivet i materialetabellen. Filtrer alle tilberedte opløsninger gennem et sterilt 0,2 μm filter.
<ol><li>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidopløsning (EDC) fremstilles ved tilsæ...

I denne undersøgelse blev muligheden for at anvende FEB-teknologien (en kinetisk karakteriseringsmetode i realtid) evalueret for at bestemme den biomolekylære interaktion mellem Hsp90 og Cdc37. Det indledende sonderende eksperiment (første eksperiment) foreslog, at valg af de korrekte analytkoncentrationer er en kritisk del af eksperimentet, og at eksperimentet skulle designes ved at inkludere koncentrationspunkter over og under KD-værdien , som blev forudsagt ud fra de tilgængelige data i litteraturen.</...

Biomolekylære interaktioner: Proteiner er væsentlige dele af organismer og deltager i adskillige molekylære veje såsom cellemetabolisme, cellestruktur, cellesignalering, immunresponser, celleadhæsion og meget mere. Mens nogle proteiner udfører deres funktion(er) uafhængigt, interagerer de fleste proteiner med andre proteiner ved hjælp af en bindende grænseflade til at koordinere korrekt biologisk aktivitet1.
Biomolekylære interaktioner kan hovedsageligt klassificeres ud fra de forskellige strukturelle og funktionelle egenskaber ved involverede proteiner2, for eksempel baseret på proteinoverfladerne, den komplekse stabilitet eller persistensen af interaktioner3. Identifikation af essentielle proteiner og deres roller i biomolekylære interaktioner er afgørende for at forstå biokemiske mekanismer på molekylært niveau4. I øjeblikket er der forskellige tilgange til at detektere disse interaktioner5: in vitro6, in silico7, i levende celler8, ex vivo9 og in vivo10, hvor hver har sine egne styrker og svagheder.
In vivo-assays udføres ved hjælp af hele dyret som et eksperimentelt værktøj11, ogt ex vivo-assays udføres på vævsekstrakter eller hele organer (f.eks. Hjerte, hjerne, lever) i et kontrolleret eksternt miljø ved at give minimale ændringer i naturlige forhold. Den mest almindelige anvendelse af in vivo- og ex vivo-undersøgelser er at evaluere farmakokinetikken, farmakodynamikken og toksicitetsvirkningerne af potentielle farmakologiske agenser før humane forsøg ved at sikre deres samlede sikkerhed og virkning12.
Biomolekylære interaktioner kan også påvises i levende celler. Billeddannelse af levende celler giver os mulighed for at observere dynamiske interaktioner, når de udfører reaktionerne fra en bestemt biokemisk vej13. Desuden kan detektionsteknikker, såsom bioluminescens eller fluorescensresonansenergioverførsel, give information om, hvor og hvornår disse interaktioner forekommer i cellen14. Selvom detektion i levende celler tilbyder vigtige detaljer, er disse detektionsmetoder afhængige af optik og etiketter, som muligvis ikke afspejler den oprindelige biologi; de er også mindre kontrollerede end in vitro-metoder og kræver specialiseret ekspertise for at udføre15.
In silico-beregningsmetoderne anvendes primært til storstilet screening af målmolekyler før in vitro-forsøgene . Beregningsmæssige forudsigelsesmetoder, computerbaserede databaser, molekylær docking, kvantitative struktur-aktivitetsforhold og andre molekylære dynamiksimuleringsmetoder er blandt de veletablerede i silico-værktøjer 16. Sammenlignet med besværlige eksperimentelle teknikker kan in silico-værktøjerne let lave forudsigelser med høj følsomhed, men med reduceret nøjagtighed i prædiktiv ydeevne17.
In vitro-assays udføres med mikroorganismer eller biologiske molekyler uden for deres standard biologiske kontekst. At skildre biomolekylære interaktioner gennem in vitro-metoder er afgørende for at forstå proteinfunktioner og biologien bag det komplekse netværk af cellefunktion. Den foretrukne analysemetode vælges i henhold til proteinets iboende egenskaber, kinetiske værdier og interaktionsmåden og intensiteten18,19.
Hsp90/Cdc37-interaktionen: Chaperon-kinase-vejen, der forbinder Hsp90 og Cdc37, er et lovende terapeutisk mål i tumorbiologi20. Hsp90 spiller en central rolle i cellecykluskontrol, proteinsamling, celleoverlevelse og signalveje. Proteiner, der er afhængige af Hsp90 for deres funktioner, leveres til Hsp90 til kompleksnering gennem en co-chaperon, såsom Cdc37. Hsp90/Cdc37-komplekset styrer foldningen af de fleste proteinkinaser og fungerer som et knudepunkt for en lang række intracellulære signalnetværk21. Det er et lovende antitumormål på grund af dets forhøjede ekspression i forskellige maligniteter, herunder akut myeloblastisk leukæmi, multipelt myelom og hepatocellulært carcinom22,23.
Almindeligt anvendt in vitro biomolekylære interaktionsdetekteringsteknikker Co-immunoprecipitation (co-IP) er en teknik, der er afhængig af antigen-antistofs specificitet for at identificere biologisk relevante interaktioner24. Den primære ulempe ved denne metode er dens manglende evne til at detektere interaktioner med lav affinitet og kinetiske værdier24. Biofysiske metoder såsom isotermisk titreringskalorimetri (ITC), overfladeplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og FEB-teknologi foretrækkes til at bestemme de kinetiske værdier.
ITC er en biofysisk detektionsmetode baseret på bestemmelse af bindingsenergi sammen med en komplet termodynamikanalyse til karakterisering af biomolekylære interaktioner25. Den primære fordel ved ITC er, at det ikke kræver nogen mærkning eller fiksering af målproteinet. De største vanskeligheder, som ITC støder på, er den høje koncentration af målprotein, der kræves til et eksperiment, og vanskeligheden ved at analysere ikke-kovalente komplekser på grund af små bindende entalpier26. Både SPR og BLI er etiketfrie biofysiske teknikker, der er afhængige af immobilisering af målmolekylet på sensoroverfladen efterfulgt af efterfølgende injektioner af analytten over det immobiliserede mål27,28. I SPR måles ændringer i brydningsindekset under biomolekylære interaktioner27; i BLI registreres interferensen i reflekteret lys i realtid som en ændring i bølgelængden som en funktion af tid28. Både SPR og BLI deler fælles fordele ved at tilbyde høj specificitet, følsomhed og detektionsfunktioner29. I begge metoder immobiliseres målproteinet på biosensoroverflader, og der kan derfor være et vist tab af målets oprindelige konformation, hvilket gør det vanskeligt at skelne mellem specifikke vs. ikke-specifikke interaktioner30. BLI bruger dyre engangsfiberoptiske biosensorer til at immobilisere målet, og er derfor en dyr teknik31. Sammenlignet med disse veletablerede biomolekylære detektionsværktøjer tilbyder FEB-teknologien en pålidelig og etiketfri platform ved at bruge lave nanomolære koncentrationer til biomolekylær detektion i realtid med kinetisk karakterisering. FEB-teknologien overvinder også de boblende udfordringer, som ITC står over for, og er mere omkostningseffektiv sammenlignet med SPR eller BLI.
De felteffekttransistorbaserede biosensorer (FET) er et voksende felt til påvisning af biomolekylære interaktioner ved at tilbyde forskellige biomedicinske applikationer. I FET-systemet immobiliseres målene til biosensorchipsene, og interaktioner detekteres ved ændringer i konduktans32. Det unikke træk, der skal tages i betragtning ved udviklingen af en effektiv elektronisk biosensor, er de fysisk-kemiske egenskaber såsom den halvledende karakter og kemiske stabilitet af det belægningsmateriale, der anvendes til fremstilling af sensoroverfladen33. Konventionelle materialer som silicium, der anvendes til FET, har begrænset sensorernes følsomhed, fordi det kræver oxidlag klemt inde mellem transistorkanalen og et specifikt miljø for korrekt funktion34. Desuden er siliciumtransistorer følsomme over for miljøer med højt saltindhold, hvilket gør det svært at måle biologiske interaktioner i deres naturlige miljø. Den grafenbaserede biosensor præsenteres som et alternativ, da den tilbyder fremragende kemisk stabilitet og elektrisk felt. Da grafen er et enkelt atomlag af kulstof, er det både ekstremt følsomt som en halvleder og kemisk kompatibelt med biologiske opløsninger; begge disse kvaliteter er ønskelige for at generere kompatible elektroniske biosensorer35. Det bemærkelsesværdige ultrahøje belastningspotentiale i biomolekyler, der tilbydes af grafenbelagte biosensorer, fører til udviklingen af grafenbaserede biosensorer FEB-teknologi.
Princippet om FEB-teknologi: FEB er en etiketfri biomolekylær detektionsteknik, der måler den elektriske strøm gennem grafenbiosensoren, som bindingsmålene immobiliseres til. Interaktioner mellem det immobiliserede protein og analytten resulterer i ændringer i strømmen, der overvåges i realtid, hvilket muliggør nøjagtige kinetiske målinger36.
Instrumentering: FEB-systemet består af en grafenfelteffekttransistor (gFET) sensorchip og en elektronisk læser, der anvender en konstant spænding gennem hele eksperimentet (figur 1). Analytten påføres i opløsning på målproteinet immobiliseret på biosensoroverfladen. Når en interaktion opstår, måles og registreres en ændring i strømmen i realtid. Efterhånden som analytkoncentrationen stiger, vil fraktionen af bundet analyt også stige, hvilket forårsager højere vekslinger i strømmen. Ved hjælp af den automatiserede analysesoftware, der følger med instrumentet (Table of Materials), måles og registreres I-Response i form af biosensingenheder (BU)37. I-Response defineres som ændringen i strømmen (I) gennem biosensorchippen målt i realtid ved interaktionen mellem det immobiliserede mål og analytten. DEN FEB automatiserede analysesoftware kan analysere både I-Response og C-Response til dynamiske interaktionshændelser, hvor C-Response registrerer ændringerne i kapacitansen (C). Variationerne i både I-Response og C-Response svarer direkte til brøkdelen af bundet analyt og kan analyseres yderligere for at generere KD-værdier . Den automatiserede analysesoftwares standardpræference er I-Response.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63495/63495fig01.jpg"> Figur 1: Oversigt over forsøgsopstillingen. (A) Grafenbaseret chip og elektronisk læser. (B) En oversigt over chipkomponenterne. Chippen er fastgjort til to elektroder, der leverer strøm til systemet. Overfladen af chippen er dækket af grafen, som, når den aktiveres, kan binde målet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63495/63495fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Metodik: Indledningsvis indsættes den aktiverede biosensorchip i FEB-enheden (figur 1) efterfulgt af udførelsen af nedenstående trin: (1) Kalibrering: Eksperimentet starter med systemkalibrering ved anvendelse af 1x fosfatbufret saltvand (PBS; pH = 7,4) for at skabe baseline-ligevægtsresponsen. (2) Tilknytning: Analytten indføres i chippen, og I-Response overvåges, indtil bindingsmætningen er nået. (3) Dissociation: Analytten dissocieres ved hjælp af 1x PBS. (4) Regenerering: Rester af analytten fjernes ved hjælp af 1x PBS. (5) Vask: I alt fem vaske udføres ved hjælp af 1x PBS til grundig fjernelse af de bundne og ubundne analytter fra chippen.
Analyse: Dataanalyse udføres ved hjælp af den fuldautomatiske software, der følger med instrumentet. Den automatiserede analysesoftware genererer et Hill fit-plot med en KD-værdi . Hill fit-plottet beskriver en analyts tilknytning til målproteinet som en funktion af analytkoncentrationer. Koncentrationen, ved hvilken der opnås et halvt maksimalt respons, er proportional med KD-værdien . En lav KD-værdi repræsenterer høj bindingsaffinitet og omvendt.
For at validere de data, der er opnået fra FEB-eksperimentet, ekstraheres I-Responses fra hvert udlæsningspunkt for hver analytkoncentration ved hjælp af datagennemgangs-/eksportsoftwaren og kan eksporteres til anden statistisk analysesoftware (se materialetabellen) som forklaret nedenfor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated analysis software</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>biosensor chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data review software</td>
			<td>Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag</td>
			<td>CelluSep,&#160; Membrane filtration products</td>
			<td>T2-10-15 
			CAS number: NA</td>
			<td>T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm &#216;, 0.32ml/cm, 15m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>EDC160322-02 
			CAS number: 25952-53-8</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC (Isothermal titration calorimetry) system</td>
			<td>Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M3671-50G 
			CAS number: 4432-31-9</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Graphene-based chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline) X 10</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001623237500&#160; 
			CAS number: 7758-11-4</td>
			<td>Liquid transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipete</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11855231 
			CAS number: NA</td>
			<td>Finnpipette F3 5-50 &#181;L, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-002-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5))</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-003-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Cdc37</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab256157 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Hsp90 beta</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80033 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet</td>
			<td>Excel, Microsoft office</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>GraphPad, Prism</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NHS160321-07 
			CAS number: 106627-54-7</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td>Alex red</td>
			<td>LC 1093-800-000 
			CAS number: NA</td>
			<td>Tip 1-200 &#181;l, in bulk, 1,000 pcs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology

Biomolekylære interaktioner spiller alsidige roller i adskillige cellulære processer ved at regulere og koordinere funktionelt relevante biologiske begivenheder. Biomolekyler såsom proteiner, kulhydrater, vitaminer, fedtsyrer, nukleinsyrer og enzymer er grundlæggende byggesten i levende væsener; de samles i komplekse netværk i biosystemer for at synkronisere et utal af livsbegivenheder. Proteiner bruger typisk komplekse interaktomnetværk til at udføre deres funktioner; derfor er det obligatorisk at evaluere sådanne interaktioner for at opklare deres betydning i celler på både cellulært og organismeniveau. Mod dette mål introducerer vi en hurtigt voksende teknologi, field-effect biosensing (FEB), til at bestemme specifikke biomolekylære interaktioner. FEB er en stationær, etiketfri og pålidelig biomolekylær detektionsteknik til bestemmelse af specifikke interaktioner og bruger elektronisk baserede biosensorer af høj kvalitet. FEB-teknologien kan overvåge interaktioner i det nanomolære område på grund af de biokompatible nanomaterialer, der anvendes på dens biosensoroverflade. Som et bevis på konceptet blev protein-protein-interaktionen (PPI) mellem varmechokprotein 90 (Hsp90) og celledelingscyklus 37 (Cdc37) belyst. Hsp90 er en ATP-afhængig molekylær chaperon, der spiller en væsentlig rolle i foldning, stabilitet, modning og kvalitetskontrol af mange proteiner og derved regulerer flere vitale cellulære funktioner. Cdc37 betragtes som en proteinkinase-specifik molekylær chaperon, da den specifikt genkender og rekrutterer proteinkinaser til Hsp90 for at regulere deres nedstrøms signaltransduktionsveje. Som sådan betragtes Cdc37 som en co-chaperone af Hsp90. Chaperon-kinasevejen (Hsp90 / Cdc37-komplekset) er hyperaktiveret i flere maligniteter, der fremmer cellulær vækst; derfor er det et potentielt mål for kræftbehandling. Denne undersøgelse viser effektiviteten af FEB-teknologien ved hjælp af Hsp90 / Cdc37-modelsystemet. FEB påviste en stærk PPI mellem de to proteiner (KD-værdier på 0,014 μM, 0,053 μM og 0,072 μM i tre uafhængige eksperimenter). Sammenfattende er FEB en etiketfri og omkostningseffektiv PPI-detektionsplatform, der tilbyder hurtige og nøjagtige målinger.

Resultater fra forsøg 1: Målproteinet Hsp90 (500 nM) blev immobiliseret til chippen efter målimmobiliseringsprotokollen som beskrevet ovenfor. Til det første forsøg blev der fremstillet 10 koncentrationer af analytproteinet, Cdc37, fra 25 nM til 5.000 nM, baseret på de data, der var tilgængelige i litteraturen (se tabel 1).
Trinene i eksperimentet kan overvåges i realtid ved at følge de ændringer, der forekommer i I-responsen (<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Field-effect biosensing (FEB) er en etiketfri teknik til påvisning af biomolekylære interaktioner. Den måler den elektriske strøm gennem grafenbiosensoren, som bindingsmålene er immobiliseret til. FEB-teknologien blev brugt til at evaluere biomolekylære interaktioner mellem Hsp90 og Cdc37, og der blev påvist en stærk interaktion mellem de to proteiner.

Udforskning af biomolekylær interaktion mellem den molekylære chaperon Hsp90 og dens klientproteinkinase Cdc37 ved hjælp af felteffektbiosensingteknologi

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

FEB er en etiketfri og omkostningseffektiv _______ _______ interaktionsdetekteringsplatform, der tilbyder hurtige og nøjagtige målinger. Denne metode giver validering af kendte eller ukendte interaktioner og en nem måde at teste for potentielle hæmmere af de biomolekylære interaktioner. Den største fordel ved FEB er dens automatiserede, brugervenlige software, der gates brugeren gennem hele eksperimentet med åben, håndpipetteringsplatform, så brugerne kan arbejde med ringe eller endda ingen træning.FEB-teknologien tilbyder også anvendelser inden for forskellige områder af lægemidler, biomolekylær analyse af små molekyler, peptider og proteiner, lægemiddelvalidering ved let at oversætte in vitro-biologisk aktivitet til in vivo-effekt. Som nybegynder kan du stå over for udfordringer med at vælge de rigtige analytkoncentrationer for at optimere eksperimentet for at få en pålidelig KD-værdi. Vi anbefaler at være opmærksom på chipfunktionaliseringsprocessen og korrekt bufferudveksling.Begynd med at blande lige store mængder EDC- og sulfo-NHS-opløsning ved at pipettere op og ned. Anbring biosensorchippen, der leveres af virksomheden, i en glaspetriskål med et monteret låg. Alle funktionaliseringstrin, der er involveret i chipaktivering, foreslås udført i petriskålen.Påfør 50 mikroliter en-molær MES-buffer på biosensorchippen. Inkuber i et minut ved stuetemperatur. Derefter aspirerer bufferen og påfør 50 mikroliter EDC sulfo-NHS-opløsning straks på sensorchippen.Dæk petriskålen og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur. Aspirer EDC-sulfo-NHS-opløsningen fra chippen, og påfør 50 mikroliter en-molær MES-buffer. Aspirer MES-bufferen, og skyl chippen to gange med 50 mikroliter 1X PBS.Aspirer PBS fra chippen og tilsæt målmolekylet Hsp90. Dæk glaspetriskålen og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter aspirerer opløsningen indeholdende målmolekylet og skylles tre gange med 50 mikroliter 1X PBS.Aspirer 1X PBS-opløsningen fra chippen, og tilsæt 50 mikroliter af slukningsopløsningen. Dæk glassets petriskålen og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur. Aspirer slukningen af en opløsning fra chippen, og tilsæt 50 mikroliter af slukningen af to opløsninger.Dæk glassets petriskålen og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur. Derefter aspirerer du sluk to opløsninger fra chippen og skyl chippen fem gange ved hjælp af 50 mikroliter 1X PBS, der efterlader den sidste PBS-dråbe på sensoren. Analytfortyndingsserien forberedes til Cdc37 i det ønskede koncentrationsområde.Forsøget designes til at omfatte mindst otte forskellige analytkoncentrationer for at opnå en pålidelig dissociationskonstant eller KD-værdi, og disse forskellige fortyndinger forberedes i den samme buffer, der anvendes til kalibrering og målprotein. Placer chippen forsigtigt på instrumentet. Sørg for, at softwaren er tændt, og at LED-lyset bliver grønt.Tryk derefter på Kør eksperimentmodulet på den automatiserede software og vælg 10 punkter med regenerering eller enhver anden ønsket protokol. Udfyld detaljerne, f.eks. operatørnavn, eksperimentnavn, dato, regenereringsbuffer, immobiliseret mål og analytten i løsningen. Tryk på knappen Start eksperiment, der vises på softwaren, og følg instruktionerne fra den automatiserede software.For at udføre instrumentkalibreringen skal du aspirere den resterende PBS-opløsning fra chippen og anvende 50 mikroliter kalibreringsbufferen. Tryk på knappen Fortsæt, og vent i fem minutter, indtil kalibreringstrinnet er afsluttet. Softwaren viser det slutpunkt, der er bestemt for kalibreringstrinnet, med en advarselsalarm, der skal følges op.Udfør derefter en analytforening ved at aspirere kalibreringsbufferen fra chippen og anvende 50 mikroliter af den laveste analytkoncentration. Tryk på knappen Fortsæt, og vent i fem minutter, indtil tilknytningstrinnet er afsluttet. Softwaren viser slutpunktet for tilknytningstrinnet med en advarselsalarm for at fortsætte.For at udføre en analytsociation aspirerer analytopløsningen fra chippen og påfører 50 mikroliter dissociationsbufferen. Tryk på knappen Fortsæt. Efter dissociationstrinnets varighed viser softwaren slutpunktet for dissociationstrinnet med en advarselsalarm.Udfør derefter chipregenerering ved at aspirere dissociationsopløsningen fra chippen og anvende 50 mikroliter regenereringsbufferen. Tryk derefter på knappen Fortsæt. Regenereringstrinnet tager typisk cirka 30 sekunder at afslutte.Derefter viser softwaren slutpunktet for regenereringstrinnet med en advarselsalarm, der skal følges op. Endelig, for at vaske chippen, aspirere regenereringsopløsningen fra chippen og anvende 50 mikroliter af vaskebufferen. Aspirer opløsningen fra chippen og gentag dette fem gange.Lad den sidste dråbe af vaskebufferen stå på chippen. Tryk derefter på knappen Fortsæt, og vent i 30 sekunder, indtil vasketrinnets varighed er afsluttet i softwaredisplayet. Gentag trinnene for hver anvendt analytkoncentration.De fem trin i kalibreringen, analytforeningen, dissociationen, regenereringen og vasken fem gange udgør en cyklus. Tryk på knappen Analyse i den automatiserede analysesoftware i slutningen af eksperimentet. Et displayvindue, der indeholder alle de eksperimentelle punkter, vises.Sørg for, at de analytkoncentrationer, der anvendes til den foreskrevne protokol, er korrekte. Tryk på knappen Kør analyse for at generere KD-værdien automatisk. Softwaren genererer et hill fit plot ved at plotte analytkoncentrationerne mod de tilsvarende I-responser, hvorfra dissociationskonstanten ved ligevægt beregnes.Målproteinet Hsp90 blev immobiliseret til chippen, og til det første eksperiment blev der fremstillet 10 koncentrationer af analytproteinet Cdc37 fra 25 nanomolarer til 5.000 nanomolarer. De datafiler, der genereres fra eksperiment et, er blevet vist her. De eksperimentelle data, der overvåges i realtid, vises her.Y-aksen svarer til I-responsen i biosensorenhederne, og X-aksen svarer til de forskellige tidspunkter og koncentrationer af analytten i forsøget. Det grafiske billede, der vises her, repræsenterer hill fit-plottet, der genereres fra den automatiserede analysesoftware. Y-aksen svarer til I-responsen i biosensorenhederne, og X-aksen svarer til de forskellige analytkoncentrationer i forsøget.Det grafiske billede, der er vist her, repræsenterer foreningsplottet, der genereres ved hjælp af den statistiske analysesoftware. Y-aksen svarer til I-responsen i slutningen af associationsfasen, og X-aksen svarer til de forskellige koncentrationer af analytten Cdc37. I eksperiment to blev der anvendt et andet sæt koncentrationer fra 0,4 nanomolære til 200 nanomolære, og de genererede datafiler er vist her.De grafiske billeder repræsenterer ITC-termogrammet for Hsp90- og Cdc37-interaktion. Vist her er de tilsvarende varmeudviklende kurver opnået på grund af de på hinanden følgende injektioner af Cdc37 i Hsp90 ved 298,15 Kelvin. Den differentielle effekt, der anvendes her, er en funktion af tiden.De integrerede datapunkter i dette plot betegner den tilsvarende normaliserede varme versus Mueller-forholdet mellem Hsp90 og Cdc37. Den åbne pipetteringsmetode, der anvendes her, kræver, at brugeren har en grundlæggende beherskelse af håndpipettering, og sørg for ikke at røre biosensoren med spidsen. Reproducerbarheden af trintimingen afhænger helt af brugeren.Når forskeren karakteriserer en interaktion mellem to biomolekyler, kan vi udføre et screeningseksperiment ved at designe potentielle hæmmere eller modulatorer rettet mod den specifikke biomolekylære interaktion ved hjælp af FEB-systemet. Denne procedure kan bruges til at identificere, verificere og kvantificere kendt og ny interaktion mellem proteiner såvel som små molekyler, herunder lægemidler og peptider.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analyse af proteinkinaseaktivitet med radiomærket ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Human perifert blod Neutrofile Isolation for at forhøre Parkinsons Associated LRRK2 Kinase Pathway ved at vurdere Rab10 fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifikation af roman CK2 Kinase substrater ved hjælp af en alsidig biokemiske tilgang

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

At studere RNA Interactors af Protein Kinase RNA-aktiveret under pattedyr cellecyklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på molekyleniveau ved hjælp af robuste biokemiske tilgange af et nyt kinase protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinasehæmmer screening i selv monterede humane protein mikrosystemer

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantificering af protein interaktions netværk dynamik ved hjælp af Multiplexed Co-Immunopræcipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Overvågning af protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo ved høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...