Name: exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology
Uploaded: 2022-03-31T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Cette recherche a été soutenue par une subvention de la Binational Science Foundation (BSF) à S.K.S. et N.Q.

REMARQUE : Les protéines recombinantes utilisées dans cette étude, Hsp90 et Cdc37, ont été obtenues commercialement (voir tableau des matériaux).
1. Activation de la puce
REMARQUE : Tous les matériaux à utiliser dans l’expérience sont répertoriés dans le tableau des matériaux. Filtrer toutes les solutions préparées à l’aide d’un filtre stérile de 0,2 μm.
<ol><li>Préparer une solution de 1-?...

Dans cette étude, la faisabilité de l’utilisation de la technologie FEB (une approche de caractérisation cinétique en temps réel) a été évaluée pour déterminer l’interaction biomoléculaire entre Hsp90 et Cdc37. L’expérience exploratoire initiale (première expérience) suggérait que le choix des concentrations d’analyte appropriées est une partie essentielle de l’expérience et que l’expérience devrait être conçue en incluant des points de concentration au-dessus et au-dessous de la valeur K<...

Interactions biomoléculaires : Les protéines sont des parties essentielles des organismes et participent à de nombreuses voies moléculaires telles que le métabolisme cellulaire, la structure cellulaire, la signalisation cellulaire, les réponses immunitaires, l’adhésion cellulaire, etc. Alors que certaines protéines remplissent leur(s) fonction(s) indépendamment, la plupart des protéines interagissent avec d’autres protéines en utilisant une interface de liaison pour coordonner l’activité biologique appropriée1.
Les interactions biomoléculaires peuvent principalement être classées en fonction des caractéristiques structurelles et fonctionnelles distinctes des protéines impliquées2, par exemple, en fonction des surfaces protéiques, de la stabilité complexe ou de la persistance des interactions3. L’identification des protéines essentielles et de leurs rôles dans les interactions biomoléculaires est essentielle pour comprendre les mécanismes biochimiques au niveau moléculaire4. Actuellement, il existe différentes approches pour détecter ces interactions5 : in vitro6, in silico7, dans les cellules vivantes8, ex vivo9 et in vivo10, chacune ayant ses propres forces et faiblesses.
Les essais in vivo sont effectués en utilisant l’animal entier comme outil expérimental11, et les essaisex vivo sont effectués sur des extraits de tissus ou des organes entiers (par exemple, le cœur, le cerveau, le foie) dans un environnement externe contrôlé en fournissant des altérations minimales dans les conditions naturelles. L’application la plus courante des études in vivo et ex vivo consiste à évaluer les effets pharmacocinétiques, pharmacodynamiques et toxiques d’agents pharmacologiques potentiels avant les essais chez l’homme en s’assurant de leur innocuité et de leur efficacitéglobales 12.
Les interactions biomoléculaires peuvent également être détectées au sein des cellules vivantes. L’imagerie des cellules vivantes nous permet d’observer des interactions dynamiques lorsqu’elles exécutent les réactions d’une voie biochimique particulière13. De plus, les techniques de détection, telles que la bioluminescence ou le transfert d’énergie par résonance de fluorescence, peuvent fournir des informations sur l’endroit et le moment où ces interactions se produisent dans la cellule14. Bien que la détection dans les cellules vivantes offre des détails cruciaux, ces méthodologies de détection reposent sur l’optique et les étiquettes, qui peuvent ne pas refléter la biologie native; ils sont également moins contrôlés que les méthodes in vitro et nécessitent une expertise spécialisée pour en effectuer15.
Les méthodes de calcul in silico sont principalement utilisées pour le criblage à grande échelle des molécules cibles avant les expériences in vitro . Les méthodes de prédiction computationnelle, les bases de données informatisées, l’amarrage moléculaire, les relations quantitatives structure-activité et d’autres approches de simulation de la dynamique moléculaire font partie des outils in silico bien établis16. Comparés à des techniques expérimentales laborieuses, les outils in silico peuvent facilement faire des prédictions avec une sensibilité élevée, mais avec une précision réduite dans les performances prédictives17.
Les essais in vitro sont effectués avec des micro-organismes ou des molécules biologiques en dehors de leur contexte biologique standard. La représentation des interactions biomoléculaires par des méthodes in vitro est essentielle à la compréhension des fonctions des protéines et de la biologie derrière le réseau complexe du fonctionnement cellulaire. La méthodologie de dosage préférée est choisie en fonction des propriétés intrinsèques de la protéine, des valeurs cinétiques et du mode et de l’intensité des interactions18,19.
L’interaction Hsp90/Cdc37 : La voie chaperon-kinase, reliant Hsp90 et Cdc37, est une cible thérapeutique prometteuse en biologie tumorale20. Hsp90 joue un rôle central dans le contrôle du cycle cellulaire, l’assemblage des protéines, la survie cellulaire et les voies de signalisation. Les protéines qui dépendent de Hsp90 pour leurs fonctions sont livrées à Hsp90 pour la complexation par un co-chaperon, tel que Cdc37. Le complexe Hsp90/Cdc37 contrôle le repliement de la plupart des protéines kinases et sert de plaque tournante pour une multitude de réseaux de signalisation intracellulaire21. C’est une cible antitumorale prometteuse en raison de son expression élevée dans diverses tumeurs malignes, y compris la leucémie myéloblastique aiguë, le myélome multiple et le carcinome hépatocellulaire22,23.
Techniques de détection d’interactions biomoléculaires in vitro couramment utilisées La co-immunoprécipitation (co-IP) est une technique qui repose sur la spécificité antigène-anticorps pour identifier les interactions biologiquement pertinentes24. Le principal inconvénient de cette méthode est son incapacité à détecter les interactions de faible affinité et les valeurs cinétiques24. Les méthodes biophysiques telles que la calorimétrie de titrage isotherme (ITC), la résonance plasmonique de surface (SPR), l’interférométrie biocouche (BLI) et la technologie FEB sont préférées pour déterminer les valeurs cinétiques.
ITC est une méthode de détection biophysique basée sur la détermination de l’énergie de liaison ainsi qu’une analyse thermodynamique complète pour caractériser les interactions biomoléculaires25. Le principal avantage de l’ITC est qu’il ne nécessite aucun marquage ou fixation de la protéine cible. Les principales difficultés rencontrées par l’ITC sont la forte concentration de protéines cibles requise pour une expérience et la difficulté d’analyser les complexes non covalents en raison de petites enthalpies de liaison26. Spr et BLI sont des techniques biophysiques sans étiquette qui reposent sur l’immobilisation de la molécule cible à la surface du capteur, suivie d’injections ultérieures de l’analyte sur la cible immobilisée27,28. Dans la SPR, les altérations de l’indice de réfraction au cours des interactions biomoléculaires sont mesurées27; dans BLI, l’interférence dans la lumière réfléchie est enregistrée en temps réel sous forme de changement de longueur d’onde en fonction du temps28. SPR et BLI partagent tous deux des avantages communs en offrant des capacités de spécificité, de sensibilité et de détection élevées29. Dans les deux méthodes, la protéine cible est immobilisée sur les surfaces des biocapteurs et, par conséquent, il peut y avoir une certaine perte de la conformation native de la cible, ce qui rend difficile la distinction entre les interactions spécifiques et non spécifiques30. BLI utilise des biocapteurs à fibre optique jetables coûteux pour immobiliser la cible, et est donc une technique coûteuse31. Par rapport à ces outils de détection biomoléculaire bien établis, la technologie FEB offre une plate-forme fiable et sans étiquette en utilisant de faibles concentrations nanomolaires pour la détection biomoléculaire en temps réel avec caractérisation cinétique. La technologie FEB surmonte également les défis bouillonnants rencontrés dans l’ITC et est plus rentable que SPR ou BLI.
Les biocapteurs à transistor à effet de champ (FET) sont un domaine émergent pour la détection des interactions biomoléculaires en offrant des applications biomédicales variées. Dans le système FET, les cibles sont immobilisées sur les puces de biocapteur et les interactions sont détectées par des changements de conductance32. La caractéristique unique à prendre en compte dans le développement d’un biocapteur électronique efficace réside dans les propriétés physico-chimiques telles que la nature semi-conductrice et la stabilité chimique du matériau de revêtement utilisé pour fabriquer la surface du capteur33. Les matériaux conventionnels comme le silicium utilisé pour le FET ont limité la sensibilité des capteurs car ils nécessitent des couches d’oxyde prises en sandwich entre le canal du transistor et un environnement spécifique pour un bon fonctionnement34. De plus, les transistors en silicium sont sensibles aux environnements riches en sel, ce qui rend difficile la mesure des interactions biologiques dans leur environnement naturel. Le biocapteur à base de graphène est présenté comme une alternative car il offre une excellente stabilité chimique et un champ électrique. Étant donné que le graphène est une seule couche atomique de carbone, il est à la fois extrêmement sensible en tant que semi-conducteur et chimiquement compatible avec les solutions biologiques; ces deux qualités sont souhaitables pour générer des biocapteurs électroniques compatibles35. Le remarquable potentiel de charge ultra-élevé des biomolécules offert par les biocapteurs revêtus de graphène conduit au développement de la technologie FEB des biocapteurs à base de graphène.
Principe de la technologie FEB: FEB est une technique de détection biomoléculaire sans étiquette qui mesure le courant électrique à travers le biocapteur de graphène auquel les cibles de liaison sont immobilisées. Les interactions entre la protéine immobilisée et l’analyte entraînent des altérations du courant qui sont surveillées en temps réel, ce qui permet des mesures cinétiques précises36.
Instrumentation : Le système FEB comprend une puce de capteur à transistor à effet de champ en graphène (gFET) et un lecteur électronique qui applique une tension constante tout au long de l’expérience (Figure 1). L’analyte est appliqué en solution sur la protéine cible immobilisée à la surface du biocapteur. Lorsqu’une interaction se produit, une altération du courant est mesurée et enregistrée en temps réel. Au fur et à mesure que la concentration de l’analyte augmente, la fraction d’analyte lié augmentera également, provoquant des alternances plus élevées dans le courant. À l’aide du logiciel d’analyse automatisé fourni avec l’instrument (Table des matériaux), I-Response est mesurée et enregistrée en termes d’unités de biodétection (BU)37. I-Response est définie comme l’altération du courant (I) à travers la puce de biocapteur mesurée en temps réel lors de l’interaction de la cible immobilisée avec l’analyte. Le logiciel d’analyse automatisé FEB peut analyser à la fois la réponse I et la réponse C aux événements d’interaction dynamique, où la réponse C enregistre les altérations de la capacité (C). Les variations de la réponse I et de la réponse C correspondent directement à la fraction de l’analyte lié et peuvent être analysées plus en détail pour générer des valeurs KD . La préférence par défaut du logiciel d’analyse automatisée est I-Response.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63495/63495fig01.jpg"> Figure 1: Vue d’ensemble de la configuration expérimentale. (A) Puce à base de graphène et lecteur électronique. (B) Une vue d’ensemble des composants de la puce. La puce est fixée à deux électrodes qui fournissent du courant au système. La surface de la puce est recouverte de graphène qui, lorsqu’il est activé, peut lier la cible. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63495/63495fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Méthodologie: Initialement, la puce de biocapteur activée est insérée dans le dispositif FEB (Figure 1) suivie de l’exécution des étapes décrites ci-dessous: (1) Étalonnage: L’expérience commence par l’étalonnage du système en utilisant 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS; pH = 7,4) pour créer la réponse d’équilibrage de base. (2) Association: L’analyte est introduit dans la puce et la réponse I est surveillée jusqu’à ce que la saturation de liaison soit atteinte. (3) Dissociation: L’analyte est dissocié à l’aide de 1x PBS. (4) Régénération: Les restes de l’analyte sont éliminés à l’aide de 1x PBS. (5) Lavage: Un total de cinq lavages sont effectués à l’aide de 1x PBS pour l’élimination complète des analytes liés et non liés de la puce.
Analyse: L’analyse des données est effectuée à l’aide du logiciel entièrement automatisé fourni avec l’instrument. Le logiciel d’analyse automatisé génère un diagramme d’ajustement de Hill avec une valeur KD . Le diagramme d’ajustement de Hill décrit l’association d’un analyte à la protéine cible en fonction des concentrations d’analyte. La concentration à laquelle une réponse demi-maximale est obtenue est proportionnelle à la valeur KD . Une valeur KD faible représente une affinité de liaison élevée et vice versa.
Pour valider les données obtenues à partir de l’expérience FEB, les réponses I sont extraites de chaque point de lecture pour chaque concentration d’analyte à l’aide du logiciel d’examen/exportation des données et peuvent être exportées vers d’autres logiciels d’analyse statistique (voir tableau des matériaux) comme expliqué ci-dessous.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated analysis software</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>biosensor chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data review software</td>
			<td>Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag</td>
			<td>CelluSep,&#160; Membrane filtration products</td>
			<td>T2-10-15 
			CAS number: NA</td>
			<td>T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm &#216;, 0.32ml/cm, 15m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>EDC160322-02 
			CAS number: 25952-53-8</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC (Isothermal titration calorimetry) system</td>
			<td>Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M3671-50G 
			CAS number: 4432-31-9</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Graphene-based chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline) X 10</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001623237500&#160; 
			CAS number: 7758-11-4</td>
			<td>Liquid transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipete</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11855231 
			CAS number: NA</td>
			<td>Finnpipette F3 5-50 &#181;L, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-002-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5))</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-003-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Cdc37</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab256157 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Hsp90 beta</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80033 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet</td>
			<td>Excel, Microsoft office</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>GraphPad, Prism</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NHS160321-07 
			CAS number: 106627-54-7</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td>Alex red</td>
			<td>LC 1093-800-000 
			CAS number: NA</td>
			<td>Tip 1-200 &#181;l, in bulk, 1,000 pcs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology

Les interactions biomoléculaires jouent un rôle polyvalent dans de nombreux processus cellulaires en régulant et en coordonnant des événements biologiques fonctionnellement pertinents. Les biomolécules telles que les protéines, les glucides, les vitamines, les acides gras, les acides nucléiques et les enzymes sont des éléments constitutifs fondamentaux des êtres vivants; ils s’assemblent en réseaux complexes dans les biosystèmes pour synchroniser une myriade d’événements de la vie. Les protéines utilisent généralement des réseaux d’interactomes complexes pour remplir leurs fonctions; il est donc obligatoire d’évaluer de telles interactions pour démêler leur importance dans les cellules aux niveaux cellulaire et de l’organisme. Pour atteindre cet objectif, nous introduisons une technologie en émergence rapide, la biodétection à effet de champ (FEB), pour déterminer des interactions biomoléculaires spécifiques. FEB est une technique de détection biomoléculaire fiable et sans étiquette de paillasse pour déterminer des interactions spécifiques et utilise des biocapteurs électroniques de haute qualité. La technologie FEB peut surveiller les interactions dans la gamme nanomolaire en raison des nanomatériaux biocompatibles utilisés sur sa surface de biocapteur. Comme preuve de concept, l’interaction protéine-protéine (IPP) entre la protéine de choc thermique 90 (Hsp90) et le cycle de division cellulaire 37 (Cdc37) a été élucidée. Hsp90 est un chaperon moléculaire dépendant de l’ATP qui joue un rôle essentiel dans le repliement, la stabilité, la maturation et le contrôle de la qualité de nombreuses protéines, régulant ainsi de multiples fonctions cellulaires vitales. Cdc37 est considéré comme un chaperon moléculaire spécifique à la protéine kinase, car il reconnaît et recrute spécifiquement les protéines kinases à Hsp90 pour réguler leurs voies de transduction du signal en aval. En tant que tel, Cdc37 est considéré comme un co-chaperon de Hsp90. La voie chaperon-kinase (complexe Hsp90/Cdc37) est hyper-activée dans de multiples tumeurs malignes favorisant la croissance cellulaire; par conséquent, c’est une cible potentielle pour le traitement du cancer. La présente étude démontre l’efficacité de la technologie FEB à l’aide du système modèle Hsp90/Cdc37. Feb a détecté un fort IPP entre les deux protéines (valeurs KD de 0,014 μM, 0,053 μM et 0,072 μM dans trois expériences indépendantes). En résumé, FEB est une plate-forme de détection PPI sans étiquette et rentable, qui offre des mesures rapides et précises.

Résultats de l’expérience 1 : La protéine cible Hsp90 (500 nM) a été immobilisée sur la puce en suivant le protocole d’immobilisation cible décrit ci-dessus. Pour la première expérience, 10 concentrations de la protéine analytique Cdc37, allant de 25 nM à 5 000 nM, ont été préparées sur la base des données disponibles dans la littérature (voir tableau 1).
Les étapes de l’expérience peuvent être surveillées en temps réel en suivan...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

La biodétection à effet de champ (FEB) est une technique sans étiquette permettant de détecter les interactions biomoléculaires. Il mesure le courant électrique à travers le biocapteur de graphène auquel les cibles de liaison sont immobilisées. La technologie FEB a été utilisée pour évaluer les interactions biomoléculaires entre Hsp90 et Cdc37 et une forte interaction entre les deux protéines a été détectée.

Exploration de l’interaction biomoléculaire entre le chaperon moléculaire Hsp90 et sa protéine cliente Kinase Cdc37 à l’aide de la technologie de biodétection à effet de champ

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

FEB est une plate-forme de détection d’interaction ______ _______ sans étiquette et rentable qui offre des mesures rapides et précises. Cette méthode offre une validation des interactions connues ou inconnues et un moyen facile de tester les inhibiteurs potentiels des interactions biomoléculaires. Le principal avantage de FEB est son logiciel automatisé et convivial qui porte l’utilisateur tout au long de l’expérience avec une plate-forme de pipetage à la main ouverte, permettant aux utilisateurs de travailler avec peu ou même pas de formation.La technologie FEB offre également des applications dans divers domaines des produits pharmaceutiques, de l’analyse biomoléculaire de petites molécules, peptides et protéines, de la validation de médicaments en traduisant facilement l’activité biologique in vitro en efficacité in vivo. En tant que débutant, vous pouvez rencontrer des défis dans le choix des bonnes concentrations d’analyte pour optimiser l’expérience afin d’obtenir une valeur KD fiable. Nous conseillons de prêter attention au processus de fonctionnalisation de la puce et à l’échange de tampon approprié.Commencez par mélanger des volumes égaux de solution d’EDC et de sulfo-NHS en pipetant de haut en bas. Placez la puce de biocapteur fournie par l’entreprise dans une boîte de Petri en verre avec un couvercle intégré. Toutes les étapes de fonctionnalisation impliquées dans l’activation de la puce sont suggérées à faire dans la boîte de Pétri.Appliquez 50 microlitres de tampon MES à une molaire sur la puce du biocapteur. Incuber pendant une minute à température ambiante. Ensuite, aspirez le tampon et appliquez 50 microlitres de solution EDC sulfo-NHS immédiatement sur la puce du capteur.Couvrir la boîte de Petri et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Aspirer la solution EDC sulfo-NHS de la puce et appliquer 50 microlitres de tampon MES à une molaire. Aspirez le tampon MES et rincez la puce deux fois avec 50 microlitres de 1X PBS.Aspirer le PBS de la puce et ajouter la molécule cible Hsp90. Couvrir la boîte de Petri en verre et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez la solution contenant la molécule cible et rincez trois fois avec 50 microlitres de 1X PBS.Aspirez la solution PBS 1X de la puce et ajoutez 50 microlitres de la solution de trempe. Couvrir la boîte de Petri en verre et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Aspirer la solution de trempe d’une puce et ajouter 50 microlitres de la solution de trempe deux.Couvrir la boîte de Petri en verre et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Après cela, aspirez la solution de trempe deux de la puce et rincez la puce cinq fois à l’aide de 50 microlitres de 1X PBS en laissant la dernière gouttelette PBS sur le capteur. Préparer la série de dilution de l’analyte pour Cdc37 dans la plage de concentration souhaitée.Concevez l’expérience pour inclure au moins huit concentrations d’analytes différentes afin d’obtenir une constante de dissociation fiable, ou valeur KD, et préparez ces différentes dilutions dans le même tampon utilisé pour l’étalonnage et la protéine cible. Placez soigneusement la puce sur l’instrument. Assurez-vous que le logiciel est allumé et que le voyant LED devient vert.Ensuite, appuyez sur le module Exécuter l’expérience sur le logiciel automatisé et choisissez 10 points avec régénération ou tout autre protocole souhaité. Renseignez les détails tels que le nom de l’opérateur, le nom de l’expérience, la date, le tampon de régénération, la cible immobilisée et l’analyte dans la solution. Appuyez sur le bouton Commencer l’expérience affiché sur le logiciel et suivez les instructions affichées par le logiciel automatisé.Pour effectuer l’étalonnage de l’instrument, aspirez la solution PBS restante de la puce et appliquez 50 microlitres du tampon d’étalonnage. Appuyez sur le bouton Continuer et attendez cinq minutes jusqu’à ce que l’étape d’étalonnage soit terminée. Le logiciel affiche le point de terminaison déterminé pour l’étape d’étalonnage avec une alarme d’avertissement à suivre.Ensuite, effectuez une association d’analyte en aspirant le tampon d’étalonnage de la puce et en appliquant 50 microlitres de la concentration d’analyte la plus faible. Appuyez sur le bouton Continuer et attendez cinq minutes jusqu’à ce que l’étape d’association soit terminée. Le logiciel affiche le point de fin de l’étape d’association avec une alarme d’avertissement pour continuer.Pour effectuer une dissociation d’analyte, aspirez la solution d’analyte de la puce et appliquez 50 microlitres du tampon de dissociation. Appuyez sur le bouton Continuer. Après la durée de l’étape de dissociation, le logiciel affiche le point de terminaison de l’étape de dissociation avec une alarme d’avertissement.Ensuite, effectuez la régénération de la puce en aspirant la solution de dissociation de la puce et en appliquant 50 microlitres du tampon de régénération. Ensuite, appuyez sur le bouton Continuer. L’étape de régénération prend généralement environ 30 secondes.Après cela, le logiciel affiche le point final de l’étape de régénération avec une alarme d’avertissement à suivre. Enfin, pour laver la puce, aspirez la solution de régénération de la puce et appliquez 50 microlitres du tampon de lavage. Aspirez la solution de la puce et répétez-la cinq fois.Laissez la dernière goutte du tampon de lavage sur la puce. Ensuite, appuyez sur le bouton Continuer et attendez 30 secondes jusqu’à ce que la durée de l’étape de lavage soit terminée sur l’écran du logiciel. Répétez les étapes pour chaque concentration d’analyte utilisée.Les cinq étapes de l’étalonnage, de l’association des analytes, de la dissociation, de la régénération et du lavage cinq fois constituent un cycle. Appuyez sur le bouton Analyse du logiciel d’analyse automatisé à la fin de l’expérience. Une fenêtre d’affichage contenant tous les points expérimentaux apparaîtra.S’assurer que les concentrations d’analyte utilisées pour le protocole prescrit sont correctes. Appuyez sur le bouton Exécuter l’analyse pour générer automatiquement la valeur KD. Le logiciel génère un diagramme d’ajustement en côte en traçant les concentrations d’analyte par rapport aux réponses I correspondantes à partir desquelles la constante de dissociation à l’équilibre est calculée.La protéine cible Hsp90 a été immobilisée sur la puce, et pour la première expérience, 10 concentrations de la protéine analytique Cdc37 allant de 25 nanomolaires à 5 000 nanomolaires ont été préparées. Les fichiers de données générés à partir de la première expérience ont été montrés ici. Les données expérimentales surveillées en temps réel sont présentées ici.L’axe Y correspond à la réponse I dans les unités de biocapteurs, et l’axe X correspond aux différents points temporels et concentrations de l’analyte dans l’expérience. L’image graphique présentée ici représente le tracé d’ajustement en pente généré par le logiciel d’analyse automatisé. L’axe Y correspond à la réponse I dans les unités de biocapteurs, et l’axe X correspond aux différentes concentrations d’analytes dans l’expérience.L’image graphique présentée ici représente le diagramme d’association généré à l’aide du logiciel d’analyse statistique. L’axe Y correspond à la réponse I à la fin de la phase d’association, et l’axe X correspond aux différentes concentrations de l’analyte Cdc37. Dans la deuxième expérience, un ensemble différent de concentrations allant de 0,4 nanomolaire à 200 nanomolaires a été utilisé, et les fichiers de données générés sont montrés ici.Les images graphiques représentent le thermogramme ITC de l’interaction Hsp90 et Cdc37. Voici les courbes correspondantes d’évolution de la chaleur obtenues grâce aux injections consécutives de Cdc37 dans Hsp90 à 298,15 Kelvin. La puissance différentielle utilisée ici est fonction du temps.Les points de données intégrés dans ce graphique désignent la chaleur normalisée correspondante par rapport au rapport de Mueller de Hsp90 à Cdc37. L’approche de pipetage ouvert utilisée ici exige que l’utilisateur ait une maîtrise de base du pipetage à la main, en veillant à ne pas toucher le biocapteur avec la pointe. La reproductibilité du chronométrage des étapes dépend entièrement de l’utilisateur.Une fois que le chercheur a caractérisé une interaction entre deux biomolécules, nous pouvons effectuer une expérience de dépistage en concevant des inhibiteurs ou des modulateurs potentiels ciblant l’interaction biomoléculaire spécifique à l’aide du système FEB. Cette procédure peut être utilisée pour identifier, vérifier et quantifier l’interaction connue et nouvelle entre les protéines, ainsi que les petites molécules, y compris les médicaments et les peptides.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Procédé pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de petites molécules de l&#39;interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Recherche

Biochimie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Dosage de l&#39;activité des protéines kinase avec ATP radiomarqué

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Isolement humain de neutrophile de sang périphérique pour interroger la voie de kinase LRRK2 associée de Parkinson en évaluant la phosphorylation de Rab10

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identification des substrats de Kinase CK2 roman en utilisant une approche biochimique polyvalente

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Étudier les Interactiens ARN de la protéine Kinase RNA-activé durant le Cycle cellulaire chez les mammifères

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Caractérisation au niveau moléculaire à l'aide d'approches biochimiques robustes d'une nouvelle protéine Kinase

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Dépistage de l'inhibiteur de kinase dans les microréseaux de protéines humaines auto-assemblés

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantification de la dynamique du réseau d'interaction des protéines à l'aide de la co-immunoprécipitation multiplexée

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Surveillance de la dynamique d’interaction protéine-ARN in vivo à haute résolution temporelle à l’aide de χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...