Name: exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology
Uploaded: 2022-03-31T13:40:00
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Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss der Binational Science Foundation (BSF) an S.K.S. und N.Q. unterstützt.

HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten rekombinanten Proteine, Hsp90 und Cdc37, wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle).
1. Chip-Aktivierung
HINWEIS: Alle Materialien, die im Experiment verwendet werden sollen, sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt. Filtern Sie alle vorbereiteten Lösungen durch einen sterilen 0,2-μm-Filter.
<ol><li>Es wird eine 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimi...

In dieser Studie wurde die Machbarkeit der Verwendung der FEB-Technologie (ein kinetischer Charakterisierungsansatz in Echtzeit) bewertet, um die biomolekulare Wechselwirkung zwischen Hsp90 und Cdc37 zu bestimmen. Das erste explorative Experiment (erstes Experiment) schlug vor, dass die Auswahl der richtigen Analytkonzentrationen ein kritischer Teil des Experiments ist und dass das Experiment durch Einbeziehung von Konzentrationspunkten über und unter dem KD-Wert entworfen werden sollte, die auf der Grundlage...

Biomolekulare Wechselwirkungen: Proteine sind wesentliche Bestandteile von Organismen und an zahlreichen molekularen Signalwegen wie Zellstoffwechsel, Zellstruktur, Zellsignalisierung, Immunantwort, Zelladhäsion und mehr beteiligt. Während einige Proteine ihre Funktion(en) unabhängig voneinander ausführen, interagieren die meisten Proteine mit anderen Proteinen über eine Bindungsgrenzfläche, um die richtige biologische Aktivität zu koordinieren1.
Biomolekulare Wechselwirkungen können hauptsächlich auf der Grundlage der unterschiedlichen strukturellen und funktionellen Eigenschaften der beteiligten Proteineklassifiziert werden 2, beispielsweise basierend auf den Proteinoberflächen, der komplexen Stabilität oder der Persistenz von Wechselwirkungen3. Die Identifizierung essentieller Proteine und ihrer Rolle in biomolekularen Wechselwirkungen ist entscheidend für das Verständnis biochemischer Mechanismen auf molekularer Ebene4. Derzeit gibt es verschiedene Ansätze, um diese Wechselwirkungen5 zu erkennen: in vitro 6, in silico7, in lebenden Zellen8, ex vivo 9 und in vivo10, wobei jede ihre eigenen Stärken und Schwächen hat. 
Die In-vivo-Assays werden unter Verwendung des gesamten Tieres als experimentelles Werkzeugdurchgeführt 11, unddie Ex-vivo-Assays werden an Gewebeextrakten oder ganzen Organen (z. B. Herz, Gehirn, Leber) in einer kontrollierten äußeren Umgebung durchgeführt, wobei die natürlichen Bedingungen nur minimal verändert werden. Die häufigste Anwendung von In-vivo- und Ex-vivo-Studien besteht darin, die pharmakokinetischen, pharmakodynamischen und toxischen Wirkungen potenzieller pharmakologischer Wirkstoffe vor Studien am Menschen zu bewerten, indem ihre allgemeine Sicherheit und Wirksamkeit sichergestelltwird 12.
Biomolekulare Wechselwirkungen können auch innerhalb lebender Zellen nachgewiesen werden. Die Bildgebung lebender Zellen ermöglicht es uns, dynamische Wechselwirkungen zu beobachten, während sie die Reaktionen eines bestimmten biochemischen Weges ausführen13. Darüber hinaus können Detektionstechniken wie Biolumineszenz oder Fluoreszenzresonanz-Energietransfer Informationen darüber liefern, wo und wann diese Wechselwirkungen innerhalb der Zelle auftreten14. Obwohl der Nachweis in lebenden Zellen entscheidende Details bietet, stützen sich diese Nachweismethoden auf Optik und Markierungen, die möglicherweise nicht die native Biologie widerspiegeln. Sie sind auch weniger kontrolliert als In-vitro-Methoden und erfordern spezielles Fachwissen, um15 durchzuführen.
Die In-silico-Berechnungsmethoden werden in erster Linie für das groß angelegte Screening von Zielmolekülen vor den In-vitro-Experimenten eingesetzt. Computergestützte Vorhersagemethoden, computergestützte Datenbanken, molekulares Docking, quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehungen und andere molekulardynamische Simulationsansätze gehören zu den etablierten In-silico-Werkzeugen 16. Im Vergleich zu mühsamen experimentellen Techniken können die In-silico-Werkzeuge leicht Vorhersagen mit hoher Empfindlichkeit, aber mit reduzierter Genauigkeit in der Vorhersageleistungtreffen 17.
In-vitro-Assays werden mit Mikroorganismen oder biologischen Molekülen außerhalb ihres biologischen Standardkontexts durchgeführt. Die Darstellung biomolekularer Interaktionen durch In-vitro-Methoden ist entscheidend für das Verständnis von Proteinfunktionen und der Biologie hinter dem komplexen Netzwerk der Zellfunktion. Die bevorzugte Assay-Methodik wird entsprechend den intrinsischen Eigenschaften des Proteins, den kinetischen Werten und dem Modus und der Intensität der Wechselwirkungenausgewählt 18,19.
Die Hsp90/Cdc37-Interaktion: Der Chaperon-Kinase-Signalweg, der Hsp90 und Cdc37 verbindet, ist ein vielversprechendes therapeutisches Ziel in der Tumorbiologie20. Hsp90 spielt eine zentrale Rolle bei der Kontrolle des Zellzyklus, der Proteinzusammenordnung, dem Zellüberleben und den Signalwegen. Proteine, die für ihre Funktionen auf Hsp90 angewiesen sind, werden zur Komplexierung durch ein Co-Chaperon wie Cdc37 an Hsp90 abgegeben. Der Hsp90/Cdc37-Komplex steuert die Faltung der meisten Proteinkinasen und dient als Drehscheibe für eine Vielzahl von intrazellulären Signalnetzwerken21. Es ist ein vielversprechendes Anti-Tumor-Ziel aufgrund seiner erhöhten Expression bei verschiedenen Malignomen, einschließlich akuter myeloblastischer Leukämie, multiplem Myelom und hepatozellulärem Karzinom22,23.
Häufig verwendete biomolekulare In-vitro-Interaktionsnachweistechniken Die Co-Immunpräzipitation (Co-IP) ist eine Technik, die sich auf die Spezifität von Antigen-Antikörpern stützt, um biologisch relevante Wechselwirkungen zu identifizieren24. Der Hauptnachteil dieser Methode ist ihre Unfähigkeit, Wechselwirkungen mit geringer Affinität und kinetische Werte zu erkennen24. Biophysikalische Methoden wie die isotherme Titrationkalorimetrie (ITC), die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), die Biolayer-Interferometrie (BLI) und die FEB-Technologie werden bevorzugt, um die kinetischen Werte zu bestimmen.
ITC ist eine biophysikalische Nachweismethode, die auf der Bestimmung der Bindungsenergie zusammen mit einer vollständigen thermodynamischen Analyse zur Charakterisierung biomolekularer Wechselwirkungenbasiert 25. Der Hauptvorteil von ITC besteht darin, dass keine Markierung oder Fixierung des Zielproteins erforderlich ist. Die Hauptschwierigkeiten, mit denen ITC konfrontiert ist, sind die hohe Konzentration des Zielproteins, die für ein Experiment erforderlich ist, und die Schwierigkeit, nicht-kovalente Komplexe aufgrund kleiner Bindungsenthalpienzu analysieren 26. Sowohl SPR als auch BLI sind markierungsfreie biophysikalische Techniken, die auf der Immobilisierung des Zielmoleküls auf der Sensoroberfläche beruhen, gefolgt von nachfolgenden Injektionen des Analyten über das immobilisierte Ziel27,28. Bei SPR werden Veränderungen des Brechungsindex während biomolekularer Wechselwirkungen gemessen27; In BLI wird die Interferenz im reflektierten Licht in Echtzeit als Änderung der Wellenlänge als Funktion der Zeit28 aufgezeichnet. Sowohl SPR als auch BLI haben gemeinsame Vorteile durch hohe Spezifität, Sensitivität und Erkennungsfunktionen29. Bei beiden Methoden wird das Zielprotein auf Biosensoroberflächen immobilisiert, und daher kann es zu einem gewissen Verlust der nativen Konformation des Ziels kommen, was es schwierig macht, zwischen spezifischen und unspezifischen Wechselwirkungenzu unterscheiden 30. BLI verwendet teure faseroptische Einweg-Biosensoren, um das Ziel zu immobilisieren, und ist daher eine kostspielige Technik31. Im Vergleich zu diesen etablierten biomolekularen Detektionswerkzeugen bietet die FEB-Technologie eine zuverlässige und markierungsfreie Plattform, indem sie niedrige nanomolare Konzentrationen für den biomolekularen Nachweis in Echtzeit mit kinetischer Charakterisierung verwendet. Die FEB-Technologie überwindet auch die sprudelnden Herausforderungen in der ITC und ist im Vergleich zu SPR oder BLI kostengünstiger.
Die auf dem Feldeffekttransistor (FET) basierenden Biosensoren sind ein aufstrebendes Gebiet zur Erkennung biomolekularer Wechselwirkungen, indem sie vielfältige biomedizinische Anwendungen anbieten. Im FET-System werden Ziele für die Biosensorchips immobilisiert und Wechselwirkungen durch Änderungen der Leitfähigkeit32 erkannt. Das Alleinstellungsmerkmal, das bei der Entwicklung eines effizienten elektronischen Biosensors zu berücksichtigen ist, sind die physikalisch-chemischen Eigenschaften wie die halbleitende Natur und die chemische Stabilität des Beschichtungsmaterials, das zur Herstellung der Sensoroberflächeverwendet wird 33. Herkömmliche Materialien wie Silizium, die für FET verwendet werden, haben die Empfindlichkeit von Sensoren eingeschränkt, da Oxidschichten zwischen dem Transistorkanal und einer spezifischen Umgebung für ein ordnungsgemäßes Funktionierenerforderlich sind 34. Darüber hinaus sind Siliziumtransistoren empfindlich gegenüber salzreichen Umgebungen, was es schwierig macht, biologische Wechselwirkungen in ihrer natürlichen Umgebung zu messen. Der graphenbasierte Biosensor wird als Alternative vorgestellt, da er eine hervorragende chemische Stabilität und ein elektrisches Feld bietet. Da Graphen eine einzelne Atomschicht aus Kohlenstoff ist, ist es sowohl als Halbleiter extrem empfindlich als auch chemisch mit biologischen Lösungen kompatibel; Beide Eigenschaften sind wünschenswert, um kompatible elektronische Biosensoren35 zu erzeugen. Das bemerkenswerte ultrahohe Belastungspotenzial von Biomolekülen, das graphenbeschichtete Biosensoren bieten, führte zur Entwicklung von graphenbasierten Biosensoren FEB-Technologie.
Prinzip der FEB-Technologie: FEB ist eine markierungsfreie biomolekulare Detektionstechnik, die den elektrischen Strom durch den Graphen-Biosensor misst, an den die Bindungsziele immobilisiert werden. Wechselwirkungen zwischen dem immobilisierten Protein und dem Analyten führen zu Stromänderungen, die in Echtzeit überwacht werden, was genaue kinetische Messungenermöglicht 36.
Instrumentierung: Das FEB-System besteht aus einem Graphen-Feldeffekttransistor (gFET)-Sensorchip und einem elektronischen Lesegerät, das während des gesamten Experiments eine konstante Spannung anlegt (Abbildung 1). Der Analyt wird in Lösung auf das Zielprotein aufgetragen, das auf der Biosensoroberfläche immobilisiert ist. Wenn eine Wechselwirkung auftritt, wird eine Veränderung des Stroms gemessen und in Echtzeit aufgezeichnet. Wenn die Analytkonzentration zunimmt, nimmt auch der Anteil des gebundenen Analyten zu, was zu höheren Veränderungen in der Strömung führt. Mit der mit dem Gerät gelieferten automatisierten Analysesoftware (Table of Materials) wird I-Response in Form von Biosensing-Einheiten (BU)37 gemessen und aufgezeichnet. I-Response ist definiert als die Veränderung des Stroms (I) durch den Biosensorchip, die in Echtzeit bei der Interaktion des immobilisierten Ziels mit dem Analyten gemessen wird. Die automatisierte Analysesoftware FEB kann sowohl die I-Response als auch die C-Response auf dynamische Interaktionsereignisse analysieren, wobei die C-Response die Änderungen der Kapazität (C) aufzeichnet. Die Variationen sowohl der I-Response als auch der C-Response entsprechen direkt dem Anteil des gebundenen Analyten und können weiter analysiert werden, um KD-Werte zu erzeugen. Die Standardeinstellung der automatisierten Analysesoftware ist I-Response.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63495/63495fig01.jpg"> Abbildung 1: Überblick über den Versuchsaufbau . (A) Chip auf Graphenbasis und ein elektronisches Lesegerät. (B) Eine Übersicht über die Chipkomponenten. Der Chip ist an zwei Elektroden befestigt, die das System mit Strom versorgen. Die Oberfläche des Chips ist mit Graphen bedeckt, das bei Aktivierung das Ziel binden kann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63495/63495fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Methodologie: Zunächst wird der aktivierte Biosensorchip in das FEB-Gerät eingesetzt (Abbildung 1), gefolgt von der Ausführung der folgenden Schritte: (1) Kalibrierung: Das Experiment beginnt mit der Systemkalibrierung unter Verwendung von 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; pH = 7,4), um die Ausgangsgleichgewichtsantwort zu erzeugen. (2) Assoziation: Der Analyt wird in den Chip eingeführt und die I-Antwort wird überwacht, bis die Bindungssättigung erreicht ist. (3) Dissoziation: Der Analyt wird mit 1x PBS dissoziiert. (4) Regeneration: Reste des Analyten werden mit 1x PBS entfernt. (5) Waschen: Insgesamt werden fünf Waschungen mit 1x PBS durchgeführt, um die gebundenen und ungebundenen Analyten gründlich vom Chip zu entfernen.
Analyse: Die Datenanalyse erfolgt mit der vollautomatischen Software, die mit dem Gerät geliefert wird. Die automatisierte Analysesoftware generiert ein Hill-Fit-Diagramm mit einem KD-Wert . Das Hill-Fit-Diagramm beschreibt die Assoziation eines Analyten mit dem Zielprotein als Funktion der Analytkonzentrationen. Die Konzentration, bei der ein halbmaximales Ansprechen erreicht wird, ist proportional zum KD-Wert . Ein niedriger KD-Wert steht für eine hohe Bindungsaffinität und umgekehrt.
Um die aus dem FEB-Experiment gewonnenen Daten zu validieren, werden I-Responses von jedem Auslesepunkt für jede Analytkonzentration mit der Datenüberprüfungs-/Exportsoftware extrahiert und können in andere statistische Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien) exportiert werden, wie unten erläutert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated analysis software</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>biosensor chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data review software</td>
			<td>Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag</td>
			<td>CelluSep,&#160; Membrane filtration products</td>
			<td>T2-10-15 
			CAS number: NA</td>
			<td>T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm &#216;, 0.32ml/cm, 15m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>EDC160322-02 
			CAS number: 25952-53-8</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC (Isothermal titration calorimetry) system</td>
			<td>Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M3671-50G 
			CAS number: 4432-31-9</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Graphene-based chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline) X 10</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001623237500&#160; 
			CAS number: 7758-11-4</td>
			<td>Liquid transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipete</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11855231 
			CAS number: NA</td>
			<td>Finnpipette F3 5-50 &#181;L, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-002-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5))</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-003-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Cdc37</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab256157 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Hsp90 beta</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80033 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet</td>
			<td>Excel, Microsoft office</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>GraphPad, Prism</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NHS160321-07 
			CAS number: 106627-54-7</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td>Alex red</td>
			<td>LC 1093-800-000 
			CAS number: NA</td>
			<td>Tip 1-200 &#181;l, in bulk, 1,000 pcs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology

Biomolekulare Wechselwirkungen spielen in zahlreichen zellulären Prozessen eine vielseitige Rolle, indem sie funktionell relevante biologische Ereignisse regulieren und koordinieren. Biomoleküle wie Proteine, Kohlenhydrate, Vitamine, Fettsäuren, Nukleinsäuren und Enzyme sind grundlegende Bausteine von Lebewesen; Sie fügen sich zu komplexen Netzwerken in Biosystemen zusammen, um eine Vielzahl von Lebensereignissen zu synchronisieren. Proteine nutzen typischerweise komplexe Interaktomnetzwerke, um ihre Funktionen auszuführen; Daher ist es zwingend erforderlich, solche Wechselwirkungen zu bewerten, um ihre Bedeutung in Zellen sowohl auf zellulärer als auch auf organismischer Ebene zu entschlüsseln. Um dieses Ziel zu erreichen, führen wir eine schnell aufstrebende Technologie ein, die Feldeffekt-Biosensorik (FEB), um spezifische biomolekulare Wechselwirkungen zu bestimmen. FEB ist eine Benchtop-, markierungsfreie und zuverlässige biomolekulare Detektionstechnik zur Bestimmung spezifischer Wechselwirkungen und verwendet hochwertige elektronisch-basierte Biosensoren. Die FEB-Technologie kann aufgrund der biokompatiblen Nanomaterialien, die auf ihrer Biosensoroberfläche verwendet werden, Wechselwirkungen im nanomolaren Bereich überwachen. Als Proof of Concept wurde die Protein-Protein-Interaktion (PPI) zwischen Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) und Zellteilungszyklus 37 (Cdc37) aufgeklärt. Hsp90 ist ein ATP-abhängiges molekulares Chaperon, das eine wesentliche Rolle bei der Faltung, Stabilität, Reifung und Qualitätskontrolle vieler Proteine spielt und dadurch mehrere lebenswichtige Zellfunktionen reguliert. Cdc37 gilt als Proteinkinase-spezifisches molekulares Chaperon, da es spezifisch Proteinkinasen zu Hsp90 erkennt und rekrutiert, um ihre nachgeschalteten Signaltransduktionswege zu regulieren. Daher gilt Cdc37 als Co-Chaperone von Hsp90. Der Chaperon-Kinase-Signalweg (Hsp90/Cdc37-Komplex) ist bei mehreren Malignomen, die das Zellwachstum fördern, hyperaktiviert; Daher ist es ein potenzielles Ziel für die Krebstherapie. Die vorliegende Studie demonstriert die Effizienz der FEB-Technologie anhand des Modellsystems Hsp90/Cdc37. FEB wies einen starken PPI zwischen den beiden Proteinen nach (K-D-Werte von 0,014 μM, 0,053 μM und 0,072 μM in drei unabhängigen Experimenten). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass FEB eine markierungsfreie und kostengünstige PPI-Erkennungsplattform ist, die schnelle und genaue Messungen ermöglicht.

Ergebnisse aus Experiment 1: Das Zielprotein Hsp90 (500 nM) wurde nach dem oben beschriebenen Zielimmobilisierungsprotokoll auf den Chip immobilisiert. Für das erste Experiment wurden 10 Konzentrationen des Analytproteins Cdc37 im Bereich von 25 nM bis 5.000 nM auf der Grundlage der in der Literatur verfügbaren Daten hergestellt (siehe Tabelle 1).
Die Schritte des Experiments können in Echtzeit überwacht werden, indem die in der I-Antwort auftretenden V...

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Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Field-Effect Biosensing (FEB) ist eine markierungsfreie Technik zum Nachweis biomolekularer Wechselwirkungen. Es misst den elektrischen Strom durch den Graphen-Biosensor, an den die Bindungsziele immobilisiert werden. Die FEB-Technologie wurde verwendet, um biomolekulare Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und Cdc37 zu bewerten und eine starke Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen wurde nachgewiesen.

Erforschung der biomolekularen Interaktion zwischen dem molekularen Chaperon Hsp90 und seiner Client-Proteinkinase Cdc37 unter Verwendung der Feldeffekt-Biosensortechnologie

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

FEB ist eine kennzeichnungsfreie und kostengünstige _________ Interaktionserkennungsplattform, die schnelle und genaue Messungen ermöglicht. Diese Methode bietet die Validierung bekannter oder unbekannter Wechselwirkungen und eine einfache Möglichkeit, auf potenzielle Inhibitoren der biomolekularen Wechselwirkungen zu testen. Der Hauptvorteil von FEB ist seine automatisierte, benutzerfreundliche Software, die den Benutzer während des gesamten Experiments mit einer offenen Handpipetting-Plattform begleitet, sodass Benutzer mit wenig oder sogar ohne Training arbeiten können.Die FEB-Technologie bietet auch Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Pharmazeutika, der biomolekularen Analyse von kleinen Molekülen, Peptiden und Proteinen, der Arzneimittelvalidierung durch die einfache Umsetzung biologischer In-vitro-Aktivität in die In-vivo-Wirksamkeit. Als Anfänger stehen Sie möglicherweise vor Herausforderungen bei der Auswahl der richtigen Analytkonzentrationen, um das Experiment zu optimieren und einen zuverlässigen KD-Wert zu erhalten. Wir empfehlen, auf den Chipfunktionalisierungsprozess und den richtigen Pufferaustausch zu achten.Beginnen Sie mit dem Mischen gleicher Volumina von EDC- und Sulfo-NHS-Lösung, indem Sie es nach oben und unten pipettieren. Legen Sie den vom Unternehmen gelieferten Biosensorchip in eine Glas-Petrischale mit montiertem Deckel. Es wird empfohlen, alle Funktionalisierungsschritte bei der Chipaktivierung in der Petrischale durchzuführen.Tragen Sie 50 Mikroliter einmolaren MES-Puffer auf den Biosensorchip auf. Eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren. Saugen Sie dann den Puffer ab und tragen Sie sofort 50 Mikroliter EDC-Sulfo-NHS-Lösung auf den Sensorchip auf.Die Petrischale abdecken und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Saugen Sie die EDC-Sulfo-NHS-Lösung aus dem Chip ab und wenden Sie 50 Mikroliter einmolaren MES-Puffer an. Saugen Sie den MES-Puffer ab und spülen Sie den Chip zweimal mit 50 Mikrolitern 1X PBS.Saugen Sie das PBS vom Chip ab und fügen Sie das Zielmolekül Hsp90 hinzu. Die Glas-Petrischale abdecken und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann aspirieren Sie die Lösung, die das Zielmolekül enthält, und spülen Sie sie dreimal mit 50 Mikrolitern 1X PBS ab.Saugen Sie die 1X PBS-Lösung vom Chip ab und fügen Sie 50 Mikroliter der Quench-One-Lösung hinzu. Die gläserne Petrischale abdecken und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Saugen Sie die Quench-One-Lösung aus dem Chip ab und fügen Sie 50 Mikroliter der Quench-Two-Lösung hinzu.Die gläserne Petrischale abdecken und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach saugen Sie die Abschrecklösung aus dem Chip und spülen Sie den Chip fünfmal mit 50 Mikrolitern 1X PBS ab, wobei der letzte PBS-Tröpfchen auf dem Sensor verbleibt. Bereiten Sie die Analytverdünnungsreihe für Cdc37 im gewünschten Konzentrationsbereich vor.Entwerfen Sie das Experiment so, dass es mindestens acht verschiedene Analytkonzentrationen umfasst, um eine zuverlässige Dissoziationskonstante oder einen KD-Wert zu erhalten, und bereiten Sie diese verschiedenen Verdünnungen im selben Puffer vor, der für die Kalibrierung und das Zielprotein verwendet wird. Platzieren Sie den Chip vorsichtig am Instrument. Stellen Sie sicher, dass die Software eingeschaltet ist und die LED-Anzeige grün leuchtet.Als nächstes drücken Sie das Run Experiment-Modul in der automatisierten Software und wählen Sie 10 Punkte mit Regeneration oder einem anderen gewünschten Protokoll. Geben Sie die Details wie Operatorname, Experimentname, Datum, Regenerationspuffer, immobilisiertes Ziel und den Analyten in Lösung ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment beginnen, die in der Software angezeigt wird, und folgen Sie den Anweisungen der automatisierten Software.Um die Gerätekalibrierung durchzuführen, saugen Sie die verbleibende PBS-Lösung vom Chip ab und tragen Sie 50 Mikroliter des Kalibrierpuffers auf. Drücken Sie die Taste Continue und warten Sie fünf Minuten, bis der Kalibrierungsschritt abgeschlossen ist. Die Software zeigt den für den Kalibrierungsschritt ermittelten Endpunkt mit einem Warnalarm zur Nachverfolgung an.Als nächstes führen Sie eine Analytassoziation durch, indem Sie den Kalibrierpuffer vom Chip absaugen und 50 Mikroliter der niedrigsten Analytkonzentration anwenden. Drücken Sie die Schaltfläche Weiter und warten Sie fünf Minuten, bis der Zuordnungsschritt abgeschlossen ist. Die Software zeigt den Endpunkt für den Assoziationsschritt mit einem Warnalarm an, um fortzufahren.Um eine Analytdissoziation durchzuführen, saugen Sie die Analytlösung vom Chip ab und wenden Sie 50 Mikroliter des Dissoziationspuffers an. Drücken Sie die Weiter-Taste. Nach der Dauer des Dissoziationsschritts zeigt die Software den Endpunkt für den Dissoziationsschritt mit einem Warnalarm an.Als nächstes führen Sie die Chipregeneration durch, indem Sie die Dissoziationslösung vom Chip absaugen und 50 Mikroliter des Regenerationspuffers anwenden. Drücken Sie dann die Schaltfläche Weiter. Der Regenerationsschritt dauert in der Regel etwa 30 Sekunden.Danach zeigt die Software den Endpunkt für den Regenerationsschritt mit einem Warnalarm an, der nachverfolgt werden muss. Zum Waschen des Chips die Regenerationslösung aus dem Chip absaugen und 50 Mikroliter des Waschpuffers auftragen. Saugen Sie die Lösung vom Chip ab und wiederholen Sie dies fünfmal.Lassen Sie den letzten Tropfen des Waschpuffers auf dem Chip. Drücken Sie dann die Continue-Taste und warten Sie 30 Sekunden, bis die Dauer des Waschschritts in der Softwareanzeige abgeschlossen ist. Wiederholen Sie die Schritte für jede verwendete Analytkonzentration.Die fünf Schritte der Kalibrierung, der Analytassoziation, der Dissoziation, der Regeneration und des fünfmaligen Waschens bilden einen Zyklus. Drücken Sie am Ende des Experiments die Analysetaste in der automatisierten Analysesoftware. Es erscheint ein Anzeigefenster mit allen experimentellen Punkten.Stellen Sie sicher, dass die für das vorgeschriebene Protokoll verwendeten Analytkonzentrationen korrekt sind. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analyse ausführen, um den KD-Wert automatisch zu generieren. Die Software erzeugt ein Hill-Fit-Diagramm, indem sie die Analytkonzentrationen gegen die entsprechenden I-Antworten aufzeichnet, aus denen die Dissoziationskonstante im Gleichgewicht berechnet wird.Das Zielprotein Hsp90 wurde auf den Chip immobilisiert, und für das erste Experiment wurden 10 Konzentrationen des Analytproteins Cdc37 im Bereich von 25 Nanomolaren bis 5.000 Nanomolaren hergestellt. Die aus dem ersten Experiment generierten Datendateien wurden hier gezeigt. Hier werden die in Echtzeit überwachten experimentellen Daten angezeigt.Die Y-Achse entspricht der I-Antwort in den Biosensoreinheiten, und die X-Achse entspricht den verschiedenen Zeitpunkten und Konzentrationen des Analyten im Experiment. Das hier gezeigte grafische Bild stellt das Hügelanpassungsdiagramm dar, das von der automatisierten Analysesoftware generiert wurde. Die Y-Achse entspricht der I-Antwort in den Biosensoreinheiten und die X-Achse entspricht den unterschiedlichen Analytkonzentrationen im Experiment.Das hier gezeigte grafische Bild stellt das mit der statistischen Analysesoftware generierte Assoziationsdiagramm dar. Die Y-Achse entspricht der I-Antwort am Ende der Assoziationsphase und die X-Achse den unterschiedlichen Konzentrationen des Analyten Cdc37. In Experiment zwei wurde ein anderer Satz von Konzentrationen im Bereich von 0,4 Nanomolar bis 200 Nanomolar verwendet, und die generierten Datendateien werden hier gezeigt.Die grafischen Bilder stellen das ITC-Thermogramm der Interaktion zwischen Hsp90 und Cdc37 dar. Hier sind die entsprechenden Wärmeentwicklungskurven dargestellt, die aufgrund der aufeinanderfolgenden Injektionen von Cdc37 in Hsp90 bei 298,15 Kelvin erhalten wurden. Die hier verwendete Differenzleistung ist eine Funktion der Zeit.Die integrierten Datenpunkte in diesem Diagramm bezeichnen die entsprechende normalisierte Wärme gegenüber dem Mueller-Verhältnis von Hsp90 zu Cdc37. Der hier verwendete offene Pipettieransatz erfordert, dass der Benutzer eine grundlegende Beherrschung des Handpipettierens hat und darauf achtet, den Biosensor nicht mit der Spitze zu berühren. Die Reproduzierbarkeit des Schritt-Timings hängt ganz vom Anwender ab.Sobald der Forscher eine Wechselwirkung zwischen zwei Biomolekülen charakterisiert, können wir ein Screening-Experiment durchführen, indem wir potenzielle Inhibitoren oder Modulatoren entwerfen, die auf die spezifische biomolekulare Wechselwirkung mit dem FEB-System abzielen. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um bekannte und neuartige Wechselwirkungen zwischen Proteinen sowie kleinen Molekülen, einschließlich Arzneimitteln und Peptiden, zu identifizieren, zu verifizieren und zu quantifizieren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Forschung

Biochemie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Human periphere Blut Neutrophil Isolation für die Verhör der Parkinson-assoziierten LRRK2 Kinase Weg durch Bewertung Rab10 Phosphorylierung

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studium der RNA Interaktoren des RNA während der Säugetier-Zelle Zyklus aktiviert Proteinkinase

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantifizierung der Protein-Interaktionsnetzwerkdynamik mit Multiplex-Co-Immunopräzipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Überwachung der Protein-RNA-Interaktionsdynamik in vivo mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung von χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...