Name: exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology
Uploaded: 2022-03-31T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

מחקר זה נתמך על ידי מענק מהקרן הדו-לאומית למדע (BSF) ל- S.K.S. ו- N.Q.

הערה: החלבונים הרקומביננטיים ששימשו במחקר זה, Hsp90 ו-Cdc37, התקבלו באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים).
1. הפעלת שבב
הערה: כל החומרים שיש להשתמש בהם בניסוי מפורטים בטבלת החומרים. סנן את כל הפתרונות המוכנים באמצעות מסנן סטרילי של 0.2 מיקרומטר.
<ol>...

במחקר זה הוערכה ההיתכנות של שימוש בטכנולוגיית FEB (גישת אפיון קינטי בזמן אמת) כדי לקבוע את האינטראקציה הביומולקולרית בין Hsp90 ל-Cdc37. ניסוי החקר הראשוני (הניסוי הראשון) הציע כי בחירת ריכוזי האנליטים הנכונים היא חלק קריטי בניסוי וכי יש לתכנן את הניסוי על ידי הכללת נקודות ריכוז מעל ומתחת לערך K...

אינטראקציות ביומולקולריות: חלבונים הם חלקים חיוניים של אורגניזמים ומשתתפים במסלולים מולקולריים רבים כגון חילוף חומרים של תאים, מבנה התא, איתות תאים, תגובות חיסוניות, הידבקות תאים ועוד. בעוד שחלבונים מסוימים מבצעים את תפקידם באופן עצמאי, רוב החלבונים מקיימים אינטראקציה עם חלבונים אחרים באמצעות ממשק מקשר כדי לתאם פעילות ביולוגית תקינה1.
ניתן לסווג אינטראקציות ביומולקולריות בעיקר על סמך המאפיינים המבניים והתפקודיים המובהקים של חלבונים המעורבים2, למשל, בהתבסס על משטחי החלבון, היציבות המורכבת או ההתמדה של אינטראקציות3. זיהוי חלבונים חיוניים ותפקידם באינטראקציות ביומולקולריות הוא חיוני להבנת מנגנונים ביוכימיים ברמה המולקולרית4. נכון לעכשיו, ישנן גישות שונות לזיהוי אינטראקציות אלה5: in vitro6, בסיליקו7, בתאים חיים8, ex vivo9, ו in vivo10 כאשר לכל אחד מהם יש חוזקות וחולשות משלו.
מבחני in vivo מבוצעים תוך שימוש בחיה כולה ככלי ניסיוני11, ומבחניה- ex vivo מבוצעים על תמציות רקמה או על איברים שלמים (למשל, לב, מוח, כבד) בסביבה חיצונית מבוקרת על ידי מתן שינויים מינימליים בתנאים טבעיים. היישום הנפוץ ביותר של מחקרי in vivo ו - ex vivo הוא להעריך את הפרמקוקינטיקה, הפרמקודינמיקה והשפעות הרעילות של חומרים פרמקולוגיים פוטנציאליים לפני ניסויים בבני אדם על ידי הבטחת הבטיחות והיעילות הכוללות שלהם12.
ניתן לזהות אינטראקציות ביומולקולריות גם בתוך תאים חיים. הדמיית תאים חיים מאפשרת לנו לצפות באינטראקציות דינמיות בזמן שהם מבצעים את התגובות של מסלול ביוכימי מסוים13. יתר על כן, טכניקות זיהוי, כגון ביולומינסנציה או העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית, יכולות לספק מידע על היכן ומתי אינטראקציות אלה מתרחשות בתוך תא14. אף על פי שזיהוי בתאים חיים מציע פרטים חיוניים, מתודולוגיות זיהוי אלה מסתמכות על אופטיקה ותוויות, שייתכן שאינן משקפות את הביולוגיה המקורית; הם גם פחות מבוקרים משיטות במבחנה ודורשים מומחיות מיוחדת כדי לבצע15.
השיטות החישוביות של in silico משמשות בעיקר לסינון בקנה מידה גדול של מולקולות מטרה לפני הניסויים במבחנה . שיטות חיזוי חישוביות, מסדי נתונים מבוססי מחשב, עגינה מולקולרית, יחסי מבנה-פעילות כמותיים וגישות סימולציה אחרות של דינמיקה מולקולרית הם בין המבוססים היטב בכלי סיליקו 16. בהשוואה לטכניקות ניסיוניות מייגעות, הכלים בסיליקו יכולים בקלות לבצע תחזיות עם רגישות גבוהה, אך עם דיוק מופחת בביצועי החיזוי17.
בדיקות במבחנה מבוצעות עם מיקרואורגניזמים או מולקולות ביולוגיות מחוץ להקשר הביולוגי הסטנדרטי שלהם. הצגת אינטראקציות ביומולקולריות באמצעות שיטות במבחנה היא קריטית להבנת תפקודי החלבון והביולוגיה שמאחורי הרשת המורכבת של תפקוד התאים. מתודולוגיית הבדיקה המועדפת נבחרת על פי התכונות הפנימיות של החלבון, הערכים הקינטיים והאופן והעוצמה של האינטראקציות18,19.
האינטראקציה Hsp90/Cdc37: מסלול המלווה-קינאז, המחבר בין Hsp90 ל-Cdc37, הוא מטרה טיפולית מבטיחה בביולוגיה של הגידול20. Hsp90 ממלא תפקיד מרכזי בבקרת מחזור התא, בהרכבת חלבונים, בהישרדות התאים ובמסלולי איתות. חלבונים המסתמכים על Hsp90 לצורך תפקודם מועברים ל-Hsp90 לצורך קומפלקסציה באמצעות מלווה משותף, כגון Cdc37. קומפלקס Hsp90/Cdc37 שולט בקיפול של רוב החלבון קינאזות ומשמש כמרכז לשלל רשתות איתותתוך-תאיות 21. זוהי מטרה אנטי-סרטנית מבטיחה בשל הביטוי המוגבה שלה בממאירות שונות, כולל לוקמיה מיאלובלסטית חריפה, מיאלומה נפוצה וקרצינומה הפטוצלולרית22,23.
טכניקות נפוצות לזיהוי אינטראקציה ביומולקולרית במבחנה Co-immunoprecipitation (co-IP) היא טכניקה המסתמכת על ספציפיות אנטיגן-נוגדנים כדי לזהות אינטראקציות רלוונטיות ביולוגית24. החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא חוסר היכולת שלה לזהות אינטראקציות בעלות זיקה נמוכה וערכים קינטיים24. שיטות ביופיזיות כגון קלורימטריה איזותרמית של טיטרציה (ITC), תהודת פלסמון פני השטח (SPR), אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) וטכנולוגיית FEB עדיפות לקביעת הערכים הקינטיים.
ITC היא שיטת זיהוי ביו-פיזיקלית המבוססת על קביעת אנרגיית קשירת יחד עם ניתוח תרמודינמיקה מלא לאפיון אינטראקציות ביומולקולריות25. היתרון העיקרי של ITC הוא שהוא אינו דורש כל תיוג או קיבוע של חלבון המטרה. הקשיים העיקריים שבהם נתקל ITC הם הריכוז הגבוה של חלבון המטרה הנדרש לניסוי אחד והקושי לנתח קומפלקסים לא קוולנטיים עקב אנתלפיות קישור קטנות26. גם SPR וגם BLI הן טכניקות ביופיזיות נטולות תוויות המסתמכות על אימוביליזציה של מולקולת המטרה על משטח החיישנים, ולאחר מכן זריקות של האנליט מעל המטרה המשותקת27,28. ב- SPR, שינויים במקדם השבירה במהלך אינטראקציות ביומולקולריות נמדדים27; ב-BLI, ההתאבכות באור המוחזר נרשמת בזמן אמת כשינוי באורך הגל כפונקציה של הזמן28. גם SPR וגם BLI חולקים יתרונות משותפים של הצעת יכולות ספציפיות, רגישות וזיהוי גבוהות29. בשתי השיטות, חלבון המטרה משותק על משטחי ביוסנסור, ולכן, ייתכן שיש אובדן מסוים של הקונפורמציה הטבעית של המטרה, מה שמקשה על הבחנה בין אינטראקציות ספציפיות לעומת לא ספציפיות30. BLI משתמשת בביו-סנסורים חד-פעמיים חד-פעמיים יקרים כדי לשתק את המטרה, ולכן היא טכניקה יקרה31. בהשוואה לכלי זיהוי ביומולקולריים מבוססים אלה, טכנולוגיית FEB מציעה פלטפורמה אמינה ונטולת תוויות על ידי שימוש בריכוזי ננומולארים נמוכים לזיהוי ביומולקולרי בזמן אמת עם אפיון קינטי. טכנולוגיית FEB גם מתגברת על האתגרים המבעבעים העומדים בפני ITC והיא חסכונית יותר בהשוואה ל- SPR או BLI.
ביוסנסורים מבוססי טרנזיסטור בעל אפקט שדה (FET) הוא תחום מתפתח לאיתור אינטראקציות ביומולקולריות על ידי הצעת יישומים ביו-רפואיים מגוונים. במערכת FET, מטרות משותקות לשבבי הביו-סנסור ואינטראקציות מזוהות על ידי שינויים בהולכה32. התכונה הייחודית שיש לקחת בחשבון בפיתוח ביוסנסור אלקטרוני יעיל היא התכונות הפיזיקוכימיות כגון האופי המוליך למחצה והיציבות הכימית של חומר הציפוי המשמש לייצור משטח החיישן33. חומרים קונבנציונליים כמו סיליקון המשמש ל-FET הגבילו את הרגישות של חיישנים משום שהם דורשים שכבות תחמוצת דחוקות בין תעלת הטרנזיסטור לבין סביבה מסוימת לתפקוד תקיןשל 34. יתר על כן, טרנזיסטורים של סיליקון רגישים לסביבות מלח גבוהות, ובכך מקשים על מדידת אינטראקציות ביולוגיות בסביבתם הטבעית. הביוסנסור מבוסס הגרפן מוצג כחלופה מכיוון שהוא מציע יציבות כימית מעולה ושדה חשמלי. מאחר שגרפן הוא שכבה אטומית יחידה של פחמן, הוא גם רגיש ביותר כמוליכה למחצה וגם תואם כימית לתמיסות ביולוגיות; שתי התכונות הללו רצויות כדי ליצור ביוסנסורים אלקטרוניים תואמים35. פוטנציאל ההעמסה האולטרה-גבוה המדהים של ביו-מולקולות המוצע על ידי ביוסנסורים מצופים גרפן מוביל לפיתוח טכנולוגיית FEB מבוססת-גרפן.
עקרון טכנולוגיית FEB: FEB היא טכניקת זיהוי ביומולקולרית נטולת תוויות המודדת את הזרם החשמלי דרך הביו-סנסור של הגרפן שאליו משותקות מטרות הקישור. אינטראקציות בין החלבון המשותק לבין האנליט גורמות לשינויים בזרם המנוטרים בזמן אמת, ומאפשרים מדידות קינטיות מדויקות36.
מכשור: מערכת FEB כוללת שבב חיישן טרנזיסטור בעל אפקט שדה גרפן (gFET) וקורא אלקטרוני שמפעיל מתח קבוע לאורך כל הניסוי (איור 1). האנליט מיושם בתמיסה על חלבון המטרה המשותק על פני השטח של הביו-סנסור. כאשר מתרחשת אינטראקציה, שינוי בזרם נמדד ומתועד בזמן אמת. ככל שריכוז האנליטים עולה, גם החלק של האנליט המאוגד יגדל, מה שיגרום לחילופים גבוהים יותר בזרם. באמצעות תוכנת הניתוח האוטומטית המסופקת עם המכשיר (טבלת החומרים), I-Response נמדדת ומתועדת במונחים של יחידות ביוסנסינג (BU)37. I-Response מוגדר כשינוי בזרם (I) באמצעות שבב הביו-סנסור הנמדד בזמן אמת על סמך האינטראקציה של המטרה המשותקת עם האנליט. תוכנת הניתוח האוטומטית FEB יכולה לנתח הן את ה-I-Response והן את ה-C-Response לאירועי אינטראקציה דינמיים, כאשר ה-C-Response מתעד את השינויים בקיבוליות (C). הווריאציות הן ב-I-Response והן ב-C-Response מתאימות ישירות לשבריר של האנליט המאוגד וניתן לנתח אותן עוד יותר כדי ליצור ערכי KD . העדפת ברירת המחדל של תוכנת הניתוח האוטומטית היא I-Response.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63495/63495fig01.jpg"> איור 1: סקירה כללית של מערך הניסוי. (B) סקירה כללית של רכיבי השבב. השבב מחובר לשתי אלקטרודות המספקות זרם למערכת. פני השטח של השבב מכוסים בגרפן, שכאשר הוא מופעל יכול לקשור את המטרה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63495/63495fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
מתודולוגיה: בתחילה, שבב הביוסנסור המופעל מוכנס למכשיר FEB (איור 1) ולאחר מכן ביצוע השלבים המתוארים להלן: (1) כיול: (1) כיול: הניסוי מתחיל בכיול המערכת באמצעות 1x מי מלח עם מאגר פוספט (PBS; pH = 7.4) כדי ליצור את תגובת שיווי המשקל הבסיסית. (2) שיוך: האנליט מוצג בשבב, וה-I-Response מנוטר עד להגשמת רוויית הקשירה. (3) דיסוציאציה: האנליט מנותק באמצעות 1x PBS. (4) התחדשות: שרידי האנליט מוסרים באמצעות 1x PBS. (5) כביסה: בסך הכל חמש שטיפות מבוצעות באמצעות 1x PBS להסרה יסודית של האנליטים הכבולים והלא מאוגדים מהשבב.
ניתוח: ניתוח הנתונים מתבצע באמצעות התוכנה האוטומטית לחלוטין המסופקת עם המכשיר. תוכנת הניתוח האוטומטית יוצרת עלילת היל פיט עם ערך KD . עלילת ההתאמה של היל מתארת את הקשר של אנליט לחלבון המטרה כפונקציה של ריכוזי אנליטים. הריכוז שבו מושגת תגובה חצי מקסימלית הוא פרופורציונלי לערך KD . ערך KD נמוך מייצג זיקת קשירה גבוהה ולהיפך.
כדי לאמת את הנתונים המתקבלים מניסוי FEB, תגובות I מופקות מכל נקודת קריאה עבור כל ריכוז אנאליטים באמצעות תוכנת סקירת/ייצוא הנתונים וניתן לייצא אותן לתוכנות ניתוח סטטיסטיות אחרות (ראה טבלת חומרים) כפי שיוסבר להלן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated analysis software</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>biosensor chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data review software</td>
			<td>Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag</td>
			<td>CelluSep,&#160; Membrane filtration products</td>
			<td>T2-10-15 
			CAS number: NA</td>
			<td>T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm &#216;, 0.32ml/cm, 15m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>EDC160322-02 
			CAS number: 25952-53-8</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC (Isothermal titration calorimetry) system</td>
			<td>Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M3671-50G 
			CAS number: 4432-31-9</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Graphene-based chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline) X 10</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001623237500&#160; 
			CAS number: 7758-11-4</td>
			<td>Liquid transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipete</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11855231 
			CAS number: NA</td>
			<td>Finnpipette F3 5-50 &#181;L, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-002-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5))</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-003-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Cdc37</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab256157 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Hsp90 beta</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80033 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet</td>
			<td>Excel, Microsoft office</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>GraphPad, Prism</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NHS160321-07 
			CAS number: 106627-54-7</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td>Alex red</td>
			<td>LC 1093-800-000 
			CAS number: NA</td>
			<td>Tip 1-200 &#181;l, in bulk, 1,000 pcs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology

אינטראקציות ביומולקולריות ממלאות תפקידים רב-תכליתיים בתהליכים תאיים רבים על-ידי ויסות ותיאום של אירועים ביולוגיים רלוונטיים מבחינה תפקודית. ביו-מולקולות כגון חלבונים, פחמימות, ויטמינים, חומצות שומן, חומצות גרעין ואנזימים הם אבני בניין בסיסיות של יצורים חיים; הם מתכנסים לרשתות מורכבות במערכות ביולוגיות כדי לסנכרן מספר עצום של אירועי חיים. חלבונים בדרך כלל משתמשים ברשתות אינטראקציה מורכבות כדי לבצע את תפקידיהם; לפיכך חובה להעריך אינטראקציות כאלה כדי לפענח את חשיבותן בתאים הן ברמת התא והן ברמת האורגניזם. לקראת מטרה זו, אנו מציגים טכנולוגיה המתפתחת במהירות, ביוסנסינג בעל אפקט שדה (FEB), כדי לקבוע אינטראקציות ביומולקולריות ספציפיות. FEB היא טכניקת זיהוי ביומולקולרית, נטולת תוויות ואמינה לקביעת אינטראקציות ספציפיות ומשתמשת בביו-סנסורים מבוססי אלקטרוניקה באיכות גבוהה. טכנולוגיית FEB יכולה לנטר אינטראקציות בטווח הננו-מולארי בשל הננו-חומרים הניתנים להתאמה ביולוגית המשמשים על פני השטח של הביו-סנסור שלה. כהוכחת היתכנות, הוברה האינטראקציה בין חלבון-חלבון (PPI) בין חלבון הלם חום 90 (Hsp90) לבין מחזור חלוקת התא 37 (Cdc37). Hsp90 הוא מלווה מולקולרי תלוי ATP הממלא תפקיד חיוני בקיפול, יציבות, התבגרות ובקרת איכות של חלבונים רבים, ובכך מווסת פונקציות תאיות חיוניות מרובות. Cdc37 נחשב למלווה מולקולרי ספציפי לחלבון קינאז, מכיוון שהוא מזהה ומגייס באופן ספציפי קינאזות חלבונים ל-Hsp90 כדי לווסת את מסלולי התמרת האותות במורד הזרם. ככזה, Cdc37 נחשב למלווה משותף של Hsp90. מסלול המלווה-קינאז (קומפלקס Hsp90/Cdc37) מופעל יתר על המידה בממאירות מרובה המקדמת את צמיחת התאים; לכן, זהו יעד פוטנציאלי לטיפול בסרטן. המחקר הנוכחי מדגים את היעילות של טכנולוגיית FEB באמצעות מערכת המודל Hsp90/Cdc37. FEB זיהה PPI חזק בין שני החלבונים (ערכי KD של 0.014 μM, 0.053 μM ו-0.072 μM בשלושה ניסויים בלתי תלויים). לסיכום, FEB היא פלטפורמת זיהוי PPI ללא תווית וחסכונית, המציעה מדידות מהירות ומדויקות.

תוצאות מניסוי 1: חלבון המטרה Hsp90 (500 ננומטר) היה משותק לשבב בעקבות פרוטוקול אימוביליזציה של המטרה כפי שתואר לעיל. עבור הניסוי הראשון הוכנו 10 ריכוזים של חלבון האנאליטים, Cdc37, שנעו בין 25 ננומטר ל-5,000 ננומטר, בהתבסס על הנתונים הזמינים בספרות (ראו טבלה 1).
ניתן לעק...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

ביוסנסינג של אפקט שדה (FEB) היא טכניקה נטולת תוויות לאיתור אינטראקציות ביומולקולריות. הוא מודד את הזרם החשמלי דרך הביו-סנסור של הגרפן שאליו משותקות מטרות הקשירה. טכנולוגיית FEB שימשה להערכת אינטראקציות ביומולקולריות בין Hsp90 ל-Cdc37 וזוהתה אינטראקציה חזקה בין שני החלבונים.

חקר האינטראקציה הביומולקולרית בין המלווה המולקולרי Hsp90 לבין חלבון הלקוח שלו Kinase Cdc37 באמצעות טכנולוגיית ביוסנסינג בעלת אפקט שדה

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

FEB היא פלטפורמת זיהוי אינטראקציות _____ __ ללא תווית וחסכונית המציעה מדידות מהירות ומדויקות. שיטה זו מציעה אימות של אינטראקציות ידועות או לא ידועות ודרך קלה לבדוק מעכבים פוטנציאליים של האינטראקציות הביומולקולריות. היתרון העיקרי של FEB הוא התוכנה האוטומטית והידידותית למשתמש שלה, אשר משערת את המשתמש לאורך כל הניסוי עם פלטפורמת צנרת פתוחה ביד, ומאפשרת למשתמשים לעבוד עם מעט או אפילו ללא הכשרה.טכנולוגיית FEB מציעה גם יישומים בתחומים מגוונים של תרופות, ניתוח ביומולקולרי של מולקולות קטנות, פפטידים וחלבונים, אימות תרופות על ידי תרגום פעילות ביולוגית חוץ גופית בקלות ליעילות in vivo. בהיותך מתחיל, אתה עלול להתמודד עם אתגרים בבחירת ריכוזי האנליט הנכונים כדי לייעל את הניסוי כדי לקבל ערך KD אמין. אנו ממליצים לתת תשומת לב לתהליך פונקציונליזציה של השבב ולהחלפת מאגר נכונה.התחל על ידי ערבוב נפחים שווים של תמיסת EDC וסולפו-NHS על ידי צנרת למעלה ולמטה. מניחים את שבב הביוסנסור המסופק על ידי החברה בצלחת פטרי מזכוכית עם מכסה מותאם. כל שלבי הפונקציונליזציה הכרוכים בהפעלת שבבים מוצעים להיעשות בתוך צלחת פטרי.החל 50 מיקרוליטרים של מאגר MES טוחן אחד על שבב הביוסנסור. דגירה לדקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאפו את המאגר והחלו 50 מיקרוליטרים של תמיסת EDC sulfo-NHS באופן מיידי על שבב החיישן.מכסים את צלחת הפטרי ודוגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את פתרון ה-EDC sulfo-NHS מהשבב והחלו 50 מיקרוליטרים של מאגר MES טוחן אחד. שאפו למאגר MES ושטפו את השבב פעמיים עם 50 מיקרוליטרים של 1X PBS.שאפו את ה-PBS מהשבב והוסיפו את מולקולת המטרה Hsp90. כסו את צלחת הפטרי מזכוכית ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאפו לתמיסה המכילה את מולקולת המטרה ושטפו שלוש פעמים עם 50 מיקרוליטרים של 1X PBS.שאפו את פתרון ה-1X PBS מהשבב והוסיפו 50 מיקרוליטרים של פתרון ה-quench one. מכסים את צלחת הפטרי הזכוכית ודגורים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את תמיסת ה-quench One מהשבב והוסיפו 50 מיקרוליטרים של תמיסת quench two.מכסים את צלחת הפטרי הזכוכית ודגורים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאפו את תמיסת המרווה שתיים מהשבב ושטפו את השבב חמש פעמים באמצעות 50 מיקרוליטרים של 1X PBS והשאירו את טיפת ה-PBS האחרונה על החיישן. הכן את סדרת דילול האנליטים עבור Cdc37 בטווח הריכוז הרצוי.תכנן את הניסוי כך שיכלול לפחות שמונה ריכוזי אנאליטים שונים כדי לקבל קבוע דיסוציאציה אמין, או ערך KD, והכן את הדילולים השונים האלה באותו מאגר המשמש לכיול וחלבון מטרה. הניחו את השבב בזהירות על המכשיר. ודא שהתוכנה דולקת ונורית ה- LED הופכת לירוקה.לאחר מכן, לחץ על מודול הפעל ניסוי בתוכנה האוטומטית ובחר 10 נקודות עם התחדשות או כל פרוטוקול רצוי אחר. מלא את הפרטים כגון שם המפעיל, שם הניסוי, תאריך, מאגר ההתחדשות, המטרה המשותקת והאנליזה בתמיסה. לחץ על לחצן התחל ניסוי המוצג בתוכנה ופעל לפי ההוראות המוצגות על-ידי התוכנה האוטומטית.כדי לבצע את כיול המכשיר, שאפו את פתרון ה-PBS הנותר מהשבב והחלו 50 מיקרוליטרים של מאגר הכיול. לחץ על לחצן המשך והמתן חמש דקות עד ששלב הכיול יסתיים. התוכנה מציגה את נקודת הקצה שנקבעה לשלב הכיול עם אזעקת אזהרה למעקב.לאחר מכן, בצע קשר אנאליט על ידי שאיפת חיץ הכיול מהשבב והחלת 50 מיקרוליטרים של ריכוז האנאליטים הנמוך ביותר. לחץ על לחצן המשך והמתן חמש דקות עד לסיום שלב האסוציאציה. התוכנה מציגה את נקודת הסיום של שלב השיוך עם אזעקת אזהרה להמשך.כדי לבצע דיסוציאציה אנאליטית, שאפו את תמיסת האנליט מהשבב והחלו 50 מיקרוליטרים של מאגר הדיסוציאציה. לחץ על לחצן המשך. לאחר משך שלב הדיסוציאציה, התוכנה מציגה את נקודת הקצה של שלב הדיסוציאציה באמצעות אזעקת אזהרה.לאחר מכן, בצע התחדשות שבבים על ידי שאיפת פתרון הדיסוציאציה מהשבב והחלת 50 מיקרוליטרים של מאגר ההתחדשות. לאחר מכן, לחץ על הלחצן המשך. שלב ההתחדשות נמשך בדרך כלל כ-30 שניות עד לסיום.לאחר מכן, התוכנה מציגה את נקודת הסיום של שלב ההתחדשות עם אזעקת אזהרה למעקב. לבסוף, כדי לשטוף את השבב, לשאוף את פתרון ההתחדשות מן השבב ולהחיל 50 microliters של חיץ לשטוף. לשאוף את הפתרון מן השבב ולחזור על זה חמש פעמים.השאירו את הטיפה האחרונה של מאגר הכביסה על השבב. לאחר מכן, לחץ על המשך כפתור והמתן 30 שניות עד שמשך שלב הכביסה יסתיים בתצוגת התוכנה. חזור על השלבים עבור כל ריכוז אנאליט שבו נעשה שימוש.חמשת השלבים של הכיול, הקשר האנליטי, הדיסוציאציה, ההתחדשות והשטיפה חמישה פעמים מהווים מחזור אחד. לחץ על לחצן ניתוח בתוכנת הניתוח האוטומטית בסוף הניסוי. יופיע חלון תצוגה המכיל את כל נקודות הניסוי.ודא שריכוזי האנליטים המשמשים לפרוטוקול שנקבע נכונים. לחץ על לחצן הפעל ניתוח כדי ליצור את ערך ה- KD באופן אוטומטי. התוכנה יוצרת עלילת התאמה לגבעה על ידי התוויית ריכוזי האנאליטים כנגד תגובות ה-I המתאימות שמהן מחושב קבוע הדיסוציאציה בשיווי משקל.חלבון המטרה Hsp90 היה משותק לשבב, ובניסוי הראשון הוכנו 10 ריכוזים של חלבון האנאליט Cdc37 שנעו בין 25 ננומולרים ל-5, 000 ננומולרים. קבצי הנתונים שנוצרו מניסוי אחד הוצגו כאן. נתוני הניסוי המנוטרים בזמן אמת מוצגים כאן.ציר ה-Y מתאים לתגובת ה-I ביחידות הביו-סנסור, וציר ה-X מתאים לנקודות הזמן והריכוזים השונים של האנליט בניסוי. התמונה הגרפית המוצגת כאן מייצגת את עלילת ההתאמה לגבעה שנוצרה מתוכנת הניתוח האוטומטית. ציר ה-Y מתאים לתגובת ה-I ביחידות הביו-סנסור, וציר ה-X מתאים לריכוזי האנאליטים השונים בניסוי.התמונה הגרפית המוצגת כאן מייצגת את עלילת האסוציאציה שנוצרה באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי. ציר ה-Y מתאים לתגובת ה-I בסוף שלב האסוציאציה, וציר ה-X מתאים לריכוזים השונים של ה-Cdc37 האנליטי. בניסוי השני נעשה שימוש במערך שונה של ריכוזים הנעים בין 0.4 ננומולאר ל-200 ננומולאר, וקבצי הנתונים שנוצרו מוצגים כאן.התמונות הגרפיות מייצגות את התרמוגרמה של ITC של האינטראקציה Hsp90 ו- Cdc37. מוצגות כאן העקומות המקבילות המתפתחות בחום שהתקבלו עקב הזריקות הרצופות של Cdc37 לתוך Hsp90 ב-298.15 קלווין. הכוח הדיפרנציאלי המשמש כאן הוא פונקציה של הזמן.נקודות הנתונים המשולבות בחלקה זו מייעדות את החום המנורמל המתאים לעומת יחס מולר של Hsp90 ל-Cdc37. גישת הצינורות הפתוחים המשמשת כאן דורשת מהמשתמש שליטה בסיסית בצינורות ידיים, תוך הקפדה שלא לגעת בביו-סנסור עם הקצה. יכולת השכפול של תזמון הצעד תלויה לחלוטין במשתמש.ברגע שהחוקר מאפיין אינטראקציה בין שני ביומולקולות, אנו יכולים לבצע ניסוי סינון על ידי תכנון מעכבים פוטנציאליים או מודולטורים המכוונים לאינטראקציה הביומולקולרית הספציפית באמצעות מערכת FEB. ניתן להשתמש בהליך זה כדי לזהות, לאמת ולכמת אינטראקציה ידועה וחדשנית בין חלבונים, כמו גם מולקולות קטנות, כולל תרופות ופפטידים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

דם היקפי הדם נויטרופילים בידוד עבור חקירת פרקינסון הקשורים LRRK2 קינאז מסלול על ידי הערכת Rab10 זירחון

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...