Name: exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology
Uploaded: 2022-03-31T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Denna forskning stöddes av ett bidrag från Binational Science Foundation (BSF) till S.K.S. och N.Q.

OBS: De rekombinanta proteiner som användes i denna studie, Hsp90 och Cdc37, erhölls kommersiellt (se materialtabell).
1. Aktivering av chip
OBS: Alla material som ska användas i experimentet listas i materialförteckningen. Filtrera alla beredda lösningar genom ett sterilt 0,2 μm filter.
<ol><li>Förbered 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodimid (EDC) lösning genom att tillsätta 2 mg EDC till 2,5 ml 1 M2-...

I denna studie utvärderades möjligheten att använda FEB-tekniken (en kinetisk karakteriseringsmetod i realtid) för att bestämma den biomolekylära interaktionen mellan Hsp90 och Cdc37. Det första undersökande experimentet (första experimentet) föreslog att valet av rätt analytkoncentrationer är en kritisk del av experimentet och att experimentet bör utformas genom att inkludera koncentrationspunkter över och under KD-värdet , vilket förutspåddes baserat på de data som finns tillgängliga i lit...

Biomolekylära interaktioner: Proteiner är väsentliga delar av organismer och deltar i många molekylära vägar som cellmetabolism, cellstruktur, cellsignalering, immunsvar, cellvidhäftning och mer. Medan vissa proteiner utför sin funktion (er) oberoende, interagerar de flesta proteiner med andra proteiner med hjälp av ett bindande gränssnitt för att samordna korrekt biologisk aktivitet1.
Biomolekylära interaktioner kan huvudsakligen klassificeras baserat på de distinkta strukturella och funktionella egenskaperna hos involverade proteiner2, till exempel baserat på proteinytorna, den komplexa stabiliteten eller persistensen av interaktioner3. Att identifiera essentiella proteiner och deras roller i biomolekylära interaktioner är avgörande för att förstå biokemiska mekanismer på molekylär nivå4. För närvarande finns det olika metoder för att upptäcka dessa interaktioner5: in vitro6, in silico7, i levande celler8, ex vivo9 och in vivo10 där var och en har sina egna styrkor och svagheter.
In vivo-analyserna utförs med hela djuret som ett experimentellt verktyg11, ocht he ex vivo-analyser utförs på vävnadsextrakt eller hela organ (t.ex. hjärta, hjärna, lever) i en kontrollerad yttre miljö genom att ge minimala förändringar under naturliga förhållanden. Den vanligaste tillämpningen av in vivo - och ex vivo-studier är att utvärdera farmakokinetiken, farmakodynamiken och toxicitetseffekterna av potentiella farmakologiska agens före försök på människa genom att säkerställa deras övergripande säkerhet och effekt12.
Biomolekylära interaktioner kan också detekteras inom levande celler. Avbildning av levande celler tillåter oss att observera dynamiska interaktioner när de utför reaktionerna hos en viss biokemisk väg13. Dessutom kan detektionstekniker, såsom bioluminescens eller fluorescensresonansenergiöverföring, ge information om var och när dessa interaktioner inträffar i cellen14. Även om detektion i levande celler erbjuder viktiga detaljer, är dessa detektionsmetoder beroende av optik och etiketter, vilket kanske inte återspeglar den ursprungliga biologin; De är också mindre kontrollerade än in vitro-metoder och kräver specialiserad expertis för att utföra15.
Beräkningsmetoderna in silico används främst för storskalig screening av målmolekyler före in vitro-experimenten . Beräkningsprediktionsmetoder, datorbaserade databaser, molekylär dockning, kvantitativa struktur-aktivitetsrelationer och andra molekylära dynamiksimuleringsmetoder är bland de väletablerade i silicoverktyg 16. Jämfört med mödosamma experimentella tekniker kan in silico-verktygen enkelt göra förutsägelser med hög känslighet, men med minskad noggrannhet i prediktiv prestanda17.
In vitro-analyser utförs med mikroorganismer eller biologiska molekyler utanför deras biologiska standardsammanhang. Att skildra biomolekylära interaktioner genom in vitro-metoder är avgörande för att förstå proteinfunktioner och biologin bakom det komplexa nätverket av cellfunktion. Den föredragna analysmetoden väljs utifrån proteinets inneboende egenskaper, kinetiska värden och interaktionsläget och intensiteten18,19.
Hsp90/Cdc37-interaktionen: Chaperon-kinasvägen, som förbinder Hsp90 och Cdc37, är ett lovande terapeutiskt mål inom tumörbiologi20. Hsp90 spelar en central roll i cellcykelkontroll, proteinmontering, cellöverlevnad och signalvägar. Proteiner som är beroende av Hsp90 för sina funktioner levereras till Hsp90 för komplexering genom en co-chaperon, såsom Cdc37. Hsp90 / Cdc37-komplexet styr vikningen av de flesta proteinkinaser och fungerar som ett nav för en mängd intracellulära signalnätverk21. Det är ett lovande antitumörmål på grund av dess förhöjda uttryck i olika maligniteter, inklusive akut myeloblastisk leukemi, multipelt myelom och hepatocellulärt karcinom22,23.
Vanliga in vitro biomolekylära interaktionsdetekteringstekniker Co-immunoprecipitation (co-IP) är en teknik som bygger på antigen-antikroppsspecificitet för att identifiera biologiskt relevanta interaktioner24. Den primära nackdelen med denna metod är dess oförmåga att detektera interaktioner med låg affinitet och kinetiska värden24. Biofysiska metoder som isotermisk titreringskalorimetri (ITC), ytplasmonresonans (SPR), biolagerinterferometri (BLI) och FEB-teknik föredras för att bestämma de kinetiska värdena.
ITC är en biofysisk detektionsmetod baserad på bestämning av bindande energi tillsammans med en fullständig termodynamikanalys för att karakterisera biomolekylära interaktioner25. Den främsta fördelen med ITC är att det inte kräver någon märkning eller fixering av målproteinet. De största svårigheterna som ITC stöter på är den höga koncentrationen av målprotein som krävs för ett experiment och svårigheten att analysera icke-kovalenta komplex på grund av små bindande entalpier26. Både SPR och BLI är etikettfria biofysiska tekniker som bygger på immobiliseringen av målmolekylen på sensorytan, följt av efterföljande injektioner av analyten över det immobiliserade målet27,28. I SPR mäts förändringar i brytningsindexet under biomolekylära interaktioner27; i BLI registreras interferensen i reflekterat ljus i realtid som en förändring i våglängden som en funktion av tid28. Både SPR och BLI delar gemensamma fördelar med att erbjuda hög specificitet, känslighet och detekteringsfunktioner29. I båda metoderna immobiliseras målproteinet på biosensorytor, och därför kan det finnas en viss förlust av målets ursprungliga konformation, vilket gör det svårt att skilja mellan specifika kontra icke-specifika interaktioner30. BLI använder dyra fiberoptiska engångsbiosensorer för att immobilisera målet och är därför en kostsam teknik31. Jämfört med dessa väletablerade biomolekylära detektionsverktyg erbjuder FEB-tekniken en pålitlig och etikettfri plattform genom att använda låga nanomolära koncentrationer för biomolekylär detektion i realtid med kinetisk karakterisering. FEB-tekniken övervinner också de bubblande utmaningarna i ITC och är mer kostnadseffektiv jämfört med SPR eller BLI.
De fälteffekttransistorbaserade biosensorerna (FET) är ett framväxande fält för att detektera biomolekylära interaktioner genom att erbjuda olika biomedicinska tillämpningar. I FET-systemet immobiliseras målen till biosensorchipsen och interaktioner detekteras genom förändringar i konduktans32. Den unika egenskapen som ska beaktas vid utvecklingen av en effektiv elektronisk biosensor är de fysikalisk-kemiska egenskaperna såsom den halvledande naturen och den kemiska stabiliteten hos beläggningsmaterialet som används för att tillverka sensorytan33. Konventionella material som kisel som används för FET har begränsat sensorernas känslighet eftersom det kräver oxidskikt inklämda mellan transistorkanalen och en specifik miljö för korrekt funktion34. Dessutom är kiseltransistorer känsliga för miljöer med högt salt, vilket gör det svårt att mäta biologiska interaktioner i sin naturliga miljö. Den grafenbaserade biosensorn presenteras som ett alternativ eftersom den erbjuder utmärkt kemisk stabilitet och elektriskt fält. Eftersom grafen är ett enda atomlager av kol är det både extremt känsligt som halvledare och kemiskt kompatibelt med biologiska lösningar; båda dessa egenskaper är önskvärda för att generera kompatibla elektroniska biosensorer35. Den anmärkningsvärda ultrahöga belastningspotentialen hos biomolekyler som erbjuds av grafenbelagda biosensorer leder till utvecklingen av grafenbaserade biosensorer FEB-teknik.
Principen för FEB-teknik: FEB är en etikettfri biomolekylär detektionsteknik som mäter den elektriska strömmen genom grafenbiosensorn till vilken bindningsmålen är immobiliserade. Interaktioner mellan det immobiliserade proteinet och analyten resulterar i förändringar i ström som övervakas i realtid, vilket möjliggör noggranna kinetiska mätningar36.
Instrumentering: FEB-systemet består av ett grafenfälteffekttransistor (gFET) sensorchip och en elektronisk läsare som tillämpar en konstant spänning under hela experimentet (figur 1). Analyten appliceras i lösning på målproteinet immobiliserat på biosensorytan. När en interaktion inträffar mäts och registreras en förändring i strömmen i realtid. När analytkoncentrationen ökar kommer fraktionen av bunden analyt också att öka, vilket orsakar högre växlingar i strömmen. Med hjälp av den automatiserade analysprogramvara som medföljer instrumentet (Table of Materials) mäts och registreras I-Response i termer av biosensingenheter (BU)37. I-Response definieras som förändringen i strömmen (I) genom biosensorchipet mätt i realtid vid interaktionen mellan det immobiliserade målet och analyten. Den automatiserade analysprogramvaran FEB kan analysera både I-Response och C-Response på dynamiska interaktionshändelser, där C-Response registrerar förändringarna i kapacitansen (C). Variationerna i både I-Response och C-Response motsvarar direkt fraktionen av bunden analyt och kan analyseras ytterligare för att generera KD-värden . Standardinställningen för den automatiserade analysprogramvaran är I-Response.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63495/63495fig01.jpg"> Figur 1: Översikt över den experimentella installationen. (A) Grafenbaserat chip och en elektronisk läsare. (B) En översikt över chipkomponenterna. Chipet är fäst vid två elektroder som levererar ström till systemet. Chipets yta är täckt med grafen, som när den aktiveras kan binda målet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63495/63495fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Metodik: Initialt sätts det aktiverade biosensorchipet in i FEB-enheten (figur 1) följt av utförandet av stegen som beskrivs nedan: (1) Kalibrering: Experimentet börjar med systemkalibrering med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS; pH = 7.4) för att skapa baslinjens jämviktsrespons. (2) Förening: Analyten införs i chipet och I-responsen övervakas tills bindande mättnad uppnås. (3) Dissociation: Analyten dissocieras med 1x PBS. (4) Regenerering: Rester av analyten avlägsnas med 1x PBS. (5) Tvätt: Totalt fem tvättar utförs med 1x PBS för noggrant avlägsnande av de bundna och obundna analyterna från chipet.
Analys: Dataanalys utförs med hjälp av den helautomatiska programvaran som medföljer instrumentet. Den automatiserade analysprogramvaran genererar en Hill-passformsplot med ett KD-värde . Hill fit plot beskriver föreningen av en analyt till målproteinet som en funktion av analytkoncentrationer. Koncentrationen vid vilken ett halvmaxiellt svar uppnås är proportionell mot KD-värdet . Ett lågt KD-värde representerar hög bindningsaffinitet och vice versa.
För att validera data som erhållits från FEB-experimentet extraheras I-svar från varje avläsningspunkt för varje analytkoncentration med hjälp av programvaran för datagranskning / export och kan exporteras till annan statistisk analysprogramvara (se materialtabell) som förklaras nedan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated analysis software</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>biosensor chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data review software</td>
			<td>Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag</td>
			<td>CelluSep,&#160; Membrane filtration products</td>
			<td>T2-10-15 
			CAS number: NA</td>
			<td>T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm &#216;, 0.32ml/cm, 15m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>EDC160322-02 
			CAS number: 25952-53-8</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC (Isothermal titration calorimetry) system</td>
			<td>Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M3671-50G 
			CAS number: 4432-31-9</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Graphene-based chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline) X 10</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001623237500&#160; 
			CAS number: 7758-11-4</td>
			<td>Liquid transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipete</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11855231 
			CAS number: NA</td>
			<td>Finnpipette F3 5-50 &#181;L, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-002-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5))</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-003-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Cdc37</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab256157 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Hsp90 beta</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80033 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet</td>
			<td>Excel, Microsoft office</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>GraphPad, Prism</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NHS160321-07 
			CAS number: 106627-54-7</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td>Alex red</td>
			<td>LC 1093-800-000 
			CAS number: NA</td>
			<td>Tip 1-200 &#181;l, in bulk, 1,000 pcs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology

Biomolekylära interaktioner spelar mångsidiga roller i många cellulära processer genom att reglera och samordna funktionellt relevanta biologiska händelser. Biomolekyler som proteiner, kolhydrater, vitaminer, fettsyror, nukleinsyror och enzymer är grundläggande byggstenar i levande varelser; de samlas i komplexa nätverk i biosystem för att synkronisera en myriad av livshändelser. Proteiner använder vanligtvis komplexa interaktomnätverk för att utföra sina funktioner; därför är det obligatoriskt att utvärdera sådana interaktioner för att avslöja deras betydelse i celler på både cellulär och organismnivå. Mot detta mål introducerar vi en snabbt framväxande teknik, field-effect biosensing (FEB), för att bestämma specifika biomolekylära interaktioner. FEB är en bänkskiva, etikettfri och pålitlig biomolekylär detektionsteknik för att bestämma specifika interaktioner och använder högkvalitativa elektroniska baserade biosensorer. FEB-tekniken kan övervaka interaktioner i nanomolärt område på grund av de biokompatibla nanomaterial som används på dess biosensoryta. Som ett bevis på konceptet belyses protein-proteininteraktionen (PPI) mellan värmechockprotein 90 (Hsp90) och celldelningscykel 37 (Cdc37). Hsp90 är en ATP-beroende molekylär chaperon som spelar en viktig roll i vikning, stabilitet, mognad och kvalitetskontroll av många proteiner och därigenom reglerar flera vitala cellulära funktioner. Cdc37 betraktas som en proteinkinasspecifik molekylär chaperon, eftersom den specifikt känner igen och rekryterar proteinkinaser till Hsp90 för att reglera deras nedströms signaltransduktionsvägar. Som sådan anses Cdc37 vara en co-chaperone av Hsp90. Chaperon-kinasvägen (Hsp90 / Cdc37-komplexet) är hyperaktiverad vid flera maligniteter som främjar cellulär tillväxt; därför är det ett potentiellt mål för cancerbehandling. Föreliggande studie visar effektiviteten hos FEB-tekniken med hjälp av modellsystemet Hsp90/Cdc37. FEB detekterade en stark PPI mellan de två proteinerna (KD-värden på 0,014 μM, 0,053 μM och 0,072 μM i tre oberoende experiment). Sammanfattningsvis är FEB en etikettfri och kostnadseffektiv PPI-detekteringsplattform, som erbjuder snabba och exakta mätningar.

Resultat från experiment 1: Målproteinet Hsp90 (500 nM) immobiliserades till chipet enligt målimmobiliseringsprotokollet som beskrivits ovan. För det första experimentet framställdes 10 koncentrationer av analytproteinet, Cdc37, från 25 nM till 5 000 nM, baserat på tillgängliga data i litteraturen (se tabell 1).
Experimentets steg kan övervakas i realtid genom att följa de förändringar som sker i I-Response (figur 3A</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Field-effect biosensing (FEB) är en etikettfri teknik för att detektera biomolekylära interaktioner. Den mäter den elektriska strömmen genom grafenbiosensorn till vilken bindningsmålen är immobiliserade. FEB-tekniken användes för att utvärdera biomolekylära interaktioner mellan Hsp90 och Cdc37 och en stark interaktion mellan de två proteinerna detekterades.

Utforska biomolekylär interaktion mellan molekylär chaperon Hsp90 och dess klientproteinkinas Cdc37 med hjälp av fälteffektbiosensingteknik

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

FEB är en etikettfri och kostnadseffektiv ______ _______ interaktionsdetekteringsplattform som erbjuder snabba och exakta mätningar. Denna metod erbjuder validering av kända eller okända interaktioner och ett enkelt sätt att testa för potentiella hämmare av de biomolekylära interaktionerna. Den största fördelen med FEB är dess automatiserade, användarvänliga programvara som grindar användaren genom hela experimentet med öppen, handpipetrande plattform, vilket gör det möjligt för användare att arbeta med liten eller till och med ingen utbildning.FEB-tekniken erbjuder också tillämpningar inom olika läkemedelsområden, biomolekylär analys av små molekyler, peptider och proteiner, läkemedelsvalidering genom att översätta in vitro biologisk aktivitet lätt till in vivo-effekt. Som nybörjare kan du möta utmaningar när du väljer rätt analytkoncentrationer för att optimera experimentet för att få ett tillförlitligt KD-värde. Vi rekommenderar att du uppmärksammar chipfunktionaliseringsprocessen och korrekt buffertutbyte.Börja med att blanda lika stora volymer EDC- och sulfo-NHS-lösning genom att pipettera upp och ner. Placera biosensorchipet som levereras av företaget i en petriskål i glas med ett monterat lock. Alla funktionaliseringssteg som är involverade i chipaktivering föreslås att de görs i petriskålen.Applicera 50 mikroliter en molär MES-buffert på biosensorchipet. Inkubera i en minut vid rumstemperatur. Aspirera sedan bufferten och applicera 50 mikroliter EDC-sulfo-NHS-lösning omedelbart på sensorchipet.Täck över petriskålen och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur. Aspirera EDC-sulfo-NHS-lösningen från chipet och applicera 50 mikroliter en molär MES-buffert. Aspirera MES-bufferten och skölj chipet två gånger med 50 mikroliter 1X PBS.Aspirera PBS från chipet och tillsätt målmolekylen Hsp90. Täck glaset Petriskål och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Aspirera sedan lösningen som innehåller målmolekylen och skölj tre gånger med 50 mikroliter 1X PBS.Aspirera 1X PBS-lösningen från chipet och tillsätt 50 mikroliter av släckningen en lösning. Täck glaset Petriskål och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur. Aspirera släck en lösning från chipet och tillsätt 50 mikroliter av släckningslösningen.Täck glaset Petriskål och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur. Därefter aspirera släck två lösningar från chipet och skölj chipet fem gånger med 50 mikroliter 1X PBS och lämna den sista PBS-droppen på sensorn. Förbered analytutspädningsserien för Cdc37 i önskat koncentrationsområde.Utforma experimentet så att det inkluderar minst åtta olika analytkoncentrationer för att erhålla en tillförlitlig dissociationskonstant, eller KD-värde, och förbereda dessa olika utspädningar i samma buffert som används för kalibrering och målprotein. Placera chipet försiktigt på instrumentet. Se till att programvaran är på och LED-lampa lyser grönt.Tryck sedan på modulen Kör experiment på den automatiserade programvaran och välj 10 poäng med regenerering eller något annat önskat protokoll. Fyll i information som operatörsnamn, experimentnamn, datum, regenereringsbuffert, immobiliserat mål och analyten i lösningen. Tryck på knappen Börja experiment som visas på programvaran och följ instruktionerna som visas av den automatiserade programvaran.För att utföra instrumentkalibreringen, aspirera den återstående PBS-lösningen från chipet och applicera 50 mikroliter av kalibreringsbufferten. Tryck på Fortsätt-knappen och vänta i fem minuter tills kalibreringssteget är klart. Programvaran visar slutpunkten som bestämts för kalibreringssteget med ett varningslarm för uppföljning.Utför sedan en analytförening genom att aspirera kalibreringsbufferten från chipet och applicera 50 mikroliter med den lägsta analytkoncentrationen. Tryck på Fortsätt-knappen och vänta i fem minuter tills associeringssteget är klart. Programvaran visar slutpunkten för associeringssteget med ett varningslarm för att fortsätta.För att utföra en analytdissociation, aspirera analytlösningen från chipet och applicera 50 mikroliter av dissociationsbufferten. Tryck på Fortsätt-knappen. Efter dissociationsstegets varaktighet visar programvaran slutpunkten för dissociationssteget med ett varningslarm.Utför sedan chipregenerering genom att aspirera dissociationslösningen från chipet och applicera 50 mikroliter av regenereringsbufferten. Tryck sedan på Fortsätt-knappen. Regenereringssteget tar vanligtvis cirka 30 sekunder att slutföra.Därefter visar programvaran slutpunkten för regenereringssteget med ett varningslarm för att följa upp. Slutligen, för att tvätta chipet, aspirera regenereringslösningen från chipet och applicera 50 mikroliter av tvättbufferten. Aspirera lösningen från chipet och upprepa detta fem gånger.Lämna den sista droppen av tvättbufferten på chipet. Tryck sedan på Fortsätt-knappen och vänta i 30 sekunder tills tvättstegets varaktighet är klar i programvarudisplayen. Upprepa stegen för varje analytkoncentration som används.De fem stegen i kalibreringen, analytassociationen, dissociationen, regenereringen och tvättningen fem gånger utgör en cykel. Tryck på knappen Analys i programvaran för automatiserad analys i slutet av experimentet. Ett visningsfönster som innehåller alla experimentella punkter visas.Se till att analytkoncentrationerna som används för det föreskrivna protokollet är korrekta. Tryck på knappen Kör analys för att generera KD-värdet automatiskt. Programvaran genererar en kullpassningsplot genom att plotta analytkoncentrationerna mot motsvarande I-svar från vilka dissociationskonstanten vid jämvikt beräknas.Målproteinet Hsp90 immobiliserades till chipet, och för det första experimentet framställdes 10 koncentrationer av analytproteinet Cdc37 från 25 nanomolarer till 5 000 nanomolarer. Datafilerna som genereras från experiment ett har visats här. Experimentella data som övervakas i realtid visas här.Y-axeln motsvarar I-responsen i biosensorenheterna, och X-axeln motsvarar de olika tidpunkterna och koncentrationerna av analyten i experimentet. Den grafiska bilden som visas här representerar kullpassningsdiagrammet som genereras från den automatiserade analysprogramvaran. Y-axeln motsvarar I-responsen i biosensorenheterna, och X-axeln motsvarar de olika analytkoncentrationerna i experimentet.Den grafiska bilden som visas här representerar associationsdiagrammet som genereras med hjälp av programvaran för statistisk analys. Y-axeln motsvarar I-svaret i slutet av associeringsfasen, och X-axeln motsvarar de olika koncentrationerna av analyten Cdc37. I experiment två användes en annan uppsättning koncentrationer som sträckte sig från 0,4 nanomolar till 200 nanomolar, och de genererade datafilerna visas här.De grafiska bilderna representerar ITC-termogrammet för Hsp90- och Cdc37-interaktionen. Här visas motsvarande värmeutveckliga kurvor erhållna på grund av de på varandra följande injektionerna av Cdc37 i Hsp90 vid 298,15 Kelvin. Den differentiella kraften som används här är en funktion av tiden.De integrerade datapunkterna i det här diagrammet anger motsvarande normaliserad värme jämfört med Mueller-förhållandet mellan Hsp90 och Cdc37. Den öppna pipetteringsmetoden som används här kräver att användaren har en grundläggande behärskning av handpipettering, se till att inte röra biosensorn med spetsen. Reproducerbarheten av stegtiden beror helt på användaren.När forskaren karakteriserar en interaktion mellan två biomolekyler kan vi utföra ett screeningexperiment genom att designa potentiella hämmare eller modulatorer som riktar sig mot den specifika biomolekylära interaktionen med hjälp av FEB-systemet. Denna procedur kan användas för att identifiera, verifiera och kvantifiera känd och ny interaktion mellan proteiner, såväl som små molekyler, inklusive läkemedel och peptider.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analys av proteinkinasaktivitet med radiomärkt ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Human perifert blod Neutrophil Isolering för förhör av Parkinsons associerade LRRK2 Kinas väg genom att bedöma Rab10 Fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifiering av romanen CK2 Kinase substrat med en mångsidig biokemisk metod

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studera RNA interactmedlemmar av proteinkinas RNA-aktiverad under däggdjur cellcykeln

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på molekylär nivå med hjälp av robusta biokemiska metoder för ett nytt Kinas protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinashämmare screening i självmonterade humana Proteinmikromatriser

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantifiering av proteininteraktion Nätverksdynamik med hjälp av multiplexerade Co-immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Övervakning av protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo vid hög tidsupplösning med χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...