Name: three-dimensional characterization of interorganelle contact sites in hepatocytes using serial section electron microscopy
Uploaded: 2022-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy at JoVE.com

ونشكر جوانا هانلي وريبيكا فياديرو وأنيا ستراتمان - إيوانوفسكا على المساعدة التقنية الخبيرة. كما نشكر أعضاء مختبر ستيفان وإيان ج. وايت على المناقشات المفيدة. J.J.B. مدعوم من تمويل MRC لمختبر MRC لبيولوجيا الخلايا الجزيئية في UCL ، رمز الجائزة MC_U12266B. يتم دعم C.J.S. من خلال تمويل MRC لمختبر MRC لوحدة جامعة البيولوجيا الخلوية الجزيئية في UCL ، رمز الجائزة MC_UU_00012/6. يتم تمويل P.G. من قبل مجلس البحوث الأوروبي ، رمز المنحة ERC-2013-StG-337057.

تم إيواء جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية لوزارة الداخلية في المملكة المتحدة ، وتم حصاد الأنسجة وفقا لقانون المملكة المتحدة للحيوانات (الإجراءات العلمية) لعام 1986.
1. تثبيت العينات وإعدادها
<ol><li>قم بتشريح أنسجة الكبد إلى قطع مناسبة الحجم ، حوالي 8 مم × 8 مم × 3 م?...

يتم وصف تقنية vEM التي يمكن الوصول إليها لتصور بنية العضية والتفاعلات في 3D في هذا البروتوكول. يتم تقديم مورفولوجيا الاتصالات بين الأعضاء في خلايا الكبد كدراسة حالة هنا. ومع ذلك ، تم تطبيق هذا النهج أيضا للتحقيق في مجموعة متنوعة من العينات والمجالات البحثية الأخرى ، بما في ذلك التفاعلات بين ?...

منذ اختراعها في 1930s ، سمحت المجاهر الإلكترونية للباحثين بتصور المكونات الهيكلية للخلايا والأنسجة 1,2. قدمت معظم التحقيقات معلومات ثنائية الأبعاد ، حيث يتطلب بناء نماذج ثلاثية الأبعاد جمع قسم تسلسلي مضني ، والتصوير اليدوي ، والمعالجة السلبية ، والتتبع اليدوي ، وإنشاء وتجميع نماذج ثلاثية الأبعاد من صفائح الزجاج أو البلاستيك أو الستايروفوم 3,4. بعد ما يقرب من 70 عاما ، كان هناك تقدم كبير في العديد من جوانب العملية ، من أداء المجهر ، وجمع القسم التسلسلي ، والتصوير الرقمي الآلي ، والبرامج والأجهزة المتطورة لإعادة الإعمار 3D ، والتصور ، والتحليل إلى النهج البديلة لما يسمى الآن بشكل جماعي حجم EM (vEM). تعتبر تقنيات vEM هذه بشكل عام لتوفير معلومات فوق هيكلية 3D بدقة نانومتر عبر مقاييس ميكرون وتشمل المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) وتقنيات المجهر الإلكتروني الماسح الأحدث (SEM) ؛ انظر المراجعات5،6،7،8.
على سبيل المثال ، يستخدم شعاع الأيونات المركز SEM (FIB-SEM) شعاعا أيونيا مركزا داخل SEM لطحن سطح الكتلة بين عمليات مسح تصوير SEM المتسلسلة لسطح الكتلة ، مما يسمح بالطحن / التصوير الآلي المتكرر لعينة وبناء مجموعة بيانات ثلاثية الأبعاد لإعادة الإعمار 9,10. في المقابل ، يستخدم وجه الكتلة التسلسلي SEM (SBF-SEM) ميكروتوم فائق الميكروتوم داخل SEM لإزالة المواد من وجه الكتلة قبل التصوير 11,12 ، في حين أن التصوير المقطعي للصفيف هو عملية غير مدمرة تتطلب جمع المقاطع التسلسلية ، على أغطية أو رقائق أو شريط ، قبل إعداد سير عمل آلي لتصوير المنطقة ذات الأهمية في الأقسام المتسلسلة في SEM لإنشاء مجموعة بيانات ثلاثية الأبعاد 13 . على غرار التصوير المقطعي بالمصفوفة ، يتطلب القسم التسلسلي TEM (ssTEM) جمع الأقسام المادية قبل التصوير ؛ ومع ذلك ، يتم جمع هذه الأقسام على شبكات TEM وتصويرها في TEM14،15،16. يمكن تمديد ssTEM عن طريق إجراء التصوير المقطعي بالإمالة17،18،19. يوفر التصوير المقطعي التسلسلي للإمالة أفضل دقة في x و y و z ، وعلى الرغم من استخدامه لإعادة بناء الخلايا الكاملة20 ، إلا أنه يمثل تحديا معقولا. يركز هذا البروتوكول على الجوانب العملية ل ssTEM باعتبارها تقنية vEM الأكثر سهولة المتاحة للعديد من مختبرات EM التي قد لا تتمكن حاليا من الوصول إلى أدوات التقسيم المتخصصة أو vEM ولكنها ستستفيد من توليد بيانات 3D vEM.
وقد سبق أن اعتبر الاستئصال التسلسلي للميكروتومي لإعادة بناء 3D تحديا. كان من الصعب قص شرائط مستقيمة بسماكة مقطع ، والقدرة على ترتيب والتقاط شرائط بالحجم الصحيح ، بالترتيب الصحيح ، على الشبكات مع الدعم الكافي ، ولكن بدون قضبان الشبكة التي تحجب مناطق الاهتمام ، والأهم من ذلك ، دون فقدان الأقسام ، لأن سلسلة غير مكتملة قد تمنع إعادة الإعمار 3D الكاملة21. ومع ذلك ، فإن التحسينات التي أدخلت على الميكروتومات الفائقة التجارية ، وسكاكين قطع الماس وتقليمه 22،23 ، وأفلام دعم الإلكترون لوسنت على الشبكات 21،24 ، والمواد اللاصقة للمساعدة في التصاق القسم والحفاظ على الشريط13،21 ليست سوى بعض من التطورات التدريجية على مر السنين التي جعلت هذه التقنية أكثر روتينية في العديد منالمختبرات. بمجرد جمع الأقسام التسلسلية ، يكون التصوير التسلسلي في TEM مباشرا ويمكن أن يوفر صورا EM بأحجام px تحت النانومتر في x و y ، مما يسمح باستجواب عالي الدقة للهياكل دون الخلوية - وهو شرط محتمل للعديد من الأسئلة البحثية. توضح دراسة الحالة المقدمة هنا استخدام ssTEM وإعادة بناء 3D في دراسة اتصالات الخلايا الإندوبلازمية (ER) في خلايا الكبد الكبدية ، حيث لوحظت اتصالات ER-organelle لأول مرة25,26.
في حين أن ER متجاور مع الغلاف النووي ، فإنه يقوم أيضا بإجراء اتصالات وثيقة مع العديد من عضيات الخلايا الأخرى ، بما في ذلك الليزوسومات والميتوكوندريا وقطرات الدهون وغشاء البلازما27. تورطت جهات الاتصال العضوية ER في استقلاب الدهون28 ، وإشارات الفوسفوينوسيتيد والكالسيوم29 ، وتنظيم الالتهام الذاتي ، والاستجابة للإجهاد30,31. اتصالات العضيات ER وغيرها من الاتصالات بين الأعضاء هي هياكل ديناميكية للغاية تستجيب لاحتياجات التمثيل الغذائي الخلوي والإشارات خارج الخلية. وقد تبين أنها تختلف من الناحية المورفولوجية في حجمها وشكلها والمسافات بين أغشية العضيات32,33. ويعتقد أن هذه الاختلافات فوق الهيكلية من المرجح أن تعكس تركيباتها المختلفة للبروتين / الدهون ووظيفتها34,35. ومع ذلك ، لا تزال مهمة صعبة لتحديد جهات الاتصال بين الأعضاء وتحليلها36. وبالتالي ، هناك حاجة إلى بروتوكول موثوق به ولكنه بسيط لفحص وتوصيف الاتصالات بين الأعضاء لإجراء مزيد من التحقيقات.
نظرا لأن جهات اتصال ER organelle يمكن أن تتراوح من 10 إلى 30 نانومتر في الفصل بين الغشاء والغشاء ، فإن المعيار الذهبي لتحديد الهوية كان تاريخيا TEM. كشف قسم رفيع TEM عن توطين نطاق فرعي محدد لبروتينات ER المقيمة في جهات اتصال غشائية متميزة37. تقليديا ، كشف هذا عن اتصالات ER-organelle بدقة nm ولكن في كثير من الأحيان لم يقدم سوى عرض 2D لهذه التفاعلات. ومع ذلك ، تكشف مناهج vEM عن العرض والسياق الهيكلي لمواقع الاتصال هذه في 3D ، مما يتيح إعادة البناء الكامل لجهات الاتصال وتصنيف أكثر دقة لجهات الاتصال (النقطة مقابل الأنبوبي مقابل الشبيه بالصخر) والقياس الكمي38,39. بالإضافة إلى كونها أول نوع من الخلايا حيث لوحظت اتصالات ER-organelle25,26 ، فإن خلايا الكبد لديها نظام واسع من الاتصالات الأخرى بين الأعضاء التي تخدم أدوارا حيوية في هندستها المعمارية وعلم وظائف الأعضاء 28,40. ومع ذلك ، لا يزال التوصيف المورفولوجي الشامل للعضيات ER-organelle وغيرها من الاتصالات بين العضيات في خلايا الكبد غير موجود. وفقا لذلك ، فإن كيفية تشكل الاتصالات بين الأعضاء وإعادة تشكيلها أثناء التجديد والإصلاح لها أهمية خاصة لبيولوجيا خلايا الكبد ووظائف الكبد.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum trays</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira v6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C/4960/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T027</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>DiaTOME</td>
			<td>ultra 45&#176;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>D032</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers N5</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji TrakEM2 plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 36% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>F003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar coated slot grid</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with applicator rod</td>
			<td>Medisca</td>
			<td>6258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15364769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde 25% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>G011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNA/Methyl Nadic Anhydride</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>M011</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 2% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>O005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0050/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reuseable adhesive</td>
			<td>Blue Tack</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Lead Citrate</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>L037</td>
			<td>Section stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0250</td>
			<td>to make 0.1 M Caco buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>918-6872</td>
			<td>Cyanoacrylate glue, Step 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAAB 812 Resin</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T023</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two part Epoxy Resin</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>132-605</td>
			<td>Alternative: Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>100 &#181;m thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weldwood Original Contact cement</td>
			<td>DAP</td>
			<td>107</td>
			<td>Contact adhesive: Step 3.1.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional characterization of interorganelle contact sites in hepatocytes using serial section electron microscopy

لطالما اعتبر المجهر الإلكتروني الناقل هو المعيار الذهبي لتصور البنية الفائقة الخلوية. ومع ذلك ، غالبا ما يقتصر التحليل على بعدين ، مما يعوق القدرة على الوصف الكامل للبنية الفائقة ثلاثية الأبعاد (3D) والعلاقة الوظيفية بين العضيات. يصف المجهر الإلكتروني الحجمي (vEM) مجموعة من التقنيات التي تمكن من استجواب البنية الفائقة الخلوية في 3D بدقة متوسطة الحجم ومجهرية ونانوية. 
يوفر هذا البروتوكول طريقة سهلة الوصول وقوية للحصول على بيانات vEM باستخدام إرسال القسم التسلسلي EM (TEM) ويغطي الجوانب التقنية لمعالجة العينات من خلال إعادة الإعمار الرقمي 3D في سير عمل واحد ومباشر. لإثبات فائدة هذه التقنية ، يتم تقديم العلاقة فوق الهيكلية 3D بين الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا ومواقع الاتصال الخاصة بها في خلايا الكبد الكبدية. تؤدي الاتصالات بين الأعضاء أدوارا حيوية في نقل الأيونات والدهون والمواد المغذية والجزيئات الصغيرة الأخرى بين العضيات. ومع ذلك ، على الرغم من اكتشافها الأولي في خلايا الكبد ، لا يزال هناك الكثير لتعلمه عن ميزاتها الفيزيائية وديناميكياتها ووظائفها. 
يمكن أن تعرض جهات الاتصال بين الأعضاء مجموعة من المورفولوجيات ، تختلف في قرب العضيتين من بعضهما البعض (عادة ~ 10-30 نانومتر) ومدى موقع الاتصال (من جهات الاتصال المثقوبة إلى جهات الاتصال الأكبر الشبيهة بالصهريج ثلاثي الأبعاد). يتطلب فحص المخالطين المقربين تصويرا عالي الدقة ، والقسم التسلسلي TEM مناسب تماما لتصور البنية الفائقة 3D للاتصالات بين الأعضاء أثناء تمايز خلايا الكبد ، وكذلك التغييرات في بنية خلايا الكبد المرتبطة بأمراض التمثيل الغذائي.

بالنسبة لهذه التقنية ، يتم اختيار المناطق ذات الأهمية بناء على هدف البحث البيولوجي وتحديدها قبل تقليم وتقسيم الأنسجة المدمجة. وبالمثل ، قد يملي سؤال البحث حجم وجه الكتلة ؛ في هذه الحالة ، تم قص العينة لترك وجه كتلة يبلغ حوالي 0.3 مم × 0.15 مم (الشكل 4A). سمح ذلك بشبكتين من 9 أقسام ?...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy at JoVE.com

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

بروتوكول بسيط وشامل للحصول على تفاصيل ثلاثية الأبعاد لمواقع ملامسة الغشاء بين العضيات في خلايا الكبد من الكبد أو الخلايا في الأنسجة الأخرى.

توصيف ثلاثي الأبعاد لمواقع التلامس بين الأعضاء في خلايا الكبد باستخدام المجهر الإلكتروني التسلسلي

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

يسمح هذا البروتوكول بإعادة بناء 3D للعضيات بطريقة بسيطة وقوية ، في حين يمكن الوصول إليها من قبل المختبرات التي ليس لديها حاليا مجاهر إلكترونية متخصصة في الحجم. هذه التقنية مرنة للغاية ، وتوفر دقة X / Y ممتازة ، مع القدرة على إعادة تصوير العينات إذا لزم الأمر. كما أنه متوافق مع التصوير المقطعي بالإمالة عند الحاجة إلى دقة Z عالية جدا.تسمح هذه التقنية باستجواب مورفولوجيا العضيات في سياق بين العضيات. لذلك ، يمكن توسيعه لفحص أي حالات مرضية مع عيوب العضيات. يمكن أن يوفر هذا النهج نظرة ثاقبة على تفاعلات العضيات وأحداث الاتجار الخلوي.يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على الأنسجة الأخرى والنماذج العضوية وأنظمة زراعة الخلايا ، بالإضافة إلى خلايا الكبد. قد يجد المستخدمون لأول مرة التقسيم التسلسلي ويلتقطون تحديا دون خسارة. يوصى بإتقان التقسيم المنتظم الرقيق للغاية قبل تطبيق هذا البروتوكول على عينة ثمينة.ابدأ بتقليم الأنسجة المضمنة في الراتنج بعناية باستخدام شفرة حلاقة مع قفل العينة في محول التشذيب. انقل تابوت العينة مع الظرف والعينة إلى ذراع العينة للميكروتوم وضع تابوت العينة بحيث يمتد نطاق سفر الفلك من الأعلى إلى الأسفل. ضع السكين الماسي واقفله في حامل السكين ، مما يضمن ضبط زاوية قطع السكين بشكل مناسب.قفل حامل السكين في المسرح بإحكام. قم بإيقاف تشغيل إضاءة المرحلة الهابطة ، وقم بتشغيل إضاءة المسرح ، وحرك السكين بحذر نحو العينة ، واضبط باستمرار الزاوية الجانبية للسكين ، وإمالة العينة ، ودوران العينة عن طريق ضبط المقابض ذات الصلة حتى يتم محاذاة وجه الكتلة إلى حافة السكين. اضبط الجزء العلوي والسفلي من نافذة القطع لذراع العينة واترك العينة أسفل حافة السكين مباشرة.املأ قارب السكين بالماء النظيف المقطر المزدوج وتأكد من أن سطح الماء مستو مع حافة السكين ومقعر قليلا. ثم ابدأ في قطع الأقسام. أوقف القطع مباشرة بعد اجتياز العينة لحافة السكين.استخدم شبكة فتحات فارغة لتقدير عدد المقاطع المطلوب تجميعها على كل شبكة. باستخدام رمش في كل يد، قم بكسر الشريط برفق إلى شرائط أصغر يمكن أن تتناسب مع طول شبكة الفتحة. قم بتدوين ملاحظة ذهنية لمواقعهم النسبية داخل العينة.باستخدام قضيب قضيب زجاجي ، مرر قطرة من الكلوروفورم فوق الأقسام لتسطيحها. التقط أول شبكة فتحة فارغة باستخدام أول ملقط مرقم واغمسها بلطف في Triton X-100 ثم مرتين في الماء المقطر. استخدم قطعة من ورق الترشيح لإزالة الماء الزائد من حافة الملقط.باستخدام الملقط ، قم بخفض ما يقرب من 2/3 من شبكة الفتحات المطلية بالفورمفار بلطف في مياه قارب السكين. تأكد من أن جانب الفورمفار متجه لأسفل وأن الحافة اليمنى الطويلة للفتحة موجودة على سطح الماء وموازية لحافة الماء. قم بتحريك الشبكة بلطف في الماء نحو الشرائط بحيث تنجرف الأقسام نحو الشبكة عند ضربة العودة.استمر في القيام بذلك في الفتحات الأصغر والأصغر، حتى تصطف الحافة اليمنى للشريط مع الحافة اليمنى للفتحة. ثم ، مع آخر لوح ، أحضر الشبكة برفق لالتقاط الأقسام في شبكة الفتحة. ضع عدة كريات من هيدروكسيد الصوديوم تحت غطاء طبق بتري لتوفير بيئة خالية من ثاني أكسيد الكربون.ثم ، ماصة بعناية قطرات 40 ميكرولتر من سيترات الرصاص رينولد على بارافيلم ، قطرة واحدة لكل شبكة. اقلب كل شبكة على قطرة سترات الرصاص واتركها محمية بغطاء طبق بتري لمدة 7 إلى 10 دقائق. بينما تكون الشبكات ملطخة ، ضع خمس قطرات من الماء المقطر حوالي 300 ميكرولتر لكل شبكة على البارافيلم.في نهاية حضانة سيترات الرصاص ، انقل كل شبكة إلى قطرة من الماء المقطر لغسلها لمدة دقيقة واحدة دون التنفس مباشرة على الشبكات. كرر هذا أربع مرات أخرى. استخدم ملقط كروس أوفر مرقم لالتقاط الشبكة الأولى.المس حافة الشبكة لتصفية الورق لإطفاء معظم الماء واتركه حتى يجف في الملقط لمدة 20 دقيقة على الأقل. كرر ذلك لكل شبكة. عند التكبير المنخفض، راقب ترتيب الأقسام التسلسلية وموقعها وموضعها.انتقل إلى القسم الأوسط من السلسلة على الشبكة. تصفح العينة وحدد منطقة الاهتمام. ثم راقب العينة عند التكبير المطلوب.فكر في جمع السلسلة بتكبير أقل قليلا، حيث غالبا ما لا تكون الأقسام محاذاة تماما، وقد تحتاج الصور إلى اقتصاصها لاحقا. بعد ذلك، التقط صورا مرجعية بتكبيرات أقل. سيساعد ذلك على تقدير سياق المنطقة ذات الاهتمام ، وموقعها التقريبي عند تكبيرات مختلفة فيما يتعلق بحدود القسم ، والميزات البارزة داخل العينة.استخدمها لوضع علامة على منطقة الاهتمام في أقسام أخرى. للرجوع إلى الشاشة، استخدم معجون لاصق قابل لإعادة الاستخدام أو ملصقات أو قطعة من ورق العرض العلوي المسجل على الشاشة لوضع علامات مؤقتة على الشاشة. سيسمح ذلك بإعادة التصور الروتيني لنفس ميزات المنطقة ذات الاهتمام في مركز الصورة في جميع أنحاء مجموعة البيانات.افتح مكدس الصورة، وحدد قياسات voxel، وحدد علامة التبويب تجزئة لبدء التجزئة. انقر جديد في لوحة محرر التقسيم لتعريف كائنات جديدة في قائمة المواد. انقر بزر الماوس الأيمن لتغيير لون الكائن وانقر نقرا مزدوجا لإعادة تسمية الكائن.للتجزئة اليدوية، اختر أداة التقسيم أسفل قائمة المواد وحدد أداة الفرشاة الافتراضية لتمييز البيكسلات. تظهر هنا صورة المجهر الإلكتروني لخليتين كبيتين متعارضتين. يسمح التصوير بالتكبير العالي بمراقبة التفاصيل المورفولوجية للعضيات المختلفة بدقة نانومترية.تظهر الصورة التمثيلية النسخة المجزأة من نفس التصوير المقطعي ، وأثر الشبكة الإندوبلازمية ، والميتوكوندريا ، والاتصالات بين الأغشية بين ER والميتوكوندريا من مساحات مختلفة تظهر هنا. تظهر الصورة التمثيلية شريحة أورثو مائلة متراكبة مع آثار التجزئة وموقعها النسبي داخل الميتوكوندريا بأكملها. ويظهر هنا إعادة بناء 3D للعضيات المجزأة والاتصالات الشبكية والميتوكوندريا الإندوبلازمية بزوايا مختلفة.نظرا لأن هذا البروتوكول متوافق مع التصوير المقطعي بالإمالة عند الحاجة إلى دقة Z عالية جدا ، فإنه يساعد على حل الهياكل الصغيرة أو المعقدة. هذه التقنية مثالية للتقييم الأولي للعلاقة المكانية بين العضيات المختلفة ، وبالتالي ، فهي مفيدة بشكل خاص في مجال التقدم في اتصالات الغشاء في توازن الغشاء.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

نانو FEM: تعريب البروتين عن طريق الصور التي تنشط المجهر التعريب والمجهر الإلكتروني

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

ثلاثي الأبعاد فائقة الدقة المجهر من الشعيرات F-أكتين من التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

توصيف تكلس الأحداث عن طريق لايف البصرية والمجهر الإلكتروني تقنيات في Tubeworm البحرية

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D أولتراستروكتوري الميتوكوندريا عضلة الرحلات غير المباشرة المورفولوجية كشفت عن طريق التصوير المقطعي الإلكترون المسلسل-القسم

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

الدراسات المستهدفة باستخدام الوجه كتلة المسلسل ومركزة أيون شعاع المسح المجهري الإلكترون

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

المجهر الإلكتروني المتسلسل لمسح الوجه الكتلي (SBF-SEM) لعينات الأنسجة البيولوجية

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...