Name: three-dimensional characterization of interorganelle contact sites in hepatocytes using serial section electron microscopy
Uploaded: 2022-06-09T13:00:00
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Nous remercions Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro et Ania Straatman-Iwanowska pour leur assistance technique experte. Nous remercions également les membres du laboratoire Stefan et Ian J. White pour leurs discussions utiles. J.J.B. est soutenu par le financement du MRC au Laboratoire de biologie cellulaire moléculaire du MRC à l’UCL, code de récompense MC_U12266B. C.J.S. est soutenu par le financement du MRC au MRC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit de l’UCL, code de récompense MC_UU_00012/6. P.G. est financé par le Conseil européen de la recherche, code de subvention ERC-2013-StG-337057.

Tous les animaux ont été logés conformément aux directives du ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni et la récolte des tissus a été effectuée conformément à la loi britannique de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques).
1. Fixation et préparation de l’échantillon
<ol><li>Disséquer le tissu hépatique en morceaux de taille appropriée, environ 8 mm x 8 mm x 3 mm, et placer les morceaux dans une solution saline chaude tamponnée au phosphate (PBS, ...

Une technique vEM accessible pour visualiser la structure et les interactions des organites en 3D est décrite dans ce protocole. La morphologie des contacts interorganelles dans les hépatocytes est présentée ici comme une étude de cas. Cependant, cette approche a également été appliquée pour étudier une variété d’autres échantillons et domaines de recherche, y compris les interactions cellule-endothéliale de Schwann dans les nerfs périphériques45, la biogenèse du corps de Weibel...

Depuis leur invention dans les années 1930, les microscopes électroniques ont permis aux chercheurs de visualiser les composants structurels des cellules et des tissus 1,2. La plupart des enquêtes ont fourni des informations 2D, car la construction de modèles 3D nécessite une collecte minutieuse de sections en série, une photographie manuelle, un traitement négatif, un traçage manuel et la création et l’assemblage de modèles 3D à partir de feuilles de verre, de plastique ou de polystyrène 3,4. Près de 70 ans plus tard, il y a eu des progrès considérables dans de nombreux aspects du processus, des performances des microscopes, de la collecte de sections en série, de l’imagerie numérique automatisée, des logiciels et du matériel sophistiqués pour la reconstruction, la visualisation et l’analyse 3D aux approches alternatives pour ce qui est maintenant collectivement appelé volume EM (vEM). Ces techniques de vEM sont généralement considérées comme fournissant des informations ultrastructurales 3D à des résolutions nanométriques à l’échelle du micron et englobent la microscopie électronique à transmission (TEM) et les nouvelles techniques de microscopie électronique à balayage (MEB); voir avis 5,6,7,8.
Par exemple, le SEM à faisceau d’ions focalisé (FIB-SEM) utilise un faisceau d’ions focalisés à l’intérieur d’un SEM pour fraiser la surface du bloc entre les balayages d’imagerie SEM séquentiels de la surface du bloc, ce qui permet le fraisage / imagerie automatisé répété d’un échantillon et la construction d’un ensemble de données 3D pour la reconstruction 9,10. En revanche, le SEM de face de bloc série (SBF-SEM) utilise un ultramicrotome à l’intérieur du SEM pour retirer du matériau de la face de bloc avant l’imagerie11,12, tandis que la tomographie en réseau est un processus non destructif qui nécessite la collecte de sections série, sur des couvercles, des plaquettes ou des bandes, avant de mettre en place un flux de travail automatisé d’imagerie de la région d’intérêt dans les sections séquentielles dans le SEM pour générer le jeu de données 3D13 . Semblable à la tomographie par matrice, la section série TEM (ssTEM) nécessite que les sections physiques soient collectées avant l’imagerie; cependant, ces sections sont collectées sur des grilles TEM et imagées dans un TEM 14,15,16. ssTEM peut être étendu en effectuant une tomographie d’inclinaison 17,18,19. La tomographie par inclinaison en série offre la meilleure résolution en x, y et z, et bien qu’elle ait été utilisée pour reconstruire des cellules entières20, elle est raisonnablement difficile. Ce protocole se concentre sur les aspects pratiques de ssTEM en tant que technique vEM la plus accessible disponible pour de nombreux laboratoires EM qui n’ont peut-être pas actuellement accès à des instruments de sectionnement ou de vEM spécialisés, mais qui bénéficieraient de la génération de données vEM 3D.
L’ultramicrotomie en série pour la reconstruction 3D a déjà été considérée comme difficile. Il était difficile de couper des rubans droits d’épaisseur de section uniforme, d’être capable d’organiser et de ramasser des rubans de la bonne taille, dans le bon ordre, sur des grilles avec un support suffisant, mais sans barres de grille obscurcissant les régions d’intérêt, et surtout, sans perdre de sections, car une série incomplète peut empêcher une reconstruction 3D complète21. Cependant, les améliorations apportées aux ultramicrotomes commerciaux, aux couteaux de coupe et de coupe au diamant 22,23, aux films de support électroniques sur les grilles21,24 et aux adhésifs pour faciliter l’adhérence des sections et la préservation du ruban13,21 ne sont que quelques-unes des avancées progressives au fil des ans qui ont rendu la technique plus courante dans de nombreux laboratoires. Une fois les sections série collectées, l’imagerie série dans TEM est simple et peut fournir des images EM avec des tailles px subnanométriques en x et y, permettant une interrogation à haute résolution des structures subcellulaires - une exigence potentielle pour de nombreuses questions de recherche. L’étude de cas présentée ici démontre l’utilisation de ssTEM et de la reconstruction 3D dans l’étude des contacts endoplasmiques réticulum (ER)-organites dans les hépatocytes hépatiques, où les contacts ER-organites ont été observés pour la première fois25,26.
Tout en étant contiguë à l’enveloppe nucléaire, l’ER établit également des contacts étroits avec de nombreux autres organites cellulaires, notamment les lysosomes, les mitochondries, les gouttelettes lipidiques et la membrane plasmique27. Les contacts ER-organites ont été impliqués dans le métabolisme des lipides28, la signalisation29 du phosphoinositide et du calcium, la régulation de l’autophagie et la réponse au stress30,31. Les contacts ER-organites et autres contacts interorganelles sont des structures très dynamiques qui répondent aux besoins métaboliques cellulaires et aux signaux extracellulaires. Il a été démontré qu’ils varient morphologiquement dans leur taille et leur forme et les distances entre les membranes des organites32,33. On pense que ces différences ultrastructurales sont susceptibles de refléter leurs différentes compositions protéiques / lipidiques et leur fonction34,35. Cependant, il reste difficile de définir les contacts interorganelles et de les analyser36. Par conséquent, un protocole fiable mais simple pour examiner et caractériser les contacts interorganelles est nécessaire pour des investigations plus approfondies.
Comme les contacts ER-organites peuvent aller de 10 à 30 nm dans la séparation membrane-membrane, l’étalon-or pour l’identification a toujours été TEM. Le TEM à section mince a révélé une localisation spécifique du sous-domaine pour les protéines ER résidentes à des contacts membranaires distincts37. Traditionnellement, cela a révélé des contacts ER-organites avec une résolution nm, mais n’a souvent présenté qu’une vue 2D de ces interactions. Cependant, les approches vEM révèlent la présentation ultrastructurale et le contexte de ces sites de contact en 3D, permettant une reconstruction complète des contacts et une classification plus précise des contacts (point vs tubulaire vs cisternal) et quantification38,39. En plus d’être le premier type de cellule où des contacts ER-organites ont été observés25,26, les hépatocytes ont un vaste système d’autres contacts interorganelles qui jouent un rôle vital dans leur architecture et leur physiologie28,40. Cependant, une caractérisation morphologique approfondie des contacts ER-organites et autres contacts interorganelles dans les hépatocytes fait encore défaut. En conséquence, la façon dont les contacts interorganelles se forment et se remodèlent pendant la régénération et la réparation est particulièrement pertinente pour la biologie des hépatocytes et la fonction hépatique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum trays</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira v6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C/4960/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T027</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>DiaTOME</td>
			<td>ultra 45&#176;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>D032</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers N5</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji TrakEM2 plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 36% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>F003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar coated slot grid</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with applicator rod</td>
			<td>Medisca</td>
			<td>6258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15364769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde 25% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>G011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNA/Methyl Nadic Anhydride</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>M011</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 2% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>O005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0050/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reuseable adhesive</td>
			<td>Blue Tack</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Lead Citrate</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>L037</td>
			<td>Section stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0250</td>
			<td>to make 0.1 M Caco buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>918-6872</td>
			<td>Cyanoacrylate glue, Step 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAAB 812 Resin</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T023</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two part Epoxy Resin</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>132-605</td>
			<td>Alternative: Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>100 &#181;m thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weldwood Original Contact cement</td>
			<td>DAP</td>
			<td>107</td>
			<td>Contact adhesive: Step 3.1.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional characterization of interorganelle contact sites in hepatocytes using serial section electron microscopy

La microscopie électronique à transmission a longtemps été considérée comme la référence en matière de visualisation de l’ultrastructure cellulaire. Cependant, l’analyse est souvent limitée à deux dimensions, ce qui entrave la capacité de décrire pleinement l’ultrastructure tridimensionnelle (3D) et la relation fonctionnelle entre les organites. La microscopie électronique volumique (vEM) décrit un ensemble de techniques qui permettent l’interrogation de l’ultrastructure cellulaire en 3D à des résolutions à méso-échelle, micro-échelle et nanométrique. 
Ce protocole fournit une méthode accessible et robuste pour acquérir des données vEM à l’aide de la transmission de section série EM (TEM) et couvre les aspects techniques du traitement des échantillons jusqu’à la reconstruction 3D numérique dans un flux de travail unique et simple. Pour démontrer l’utilité de cette technique, la relation ultrastructurale 3D entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries et leurs sites de contact dans les hépatocytes hépatiques est présentée. Les contacts interorganelles jouent un rôle essentiel dans le transfert d’ions, de lipides, de nutriments et d’autres petites molécules entre les organites. Cependant, malgré leur découverte initiale dans les hépatocytes, il reste encore beaucoup à apprendre sur leurs caractéristiques physiques, leur dynamique et leurs fonctions. 
Les contacts interorganelles peuvent afficher une gamme de morphologies, variant dans la proximité des deux organites l’un à l’autre (généralement ~ 10-30 nm) et l’étendue du site de contact (des contacts ponctués aux contacts cisternels 3D plus grands). L’examen des contacts étroits nécessite une imagerie à haute résolution, et la section série TEM est bien adaptée pour visualiser l’ultrastructure 3D des contacts interorganelles lors de la différenciation des hépatocytes, ainsi que les altérations de l’architecture des hépatocytes associées aux maladies métaboliques.

Pour cette technique, les régions d’intérêt sont sélectionnées en fonction de l’objectif de la recherche biologique et identifiées avant la coupe et le découpage des tissus incorporés. De même, la taille de la face du bloc peut être dictée par la question de recherche; dans ce cas, l’échantillon a été coupé pour laisser une face de bloc d’environ 0,3 mm x 0,15 mm (figure 4A). Cela a permis deux grilles de 9 sections en série par grille, fournissant 18 sections en sér...

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Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Un protocole simple et complet pour acquérir des détails tridimensionnels des sites de contact membranaire entre les organites dans les hépatocytes du foie ou les cellules d’autres tissus.

Caractérisation tridimensionnelle des sites de contact interorganelles dans les hépatocytes à l’aide de la microscopie électronique à section série

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Ce protocole permet la reconstruction 3D d’organites de manière simple et robuste, tout en étant accessible aux laboratoires qui ne disposent pas actuellement de microscopes électroniques de volume spécialisés. Cette technique est extrêmement flexible, offrant une excellente résolution X / Y, tout en pouvant ré-imager des échantillons si nécessaire. Il est également compatible avec la tomographie inclinable lorsque la très haute résolution Z est requise.Cette technique permet d’interroger la morphologie des organites dans un contexte inter-organites. Par conséquent, il peut être étendu pour examiner toutes les conditions pathologiques avec des défauts organites. Cette approche peut fournir un aperçu des interactions entre les organites et les événements de trafic cellulaire.Cette méthode peut également être appliquée à d’autres tissus, modèles organoïdes et systèmes de culture cellulaire, en plus des hépatocytes. Les nouveaux utilisateurs peuvent trouver le sectionnement en série et le ramassage difficiles sans perte. Il est recommandé d’être compétent dans la section ultra-mince régulière avant d’appliquer ce protocole à un échantillon précieux.Commencez par couper soigneusement le tissu incorporé dans la résine à l’aide d’une lame de rasoir avec l’échantillon verrouillé dans l’adaptateur de coupe. Transférez l’arche de spécimen avec le mandrin et l’échantillon dans le bras d’échantillon du microtome et positionnez l’arche de spécimen de sorte que la plage de déplacement de l’arche s’étende de haut en bas. Placez et verrouillez le couteau à diamant dans le porte-couteau, en vous assurant que l’angle de coupe du couteau est réglé de manière appropriée.Verrouillez le porte-couteau dans la scène en toute sécurité. Éteignez le downlighting de la scène, allumez l’éclairage de la scène, déplacez prudemment le couteau vers l’échantillon, en ajustant continuellement l’angle latéral, l’inclinaison de l’échantillon et la rotation de l’échantillon du couteau en ajustant les boutons pertinents jusqu’à ce que la face du bloc soit alignée sur le bord du couteau. Placez le haut et le bas de la fenêtre de coupe du bras de l’échantillon et laissez l’échantillon juste en dessous du bord du couteau.Remplissez le bateau à couteaux avec de l’eau propre et double distillée et assurez-vous que la surface de l’eau est au niveau du bord du couteau et légèrement concave. Ensuite, commencez à couper des sections. Arrêtez la coupe juste après que l’échantillon a passé le bord du couteau.Utilisez une grille d’emplacement vide pour estimer le nombre de sections à collecter sur chaque grille. À l’aide d’un cil dans chaque main, divisez doucement le ruban en rubans plus petits qui peuvent tenir dans la longueur de la grille de fente. Notez mentalement leur position relative au sein de l’échantillon.À l’aide d’une tige applicatrice en verre, faites glisser une goutte de chloroforme sur les sections pour les aplatir. Prenez la première grille de fente vide avec les premières pinces numérotées et trempez-la doucement dans le Triton X-100, puis deux fois dans l’eau distillée. Utilisez un morceau de papier filtre pour éliminer l’excès d’eau du bord de la pince.À l’aide d’une pince, abaissez doucement environ les 2/3 de la grille de fente recouverte de formvar dans l’eau du bateau à couteaux. Assurez-vous que le côté formvar est orienté vers le bas et que le long bord droit de la fente est à la surface de l’eau et parallèle au bord de l’eau. Agitez doucement la grille dans l’eau vers les rubans de sorte qu’au coup de retour, les sections dérivent vers la grille.Continuez à le faire dans des wafts de plus en plus petits, jusqu’à ce que le bord droit du ruban s’aligne avec le bord droit de la fente. Ensuite, avec la dernière vague, amenez doucement la grille vers le haut pour ramasser les sections dans la grille de fente. Placez plusieurs pastilles d’hydroxyde de sodium sous le couvercle d’une boîte de Pétri pour fournir un environnement sans dioxyde de carbone.Ensuite, pipettez soigneusement 40 microlitres de citrate de plomb de Reynold sur le parafilm, une goutte pour chaque grille. Inverser chaque grille sur la goutte de citrate de plomb et laisser protégé par le couvercle de la boîte de Petri pendant 7 à 10 minutes. Pendant que les grilles se tachent, placez cinq gouttes d’eau distillée d’environ 300 microlitres pour chaque grille sur le parafilm.À la fin de l’incubation du citrate de plomb, transférer chaque grille dans une gouttelette d’eau distillée pour la laver pendant une minute sans respirer directement sur les grilles. Répétez cette opération quatre fois de plus. Utilisez des pinces croisées numérotées pour ramasser la première grille.Touchez le bord de la grille pour filtrer le papier afin d’évacuer la majeure partie de l’eau et laissez sécher dans les pinces pendant au moins 20 minutes. Répétez cette opération pour chaque grille. À faible grossissement, observez l’ordre, l’emplacement et la position des sections série.Accédez à la section centrale de la série sur la grille. Parcourez l’échantillon et identifiez une région d’intérêt. Ensuite, observez l’échantillon au grossissement souhaité.Envisagez de collecter la série à un grossissement légèrement inférieur, car les sections ne sont souvent pas parfaitement alignées et les images peuvent devoir être recadrées plus tard. Ensuite, prenez des images de référence à des grossissements plus faibles. Cela aidera à apprécier le contexte de la région d’intérêt, son emplacement approximatif à différents grossissements par rapport aux limites de section et les caractéristiques de repère dans l’échantillon.Utilisez-les pour indiquer la région d’intérêt dans d’autres sections. Pour le référencement à l’écran, utilisez du mastic adhésif réutilisable, des autocollants ou un morceau de papier de rétroprojecteur collé à l’écran pour placer des marqueurs temporaires sur l’écran. Cela permettra de réimaginer en routine les mêmes caractéristiques de la région d’intérêt au centre de l’image dans l’ensemble de données.Ouvrez la pile d’images, spécifiez les mesures voxel et sélectionnez l’onglet Segmentation pour lancer la segmentation. Cliquez sur Nouveau dans le panneau de l’éditeur de segmentation pour définir de nouveaux objets dans la liste des matériaux. Cliquez avec le bouton droit de la souris pour modifier la couleur de l’objet et double-cliquez pour renommer l’objet.Pour la segmentation manuelle, choisissez l’outil de segmentation sous la liste des matériaux et sélectionnez l’outil de pinceau par défaut pour mettre en surbrillance les pixels. L’image en microscopie électronique de deux hépatocytes opposés est montrée ici. L’imagerie à grossissement plus élevé permet l’observation des détails morphologiques des différents organites avec une résolution nanométrique.L’image représentative montre la version segmentée du même tomogramme, la trace du réticulum endoplasmique, les mitochondries et les contacts intermembranaires entre l’ER et les mitochondries de différents espaces sont montrés ici. L’image représentative montre une ortho-tranche inclinée recouverte de traces de segmentation et de sa position relative dans l’ensemble de la mitochondrie. La reconstruction 3D des organites segmentés et des contacts endoplasmiques réticulum-mitochondries sous différents angles est montrée ici.Comme ce protocole est compatible avec la tomographie par inclinaison lorsque la résolution Z très élevée est nécessaire, il aide à résoudre les structures petites ou alambiquées. Cette technique est parfaite pour l’évaluation initiale de la relation spatiale entre différents organites et, par conséquent, particulièrement utile dans le domaine en progression des contacts membranaires à l’homéostasie membranaire.

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