Name: three-dimensional characterization of interorganelle contact sites in hepatocytes using serial section electron microscopy
Uploaded: 2022-06-09T13:00:00
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Wir danken Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro und Ania Straatman-Iwanowska für die fachkundige technische Unterstützung. Wir danken auch den Stefan-Labormitgliedern und Ian J. White für die hilfreichen Gespräche. J.J.B. wird durch MRC-Mittel für das MRC Laboratory of Molecular Cell Biology am UCL, Award Code MC_U12266B, unterstützt. C.J.S. wird durch MRC-Mittel für das MRC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit am UCL, Vergabecode MC_UU_00012/6, unterstützt. P.G. wird gefördert durch den Europäischen Forschungsrat, Förderkennzeichen ERC-2013-StG-337057.

Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des britischen Innenministeriums untergebracht, und die Gewebeentnahme wurde in Übereinstimmung mit dem UK Animal (Scientific Procedures) Act 1986 durchgeführt.
1. Fixierung und Vorbereitung der Proben
<ol><li>Sezieren Sie das Lebergewebe in Stücke von geeigneter Größe, etwa 8 mm x 8 mm x 3 mm, und legen Sie die Stücke in warme phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, 37 ° C).</li>
	<li>Injizieren Sie Raumtempe...

Eine zugängliche vEM-Technik zur Visualisierung der Organellenstruktur und -interaktionen in 3D wird in diesem Protokoll beschrieben. Die Morphologie der interorganellen Kontakte in Hepatozyten wird hier als Fallstudie vorgestellt. Dieser Ansatz wurde jedoch auch zur Untersuchung einer Vielzahl anderer Proben und Forschungsbereiche angewendet, darunter Schwann-Zell-Endothel-Interaktionen in peripheren Nerven 45, Weibel-Palade-Körper-Biogenese in Endothelzellen46, Frachtsekretion in Nierenzellen ...

Seit ihrer Erfindung in den 1930er Jahren haben Elektronenmikroskope es Forschern ermöglicht, die strukturellen Bestandteile von Zellen und Geweben zu visualisieren 1,2. Die meisten Untersuchungen haben 2D-Informationen geliefert, da das Erstellen von 3D-Modellen eine sorgfältige Sammlung serieller Abschnitte, manuelle Fotografie, Negativverarbeitung, manuelle Nachverfolgung und die Erstellung und Montage von 3D-Modellen aus Glas-, Kunststoff- oder Styropor 3,4 erfordert. Fast 70 Jahre später gab es erhebliche Fortschritte in zahlreichen Aspekten des Prozesses, von der Mikroskopleistung, der seriellen Schnittsammlung, der automatisierten digitalen Bildgebung, der ausgefeilten Software und Hardware für die 3D-Rekonstruktion, Visualisierung und Analyse bis hin zu alternativen Ansätzen für das, was heute allgemein als Volume EM (vEM) bezeichnet wird. Es wird allgemein angenommen, dass diese vEM-Techniken ultrastrukturelle 3D-Informationen bei Nanometerauflösungen über Mikrometerskalen liefern und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und neuere Rasterelektronenmikroskopie- (REM) Techniken umfassen. Siehe Bewertungen 5,6,7,8.
Zum Beispiel verwendet der fokussierte Ionenstrahl SEM (FIB-SEM) einen fokussierten Ionenstrahl in einem REM, um die Oberfläche des Blocks zwischen sequentiellen REM-Bildaufnahmen der Blockoberfläche wegzufräsen, was das wiederholte automatisierte Fräsen / Abbilden einer Probe ermöglicht und einen 3D-Datensatz für die Rekonstruktion 9,10 erstellt. Im Gegensatz dazu verwendet serielles Blockgesicht SEM (SBF-SEM) ein Ultramikrotom im REM, um Material von der Blockfläche vor der Bildgebung zu entfernen 11,12, während die Array-Tomographie ein zerstörungsfreier Prozess ist, der die Sammlung von seriellen Abschnitten auf Deckgläsern, Wafern oder Bändern erfordert, bevor ein automatisierter Workflow der Bildgebung des interessierenden Bereichs in sequenziellen Abschnitten im REM eingerichtet wird, um den 3D-Datensatz zu generieren 13 . Ähnlich wie bei der Array-Tomographie erfordert die serielle Schnitt-TEM (ssTEM), dass vor der Bildgebung physikalische Schnitte gesammelt werden. Diese Abschnitte werden jedoch in TEM-Rastern gesammelt und in einem TEM14,15,16 abgebildet. ssTEM kann durch Tilttomographie17,18,19 erweitert werden. Die serielle Neigungstomographie bietet die beste Auflösung in x, y und z, und obwohl sie zur Rekonstruktion ganzer Zellen20 verwendet wurde, ist sie eine ziemliche Herausforderung. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die praktischen Aspekte von ssTEM als der am besten zugänglichen vEM-Technik, die vielen EM-Labors zur Verfügung steht, die derzeit möglicherweise keinen Zugang zu spezialisierten Schnitt- oder vEM-Instrumenten haben, aber von der Generierung von 3D-vEM-Daten profitieren würden.
Die serielle Ultramikrotomie für die 3D-Rekonstruktion wurde bisher als Herausforderung angesehen. Es war schwierig, gerade Bänder mit gleichmäßiger Schnittstärke zu schneiden, in der Lage zu sein, Bänder der richtigen Größe in der richtigen Reihenfolge auf Gittern mit ausreichender Unterstützung anzuordnen und aufzunehmen, aber ohne Gitterbalken, die Bereiche von Interesse verdeckten, und vor allem, ohne Abschnitte zu verlieren, da eine unvollständige Serie eine vollständige 3D-Rekonstruktion verhindern kann21. Verbesserungen an kommerziellen Ultramikrotomen, Diamantschneid- und Trimmmessern 22,23, elektronenluzenten Stützfolien auf Gittern 21,24 und Klebstoffen zur Unterstützung der Schnitthaftung und Bandkonservierung 13,21 sind jedoch nur einige der inkrementellen Fortschritte im Laufe der Jahre, die die Technik in vielen Labors zur Routine gemacht haben. Sobald serielle Abschnitte gesammelt wurden, ist die serielle Bildgebung in TEM einfach und kann EM-Bilder mit Subnanometer-px-Größen in x und y liefern, was eine hochauflösende Abfrage der subzellulären Strukturen ermöglicht - eine potenzielle Anforderung für viele Forschungsfragen. Die hier vorgestellte Fallstudie zeigt die Verwendung von ssTEM und 3D-Rekonstruktion bei der Untersuchung von endoplasmatischen Retikulum (ER)-Organellenkontakten in Leberhepatozyten, wo ER-Organellen-Kontakte zuerst beobachtet wurden25,26.
Während die Notaufnahme an die Kernhülle angrenzt, nimmt sie auch enge Kontakte zu zahlreichen anderen Zellorganellen auf, darunter Lysosomen, Mitochondrien, Lipidtröpfchen und die Plasmamembran27. ER-Organellen-Kontakte wurden mit dem Fettstoffwechsel28, dem Phosphoinositid- und Calcium-Signalsystem29, der Autophagieregulation und der Stressreaktion30,31 in Verbindung gebracht. Die ER-Organellenkontakte und andere interorganelle Kontakte sind hochdynamische Strukturen, die auf zelluläre Stoffwechselbedürfnisse und extrazelluläre Hinweise reagieren. Es wurde gezeigt, dass sie morphologisch in ihrer Größe und Form und den Abständen zwischen Organellenmembranenvariieren 32,33. Es wird angenommen, dass diese ultrastrukturellen Unterschiede wahrscheinlich ihre unterschiedliche Protein-Lipid-Zusammensetzung und Funktionwiderspiegeln 34,35. Es ist jedoch immer noch eine herausfordernde Aufgabe, interorganelle Kontakte zu definieren und zu analysieren36. Daher ist ein zuverlässiges und dennoch einfaches Protokoll zur Untersuchung und Charakterisierung von interorganellen Kontakten für weitere Untersuchungen erforderlich.
Da ER-Organellenkontakte bei der Membran-zu-Membran-Trennung zwischen 10 und 30 nm liegen können, war der Goldstandard für die Identifizierung in der Vergangenheit TEM. Dünnschnittiges TEM hat eine spezifische Subdomänenlokalisation für residente ER-Proteine an verschiedenen Membrankontakten37 aufgedeckt. Traditionell hat dies ER-Organellen-Kontakte mit nm-Auflösung aufgedeckt, aber oft nur eine 2D-Ansicht dieser Wechselwirkungen präsentiert. vEM-Ansätze zeigen jedoch die ultrastrukturelle Darstellung und den Kontext dieser Kontaktstellen in 3D, was eine vollständige Rekonstruktion von Kontakten und eine genauere Klassifizierung von Kontakten (Punkt vs. röhrenförmig vs. zisternalähnlich) und Quantifizierung38,39 ermöglicht. Hepatozyten sind nicht nur der erste Zelltyp, bei dem ER-Organellenkontakte beobachtet wurden25,26, sondern haben auch ein umfangreiches System anderer interorganeller Kontakte, die in ihrer Architektur und Physiologie eine wichtige Rolle spielen 28,40. Eine gründliche morphologische Charakterisierung von ER-Organellen und anderen interorganellen Kontakten in Hepatozyten fehlt jedoch noch. Dementsprechend ist die Art und Weise, wie sich interorganelle Kontakte während der Regeneration und Reparatur bilden und umgestalten, von besonderer Relevanz für die Biologie und Leberfunktion der Hepatozyten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum trays</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira v6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C/4960/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T027</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>DiaTOME</td>
			<td>ultra 45&#176;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>D032</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers N5</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji TrakEM2 plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 36% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>F003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar coated slot grid</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with applicator rod</td>
			<td>Medisca</td>
			<td>6258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15364769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde 25% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>G011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNA/Methyl Nadic Anhydride</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>M011</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 2% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>O005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0050/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reuseable adhesive</td>
			<td>Blue Tack</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Lead Citrate</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>L037</td>
			<td>Section stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0250</td>
			<td>to make 0.1 M Caco buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>918-6872</td>
			<td>Cyanoacrylate glue, Step 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAAB 812 Resin</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T023</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two part Epoxy Resin</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>132-605</td>
			<td>Alternative: Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>100 &#181;m thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weldwood Original Contact cement</td>
			<td>DAP</td>
			<td>107</td>
			<td>Contact adhesive: Step 3.1.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional characterization of interorganelle contact sites in hepatocytes using serial section electron microscopy

Die Transmissionselektronenmikroskopie gilt seit langem als Goldstandard für die Visualisierung zellulärer Ultrastrukturen. Die Analyse ist jedoch oft auf zwei Dimensionen beschränkt, was die Fähigkeit behindert, die dreidimensionale (3D) Ultrastruktur und die funktionelle Beziehung zwischen Organellen vollständig zu beschreiben. Die Volumenelektronenmikroskopie (vEM) beschreibt eine Sammlung von Techniken, die die Abfrage der zellulären Ultrastruktur in 3D bei mesoskaligen, mikroskaligen und nanoskaligen Auflösungen ermöglichen. 
Dieses Protokoll bietet eine zugängliche und robuste Methode zur Erfassung von vEM-Daten mittels serieller Schnittübertragung EM (TEM) und deckt die technischen Aspekte der Probenbearbeitung bis hin zur digitalen 3D-Rekonstruktion in einem einzigen, unkomplizierten Workflow ab. Um die Nützlichkeit dieser Technik zu demonstrieren, wird die ultrastrukturelle 3D-Beziehung zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und den Mitochondrien und ihren Kontaktstellen in Leberhepatozyten vorgestellt. Interorganelle Kontakte spielen eine wichtige Rolle bei der Übertragung von Ionen, Lipiden, Nährstoffen und anderen kleinen Molekülen zwischen Organellen. Trotz ihrer ersten Entdeckung in Hepatozyten gibt es jedoch noch viel über ihre physikalischen Eigenschaften, Dynamik und Funktionen zu lernen. 
Interorganellenkontakte können eine Reihe von Morphologien aufweisen, die sich in der Nähe der beiden Organellen zueinander (typischerweise ~ 10-30 nm) und der Ausdehnung der Kontaktstelle (von punktuellen Kontakten bis zu größeren 3D-zisternenartigen Kontakten) unterscheiden. Die Untersuchung enger Kontakte erfordert eine hochauflösende Bildgebung, und der serielle Schnitt TEM eignet sich gut, um die ultrastrukturelle 3D-Struktur von interorganellen Kontakten während der Hepatozytendifferenzierung sowie Veränderungen in der Hepatozytenarchitektur im Zusammenhang mit Stoffwechselerkrankungen zu visualisieren.

Für diese Technik werden interessante Regionen auf der Grundlage des biologischen Forschungsziels ausgewählt und vor dem Trimmen und Schneiden von eingebettetem Gewebe identifiziert. Ebenso kann die Größe der Blockfläche durch die Forschungsfrage diktiert werden; In diesem Fall wurde die Probe so beschnitten, dass eine Blockfläche von etwa 0,3 mm x 0,15 mm übrig blieb (Abbildung 4A). Dies ermöglichte zwei Gitter von 9 seriellen Abschnitten pro Gitter, die 18 serielle Abschnitte liefe...

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Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Ein einfaches und umfassendes Protokoll, um dreidimensionale Details von Membrankontaktstellen zwischen Organellen in Hepatozyten aus der Leber oder Zellen in anderen Geweben zu erfassen.

Dreidimensionale Charakterisierung von interorganellen Kontaktstellen in Hepatozyten mittels serieller Schnittelektronenmikroskopie

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Dieses Protokoll ermöglicht die 3D-Rekonstruktion von Organellen auf einfache und robuste Weise, während es für Labors zugänglich ist, die derzeit nicht über spezielle Volumenelektronenmikroskope verfügen. Diese Technik ist extrem flexibel und bietet eine hervorragende X / Y-Auflösung, während sie bei Bedarf in der Lage ist, Proben erneut abzubilden. Es ist auch mit der Neigungstomographie kompatibel, wenn eine sehr hohe Z-Auflösung erforderlich ist.Diese Technik ermöglicht die Abfrage der Organellenmorphologie im interorganellen Kontext. Daher kann es erweitert werden, um pathologische Zustände mit Organellendefekten zu untersuchen. Dieser Ansatz kann Einblicke in Organelleninteraktionen und zelluläre Handelsereignisse geben.Diese Methode kann neben Hepatozyten auch auf andere Gewebe, Organoidmodelle und Zellkultursysteme angewendet werden. Erstbenutzer können serielle Abschnitte finden und ohne Verlust eine Herausforderung darstellen. Es wird empfohlen, sich mit regelmäßigen ultradünnen Schnitten vertraut zu machen, bevor Sie dieses Protokoll auf eine wertvolle Probe anwenden.Beginnen Sie mit dem sorgfältigen Trimmen des in Harz eingebetteten Gewebes mit einer Rasierklinge, wobei die Probe im Trimmadapter eingeschlossen ist. Übertragen Sie die Probenarche zusammen mit dem Futter und der Probe auf den Probenarm des Mikrotoms und positionieren Sie die Probenarche so, dass die Reichweite der Arche von oben nach unten verläuft. Legen Sie das Diamantmesser in den Messerhalter und verriegeln Sie es, um sicherzustellen, dass der Schnittwinkel des Messers entsprechend eingestellt ist.Verriegeln Sie den Messerhalter sicher in der Bühne. Schalten Sie die Bühnenbeleuchtung aus, schalten Sie die Bühnenbeleuchtung ein, bewegen Sie das Messer vorsichtig in Richtung der Probe und passen Sie den seitlichen Winkel des Messers, die Neigung der Probe und die Probenrotation kontinuierlich an, indem Sie die entsprechenden Knöpfe einstellen, bis die Blockfläche an der Messerkante ausgerichtet ist. Stellen Sie die Ober- und Unterseite des Schneidfensters des Probenarms ein und lassen Sie die Probe direkt unter der Messerkante.Füllen Sie das Messerboot mit sauberem, doppelt destilliertem Wasser und stellen Sie sicher, dass die Wasseroberfläche auf Augenhöhe mit der Messerkante und leicht konkav ist. Beginnen Sie dann mit dem Schneiden von Abschnitten. Stoppen Sie das Schneiden, kurz nachdem die Probe die Messerkante passiert hat.Verwenden Sie ein leeres Steckplatzraster, um die Anzahl der Abschnitte zu schätzen, die in jedem Raster gesammelt werden sollen. Brechen Sie das Band mit einer Wimpern in jeder Hand vorsichtig in kleinere Bänder, die in die Länge des Schlitzgitters passen. Notieren Sie sich ihre relativen Positionen innerhalb der Stichprobe.Bewegen Sie mit einem Glasapplikatorstab einen Tropfen Chloroform über die Abschnitte, um sie abzuflachen. Nehmen Sie das erste leere Schlitzgitter mit der ersten nummerierten Pinzette auf und tauchen Sie es vorsichtig in die Triton X-100 und dann zweimal in das destillierte Wasser. Verwenden Sie ein Stück Filterpapier, um das überschüssige Wasser von der Zangenkante zu entfernen.Senken Sie mit einer Pinzette vorsichtig etwa 2/3 des formvarbeschichteten Schlitzgitters in das Wasser des Messerbootes. Stellen Sie sicher, dass die Formvar-Seite nach unten zeigt und die lange rechte Kante des Schlitzes an der Wasseroberfläche und parallel zur Wasserkante liegt. Wehen Sie das Gitter sanft im Wasser in Richtung der Bänder, so dass beim Rückwärtsstrich die Abschnitte zum Gitter driften.Tun Sie dies weiterhin in immer kleineren Schwadronen, bis sich der rechte Rand des Bandes mit dem rechten Rand des Schlitzes ausrichtet. Bringen Sie dann mit dem letzten Waft das Raster vorsichtig nach oben, um die Abschnitte in das Slot-Gitter aufzunehmen. Legen Sie mehrere Pellets Natriumhydroxid unter einen Petrischalendeckel, um eine kohlendioxidfreie Umgebung zu schaffen.Pipettieren Sie dann vorsichtig 40-Mikroliter-Tropfen von Reynolds Bleicitrat auf den Parafilm, einen Tropfen für jedes Gitter. Drehen Sie jedes Gitter auf den Bleicitratabfall um und lassen Sie es 7 bis 10 Minuten durch den Petrischalendeckel geschützt stehen. Während die Gitter färben, legen Sie fünf etwa 300-Mikroliter-Tropfen destilliertes Wasser für jedes Gitter auf den Parafilm.Am Ende der Bleicitrat-Inkubation wird jedes Gitter in einen Tröpfchen destilliertes Wasser überführt, um es eine Minute lang zu waschen, ohne direkt auf den Gittern zu atmen. Wiederholen Sie dies vier weitere Male. Verwenden Sie nummerierte Crossover-Pinzetten, um das erste Raster aufzunehmen.Berühren Sie den Rand des Gitters, um das Papier zu filtern, um den größten Teil des Wassers abzuleiten und mindestens 20 Minuten in der Pinzette trocknen zu lassen. Wiederholen Sie dies für jedes Raster. Beobachten Sie bei geringer Vergrößerung die Reihenfolge, Position und Position der seriellen Abschnitte.Navigieren Sie zum mittleren Abschnitt der Serie im Raster. Durchsuchen Sie das Beispiel, und identifizieren Sie eine Region von Interesse. Beobachten Sie dann die Probe bei der gewünschten Vergrößerung.Erwägen Sie, die Serie mit einer etwas geringeren Vergrößerung zu sammeln, da Abschnitte oft nicht perfekt ausgerichtet sind und Bilder möglicherweise später zugeschnitten werden müssen. Als nächstes nehmen Sie Referenzbilder bei geringerer Vergrößerung auf. Auf diese Weise können Sie den Kontext der Region von Interesse, die ungefähre Position bei verschiedenen Vergrößerungen in Bezug auf Abschnittsgrenzen und die Markierungsmerkmale innerhalb des Beispiels würdigen.Verwenden Sie diese, um die Region von Interesse in anderen Abschnitten zu kennzeichnen. Verwenden Sie für die Bildschirmreferenzierung wiederverwendbaren Klebekitt, Aufkleber oder ein Stück Overheadprojektorpapier, das auf den Bildschirm geklebt wird, um temporäre Markierungen auf dem Bildschirm zu platzieren. Dies ermöglicht eine routinemäßige Neudarstellung der gleichen Merkmale der interessierenden Region in der Mitte des Bildes im gesamten Datensatz.Öffnen Sie den Image-Stack, geben Sie die Voxelmessungen an und wählen Sie die Registerkarte Segmentierung, um die Segmentierung zu starten. Klicken Sie im Bedienfeld des Segmentierungseditors auf Neu, um neue Objekte in der Materialliste zu definieren. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Farbe des Objekts zu ändern, und doppelklicken Sie, um das Objekt umzubenennen.Wählen Sie für die manuelle Segmentierung das Segmentierungswerkzeug unter der Materialliste und wählen Sie das Standardpinselwerkzeug aus, um die Pixel hervorzuheben. Hier ist das elektronenmikroskopische Bild von zwei gegenüberliegenden Hepatozyten dargestellt. Die Bildgebung mit höherer Vergrößerung ermöglicht die Beobachtung der morphologischen Details der verschiedenen Organellen mit Nanometerauflösung.Das repräsentative Bild zeigt die segmentierte Version desselben Tomogramms, Spuren des endoplasmatischen Retikulums, Mitochondrien und die Intermembrankontakte zwischen der Notaufnahme und den Mitochondrien verschiedener Räume. Das repräsentative Bild zeigt eine geneigte Orthoscheibe, die mit Segmentierungsspuren und ihrer relativen Position innerhalb des gesamten Mitochondriums überlagert ist. Hier wird eine 3D-Rekonstruktion der segmentierten Organellen und der endoplasmatischen Retikulum-Mitochondrien-Kontakte in verschiedenen Winkeln gezeigt.Da dieses Protokoll mit der Neigungstomographie kompatibel ist, wenn eine sehr hohe Z-Auflösung erforderlich ist, hilft es, kleine oder verworrene Strukturen aufzulösen. Diese Technik eignet sich perfekt für die erste Beurteilung der räumlichen Beziehung zwischen verschiedenen Organellen und ist daher besonders nützlich im fortschreitenden Feld von Membrankontakten an der Membranhomöostase.

Research

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Biology

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