Name: three-dimensional characterization of interorganelle contact sites in hepatocytes using serial section electron microscopy
Uploaded: 2022-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy at JoVE.com

אנו מודים לג'ואנה הנלי, רבקה פיאדיירו ואניה סטראטמן-איוונובסקה על סיוע טכני מומחה. אנו מודים גם לחברי המעבדה של סטפן ולאיאן ג'יי ווייט על דיונים מועילים. J.J.B. נתמך על ידי מימון MRC למעבדת MRC לביולוגיה מולקולרית של התא ב- UCL, קוד הפרס MC_U12266B. C.J.S. נתמך על ידי מימון MRC ליחידה האוניברסיטאית של מעבדת MRC לביולוגיה מולקולרית של התא ב- UCL, קוד פרס MC_UU_00012/6. P.G. ממומן על ידי המועצה האירופית למחקר, קוד מענק ERC-2013-StG-337057.

כל בעלי החיים שוכנו בהתאם להנחיות משרד הפנים הבריטי, וקצירת הרקמות בוצעה בהתאם לחוק החיות הבריטי (נהלים מדעיים) משנת 1986.
1. קיבוע והכנה של דגימות
<ol><li>נתחו את רקמת הכבד לחתיכות בגודל המתאים, כ-8 מ"מ x 8 מ"מ x 3 מ"מ, והניחו את החלקים בתמיסת מלח חמה עם מאגר פוספט (PBS, 37 מעלות צ?...

טכניקת vEM נגישה להדמיה של מבנה אברונים ואינטראקציות בתלת-ממד מתוארת בפרוטוקול זה. המורפולוגיה של מגעים בין-אורגניים בהפטוציטים מוצגת כמקרה בוחן כאן. עם זאת, גישה זו יושמה גם כדי לחקור מגוון דגימות ותחומי מחקר אחרים, כולל אינטראקציות של תאי שוואן-אנדותל בעצבים היקפיים45, ביוגנז...

מאז המצאתם בשנות ה-30 של המאה ה-20, מיקרוסקופי אלקטרונים אפשרו לחוקרים לדמיין את המרכיבים המבניים של תאים ורקמות 1,2. רוב החקירות סיפקו מידע דו-ממדי, שכן בניית מודלים תלת-ממדיים דורשת איסוף מקטעים סדרתיים קפדניים, צילום ידני, עיבוד שלילי, מעקב ידני, יצירה והרכבה של מודלים תלת-ממדיים מיריעות זכוכית, פלסטיק או קלקר 3,4. כמעט 70 שנה לאחר מכן, חלה התקדמות ניכרת בהיבטים רבים של התהליך, החל מביצועי מיקרוסקופ, איסוף מקטעים סדרתיים, הדמיה דיגיטלית אוטומטית, תוכנה וחומרה מתוחכמות לשחזור תלת-ממדי, הדמיה וניתוח וכלה בגישות חלופיות למה שמכונה כיום ביחד VOLUME EM (vEM). טכניקות vEM אלה נחשבות בדרך כלל כמספקות מידע אולטרה-סטרוקטורלי תלת-ממדי ברזולוציות ננומטר על פני קני מידה של מיקרון וכוללות מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) וטכניקות חדשות יותר של מיקרוסקופ אלקטרונים סורקים (SEM); ראה חוות דעת 5,6,7,8.
לדוגמה, קרן יונים ממוקדת SEM (FIB-SEM) משתמשת בקרן יונים ממוקדת בתוך SEM כדי לכרסם את פני השטח של הבלוק בין סריקות הדמיה SEM עוקבות של פני השטח של הבלוק, מה שמאפשר כרסום/הדמיה אוטומטיים חוזרים ונשנים של דגימה ובניית מערך נתונים תלת-ממדי לשחזור 9,10. לעומת זאת, SEM של פני בלוקים טוריים (SBF-SEM) משתמש ב- ultramicrotome בתוך ה- SEM כדי להסיר חומר מפני הבלוק לפני ההדמיה 11,12, בעוד שטומוגרפיה של מערך היא תהליך לא פולשני הדורש איסוף של מקטעים טוריים, על כיסויים, ופלים או קלטת, לפני הגדרת זרימת עבודה אוטומטית של הדמיית אזור העניין בקטעים רציפים ב- SEM כדי ליצור את ערכת הנתונים התלת-ממדית13 . בדומה לטומוגרפיה של מערך, מקטע טורי TEM (ssTEM) דורש איסוף מקטעים פיזיים לפני ההדמיה; עם זאת, מקטעים אלה נאספים ברשתות TEM ומצטלמים ב- TEM 14,15,16. ניתן להרחיב את ssTEM על ידי ביצוע טומוגרפיה הטיה 17,18,19. טומוגרפיה של הטיה טורית מספקת את הרזולוציה הטובה ביותר ב-x, y ו-z, ובעוד שהיא שימשה לשחזור תאים שלמים20, היא מאתגרת למדי. פרוטוקול זה מתמקד בהיבטים המעשיים של ssTEM כטכניקת ה- vEM הנגישה ביותר הזמינה למעבדות EM רבות שאולי אין להן כרגע גישה למקטעים מיוחדים או למכשירי vEM, אך ייהנו מיצירת נתוני vEM תלת-ממדיים.
אולטרה-מיקרוטומיה סדרתית לשחזור תלת-ממדי נחשבה בעבר למאתגרת. היה קשה לגזור סרטים ישרים בעובי חתך אחיד, להיות מסוגלים לסדר ולאסוף סרטים בגודל הנכון, בסדר הנכון, לרשתות עם תמיכה מספקת, אך ללא פסי רשת המסתירים אזורי עניין, והכי חשוב, מבלי לאבד קטעים, שכן סדרה לא שלמה עשויה למנוע שחזור תלת-ממדי מלא21. עם זאת, שיפורים באולטרה-מיקרוטומים מסחריים, סכיני חיתוך וגיזום יהלומים22,23, יריעות תמיכה בבלוטת אלקטרונים ברשתות21,24, ודבקים לסיוע בהדבקת מקטעים ושימור סרטים13,21 הם רק חלק מההתקדמות המצטברת לאורך השנים שהפכה את הטכניקה לשגרתית יותר במעבדות רבות. לאחר איסוף מקטעים סדרתיים, הדמיה סדרתית ב- TEM היא פשוטה ויכולה לספק תמונות EM עם גדלי px תת-ננומטריים ב- x ו- y, מה שמאפשר חקירה ברזולוציה גבוהה של המבנים התת-תאיים - דרישה פוטנציאלית לשאלות מחקר רבות. מחקר המקרה שהוצג כאן מדגים את השימוש ב- ssTEM ו- 3D שחזור במחקר של מגעים אנדופלסמיים מסוג רטיקולום (ER) - אברונים בהפטוציטים בכבד, שם נצפו לראשונה מגעי ER-אברונים25,26.
בעודו רציף עם המעטפת הגרעינית, ה-ER גם יוצר קשרים הדוקים עם אברוני תאים רבים אחרים, כולל ליזוזומים, מיטוכונדריה, טיפות שומנים וקרום פלזמה27. מגעי ER-אברונים היו מעורבים בחילוף החומרים של השומנים28, פוספוינוסיטיד ואיתות סידן29, ויסות אוטופגיה ותגובת עקה30,31. המגעים בין ER-אברונים ומגעים בין-אורגנטיים אחרים הם מבנים דינמיים מאוד המגיבים לצרכים מטבוליים תאיים ולרמזים חוץ-תאיים. הודגם כי הם משתנים מבחינה מורפולוגית בגודלם ובצורתם ובמרחקים שבין ממברנות אברונים32,33. ההערכה היא שהבדלים אולטרה-סטרוקטורליים אלה עשויים לשקף את הרכבי החלבון/שומנים השונים שלהם ולתפקד34,35. עם זאת, זו עדיין משימה מאתגרת להגדיר אנשי קשר בין-אורגניים ולנתח אותם36. לפיכך, נדרש פרוטוקול אמין אך פשוט לבחינה ואפיון של מגעים בין-אורגניים לצורך חקירות נוספות.
מכיוון שמגעי ER-אברונים יכולים לנוע בין 10 ל-30 ננומטר בהפרדת ממברנה לממברנה, תקן הזהב לזיהוי היה באופן היסטורי TEM. TEM בעל חתך דק חשף לוקליזציה ספציפית של תת-דומיינים עבור חלבוני ER תושבים במגעי ממברנה שונים37. באופן מסורתי, זה חשף מגעים ER-אברוניים עם רזולוציית nm, אך לעתים קרובות הציג רק תצוגה דו-ממדית של אינטראקציות אלה. עם זאת, גישות vEM חושפות את ההצגה וההקשר האולטרה-סטרוקטורליים של אתרי קשר אלה בתלת-ממד, ומאפשרות שחזור מלא של אנשי קשר וסיווג מדויק יותר של אנשי קשר (נקודה לעומת צינורית לעומת דמוית ציסטרנל) וכימות38,39. בנוסף להיותו סוג התא הראשון שבו נצפו מגעי ER-אברונים25,26, להפטוציטים יש מערכת נרחבת של מגעים בין-אורגניים אחרים המשרתים תפקידים חיוניים בארכיטקטורה ובפיזיולוגיה שלהם28,40. עם זאת, אפיון מורפולוגי יסודי של ER-אברון ומגעים בין-אורגניים אחרים בהפטוציטים עדיין חסר. לפיכך, האופן שבו נוצרים קשרים בין-אורגניים ומשתפצים במהלך התחדשות ותיקון רלוונטי במיוחד לביולוגיה של הפטוציטים ולתפקוד הכבד.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum trays</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira v6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C/4960/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T027</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>DiaTOME</td>
			<td>ultra 45&#176;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>D032</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers N5</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji TrakEM2 plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 36% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>F003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar coated slot grid</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with applicator rod</td>
			<td>Medisca</td>
			<td>6258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15364769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde 25% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>G011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNA/Methyl Nadic Anhydride</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>M011</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 2% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>O005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0050/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reuseable adhesive</td>
			<td>Blue Tack</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Lead Citrate</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>L037</td>
			<td>Section stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0250</td>
			<td>to make 0.1 M Caco buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>918-6872</td>
			<td>Cyanoacrylate glue, Step 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAAB 812 Resin</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T023</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two part Epoxy Resin</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>132-605</td>
			<td>Alternative: Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>100 &#181;m thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weldwood Original Contact cement</td>
			<td>DAP</td>
			<td>107</td>
			<td>Contact adhesive: Step 3.1.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional characterization of interorganelle contact sites in hepatocytes using serial section electron microscopy

מיקרוסקופיית אלקטרונים של תמסורת נחשבת זה מכבר לתקן הזהב להדמיה של מבנה-על תאי. עם זאת, האנליזה מוגבלת לעתים קרובות לשני ממדים, מה שמקשה על היכולת לתאר באופן מלא את המבנה התלת-ממדי (התלת-ממדי) ואת הקשר התפקודי בין האברונים. מיקרוסקופיית אלקטרונים בנפח (vEM) מתארת אוסף של טכניקות המאפשרות חקירה של מבנה-על תאי בתלת-ממד ברזולוציות מזוקליות, מיקרו-קנה מידה וננומטריות. 
פרוטוקול זה מספק שיטה נגישה וחזקה להשגת נתוני vEM באמצעות EM (TEM) של העברת מקטעים טוריים ומכסה את ההיבטים הטכניים של עיבוד דגימות עד לשחזור תלת-ממדי דיגיטלי בתהליך עבודה יחיד ופשוט. כדי להדגים את התועלת של טכניקה זו, מוצג הקשר האולטרה-סטרוקטורלי התלת-ממדי בין הרשתית האנדופלסמית והמיטוכונדריה לבין אתרי המגע שלהם בהפטוציטים בכבד. מגעים בין-אורגניים ממלאים תפקידים חיוניים בהעברת יונים, שומנים, חומרים מזינים ומולקולות קטנות אחרות בין אברונים. עם זאת, למרות הגילוי הראשוני שלהם בהפטוציטים, עדיין יש הרבה מה ללמוד על התכונות הפיזיות שלהם, הדינמיקה והתפקודים שלהם. 
אנשי קשר בין-אורגניים יכולים להציג מגוון של מורפולוגיות, המשתנות בסמיכות של שני האברונים זה לזה (בדרך כלל ~ 10-30 ננומטר) ובהיקף אתר המגע (החל מאנשי קשר נוקבים וכלה באנשי קשר תלת-ממדיים גדולים יותר דמויי ציסטרנל). בדיקת מגעים קרובים דורשת הדמיה ברזולוציה גבוהה, ו- TEM מקטע סדרתי מתאים היטב כדי לדמיין את האולטרה-סטרוקטורל התלת-ממדי של מגעים בין-אורגניים במהלך התמיינות הפטוציטים, כמו גם שינויים בארכיטקטורת הפטוציטים הקשורים למחלות מטבוליות.

עבור טכניקה זו, אזורי עניין נבחרים על סמך מטרת המחקר הביולוגי וזוהו לפני חיתוך וחיתוך של רקמות משובצות. באופן דומה, גודל פני הבלוק עשוי להיות מוכתב על ידי שאלת המחקר; במקרה זה, הדגימה נחתכה כדי להשאיר פני בלוק של כ-0.3 מ"מ x 0.15 מ"מ (איור 4A). זה איפשר שתי רשתות של 9 מקטעים טוריים לכל...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy at JoVE.com

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

פרוטוקול פשוט ומקיף לרכישת פרטים תלת מימדיים של אתרי מגע ממברנה בין אברונים בהפטוציטים מהכבד או תאים ברקמות אחרות.

אפיון תלת מימדי של אתרי מגע בין-אורגניים בהפטוציטים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים חתך טורי

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

פרוטוקול זה מאפשר שחזור תלת-ממדי של אברונים בצורה פשוטה וחזקה, תוך שהוא נגיש למעבדות שאין להן כיום מיקרוסקופים של אלקטרונים בנפח מומחה. טכניקה זו גמישה ביותר, ומספקת רזולוציית X/Y מצוינת, תוך היכולת לצלם מחדש דגימות במידת הצורך. הוא גם תואם לטומוגרפיה של הטיה כאשר נדרשת רזולוציית Z גבוהה מאוד.טכניקה זו מאפשרת חקירות של מורפולוגיה אברונית בהקשר בין-אברוני. לכן, ניתן להרחיב אותו כדי לבחון כל מצב פתולוגי עם פגמים אברוניים. גישה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציות אברונים ואירועי סחר בתאים.שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על רקמות אחרות, מודלים אורגנואידים, ומערכות תרביות תאים, בנוסף hepatocytes. משתמשים בפעם הראשונה עשויים למצוא חתך סדרתי ולהרים מאתגרים ללא אובדן. מומלץ להיות בקיאים בחתך דק במיוחד רגיל לפני החלת פרוטוקול זה על מדגם יקר ערך.התחל על ידי חיתוך קפדני של הרקמה המוטבעת בשרף באמצעות סכין גילוח כאשר הדגימה נעולה במתאם הזמירה. העבר את תיבת הדגימה יחד עם הצ'אק והדגימה לזרוע הדגימה של המיקרוטום ומיקם את ארון הדגימה כך שטווח הנסיעה של התיבה יעבור מלמעלה למטה. מניחים ונועלים את סכין היהלום במחזיק הסכין, ומבטיחים שזווית החיתוך של הסכין מוגדרת כראוי.נעל את מחזיק הסכינים לתוך הבמה בצורה מאובטחת. כבו את תאורת הבמה, הפעילו את תאורת הבמה, הזיזו בזהירות את הסכין לכיוון הדגימה, תוך כוונון מתמיד של הזווית הצידית של הסכין, הטיית הדגימה וסיבוב הדגימה על ידי התאמת הידיות הרלוונטיות עד שפני הבלוק מיושרים לקצה הסכין. הגדר את החלק העליון והתחתון של חלון החיתוך של זרוע הדגימה והשאר את הדגימה ממש מתחת לקצה הסכין.מלאו את סירת הסכינים במים נקיים ומזוקקים פעמיים וודאו כי פני המים מתואמים עם קצה הסכין וקעורים מעט. לאחר מכן, התחל לחתוך חלקים. עצרו את החיתוך רגע אחרי שהדגימה עברה את קצה הסכין.השתמש ברשת חריצים ריקה כדי להעריך את מספר המקטעים שיש לאסוף בכל רשת. באמצעות ריסים בכל יד, חלקו בעדינות את הסרט לסרטים קטנים יותר שיכולים להתאים לאורך רשת החריצים. רשום הערה מנטלית של מיקומם היחסי בתוך המדגם.באמצעות מוט אפליקטור מזכוכית, רחפו טיפה של כלורופורם מעל החלקים כדי לשטח אותם החוצה. הרימו את רשת החריצים הריקה הראשונה עם המלקחיים הממוספרים הראשונים וטבלו אותה בעדינות בטריטון X-100 ולאחר מכן פעמיים במים המזוקקים. השתמש בפיסת נייר סינון כדי להסיר את עודפי המים מקצה המלקחיים.באמצעות מלקחיים, הורידו בעדינות כ-2/3 מרשת החריצים המצופה בפורמבר לתוך המים של סירת הסכינים. ודאו שצד הפורמבר פונה כלפי מטה והקצה הימני הארוך של החריץ נמצא על פני המים ומקביל לשפת המים. סובבו בעדינות את הרשת במים לכיוון הסרטים, כך שעם השבץ החוזר, המקטעים נסחפים לכיוון הרשת.המשך לעשות זאת בתנועות קטנות יותר ויותר, עד שהקצה הימני של הסרט יתיישר עם הקצה הימני של החריץ. לאחר מכן, עם ה-waft האחרון, העלו בעדינות את הרשת למעלה כדי לאסוף את החלקים לרשת החריץ. הניחו מספר כדורים של נתרן הידרוקסיד מתחת למכסה צלחת פטרי כדי לספק סביבה נטולת פחמן דו-חמצני.לאחר מכן, בזהירות פיפטה 40-מיקרוליטר טיפות של ציטראט עופרת של ריינולד על הפרפילם, טיפה אחת לכל רשת. הופכים כל רשת על טיפת העופרת ציטראט ומשאירים מוגנים על ידי מכסה צלחת פטרי למשך 7 עד 10 דקות. בזמן שהרשתות מכתימות, הניחו חמש טיפות של מים מזוקקים בערך 300 מיקרוליטר לכל רשת על הפרפילם.בסוף הדגירה של עופרת ציטראט, מעבירים כל רשת לטיפת מים מזוקקים כדי לשטוף אותה במשך דקה אחת מבלי לנשום ישירות ברשתות. חזור על כך ארבע פעמים נוספות. השתמש במלקחיים מוצלבים ממוספרים כדי להרים את הרשת הראשונה.גע בקצה הרשת כדי לסנן נייר כדי לפתות את רוב המים ולאפשר לייבש את המלקחיים במשך 20 דקות לפחות. חזור על פעולה זו עבור כל רשת. בהגדלה נמוכה, שימו לב לסדר, למיקום ולמיקום של המקטעים הטוריים.נווט אל החלק האמצעי של הסדרה ברשת. עיין במדגם וזהה אזור עניין. לאחר מכן, התבונן במדגם בהגדלה הרצויה.שקול לאסוף את הסדרה בהגדלה מעט נמוכה יותר, מכיוון שלעתים קרובות החלקים אינם מיושרים בצורה מושלמת, וייתכן שיהיה צורך לחתוך תמונות מאוחר יותר. לאחר מכן, צלם תמונות הפניה בהגדלה נמוכה יותר. זה יעזור להעריך את ההקשר של אזור העניין, זה מיקום גס בהגדלות שונות ביחס לגבולות המקטע, ותכונות ציון דרך בתוך המדגם.השתמש בהם כדי לסמן את אזור העניין בסעיפים אחרים. עבור הפניה למסך, השתמש במרק דבק רב-פעמי, במדבקות או בפיסת נייר מקרן תקורה המודבקת על המסך כדי להציב טושים זמניים על המסך. זה יאפשר לדמיין מחדש באופן שגרתי את אותן תכונות של אזור העניין במרכז התמונה לאורך כל מערך הנתונים.פתחו את מחסנית התמונות, ציינו את מדידות הווקסל ובחרו בכרטיסיה 'סגמנטציה' כדי להתחיל בסגמנטציה. לחץ על חדש בחלונית עורך הפילוח כדי להגדיר אובייקטים חדשים ברשימת החומרים. לחץ לחיצה ימנית כדי לשנות את צבע האובייקט ולחץ פעמיים כדי לשנות את שם האובייקט.עבור סגמנטציה ידנית, בחר בכלי הפילוח שמתחת לרשימת החומרים ובחר בכלי המברשת המוגדר כברירת מחדל כדי להדגיש את הפיקסלים. תמונת מיקרוסקופיית האלקטרונים של שני הפטוציטים מנוגדים מוצגת כאן. הדמיית הגדלה גבוהה יותר מאפשרת תצפית על הפרטים המורפולוגיים של האברונים השונים ברזולוציה ננומטרית.התמונה הייצוגית מציגה את הגרסה המקוטעת של אותה טומוגרמה, עקבות של הרשתית האנדופלסמית, המיטוכונדריה והמגעים הבין-ממדיים בין ה-ER למיטוכונדריה של מרחבים שונים מוצגים כאן. התמונה הייצוגית מציגה שכבת אורתו-פרוסה מוטה עם עקבות סגמנטציה ומיקומה היחסי בתוך המיטוכונדריה כולה. שחזור תלת-ממדי של האברונים המפולחים והמגעים האנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בזוויות שונות מוצגים כאן.מכיוון שפרוטוקול זה תואם לטומוגרפיה של הטיה כאשר נדרשת רזולוציית Z גבוהה מאוד, הוא מסייע לפתור מבנים קטנים או מפותלים. טכניקה זו מושלמת להערכה ראשונית של הקשר המרחבי בין אברונים שונים, ולכן שימושית במיוחד בתחום המתקדם של מגעי ממברנה בהומאוסטזיס של הממברנה.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

אפיון של אירועים קלציפיקציה שימוש אופטי חיה מיקרוסקופית אלקטרונים טכניקות בתוך ימית תולעת-שפופרת

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Ultrastructure מיטוכונדריאלי תלת-ממד של שריר טיסה עקיף דרוזופילה התגלה על ידי אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

לימודי ממוקדות באמצעות פנים בלוק טורי וקרן יון ממוקדת סריקה אלקטרון מיקרוסקופ

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

סריקת בלוק-פנים טורית מיקרוסקופ אלקטרונים (SBF-SEM) של דגימות רקמה ביולוגית

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...