Name: three-dimensional characterization of interorganelle contact sites in hepatocytes using serial section electron microscopy
Uploaded: 2022-06-09T13:00:00
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Agradecemos a Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro e Ania Straatman-Iwanowska pela assistência técnica especializada. Agradecemos aos membros do laboratório Stefan e Ian J. White por discussões úteis. J.J.B. é apoiado pelo financiamento da MRC para o MrC Laboratory of Molecular Cell Biology na UCL, MC_U12266B de código de premiação. C.J.S. é apoiado pelo financiamento da MRC para o MrC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit na UCL, código de premiação MC_UU_00012/6. P.G. é financiado pelo Conselho Europeu de Pesquisa, código de concessão ERC-2013-StG-337057.

Todos os animais foram alojados de acordo com as diretrizes do Ministério do Interior do Reino Unido, e a colheita de tecidos foi realizada de acordo com a Lei de Animais (Procedimentos Científicos) do Reino Unido de 1986.
1. Fixação e preparação de espécimes
<ol><li>Disseque o tecido hepático em pedaços de tamanho apropriado, aproximadamente 8 mm x 8 mm x 3 mm, e coloque as peças em soro fisco tamponado quente (PBS, 37 °C).</li>
	<li>Injete temperatura ambiente (...

Uma técnica vEM acessível para visualizar a estrutura organela e interações em 3D é descrita neste protocolo. A morfologia dos contatos interorganelle em hepatócitos é apresentada como um estudo de caso aqui. No entanto, essa abordagem também tem sido aplicada para investigar uma variedade de outras amostras e áreas de pesquisa, incluindo interações endoteliais de células schwann em nervos periféricos45, biogênese corporal weibel palade em células endoteliais46</su...

Desde sua invenção na década de 1930, microscópios eletrônicos permitiram aos pesquisadores visualizar os componentes estruturais das células e tecidos 1,2. A maioria das investigações forneceu informações 2D, pois a construção de modelos 3D requer uma minuciosa coleção de seções seriais, fotografia manual, processamento negativo, rastreamento manual e a criação e montagem de modelos 3D a partir de folhas de vidro, plástico ou isopor 3,4. Quase 70 anos depois, houve avanços consideráveis em inúmeros aspectos do processo, desde o desempenho do microscópio, coleta de seções seriais, imagem digital automatizada, software e hardware sofisticados para reconstrução 3D, visualização e análise até abordagens alternativas para o que agora é chamado coletivamente de volume EM (vEM). Essas técnicas de vEM são geralmente consideradas para fornecer informações ultraestruturais 3D em resoluções de nanômetros através de escalas de micron e englobar as técnicas de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e novas técnicas de microscopia eletrônica de varredura (SEM); ver avaliações 5,6,7,8.
Por exemplo, o feixe de íons focados SEM (FIB-SEM) usa um feixe de íons focado dentro de um SEM para frear a superfície do bloco entre imagens sem sequenciais da superfície do bloco, permitindo a repetida fresagem/imagem automatizada de uma amostra e construindo um conjunto de dados 3D para reconstrução 9,10. Em contrapartida, a face de bloco serial SEM (SBF-SEM) usa um ultramicrotome dentro do SEM para remover material da face do bloco antes da imagem11,12, enquanto a tomografia de matriz é um processo não destrutivo que requer a coleta de seções seriais, em clipes de cobertura, wafers ou fita, antes de configurar um fluxo de trabalho automatizado de imagem da região de interesse em seções sequenciais no MEI para gerar os dados3Dset 13 . Semelhante à tomografia de matriz, a seção serial TEM (ssTEM) requer que seções físicas sejam coletadas antes da imagem; no entanto, essas seções são coletadas em grades TEM e imagens em um TEM 14,15,16. ssTEM pode ser estendido realizando tomografia inclinada 17,18,19. A tomografia de inclinação serial fornece a melhor resolução em x, y e z, e embora tenha sido usada para reconstruir células inteiras20, é razoavelmente desafiadora. Este protocolo se concentra nos aspectos práticos do SSTEM como a técnica vEM mais acessível disponível para muitos laboratórios EM que podem não ter acesso a seção especializada ou instrumentos vEM, mas se beneficiariam da geração de dados vEM 3D.
A ultramicrotomia serial para reconstrução 3D já foi considerada desafiadora. Era difícil cortar fitas retas de espessura de seção uniforme, ser capaz de organizar e pegar fitas do tamanho correto, na ordem correta, em grades com suporte suficiente, mas sem grades de grade obscurecendo regiões de interesse, e o mais importante, sem perder seções, pois uma série incompleta pode impedir a reconstrução 3D completa21. No entanto, melhorias nos ultrassoms comerciais, corte de diamantes e facasde corte 22,23, filmes de suporte lucente de elétrons nas grades21,24, e adesivos para auxiliar a adesão de seção e preservação da fita13,21 são apenas alguns dos avanços incrementais ao longo dos anos que tornaram a técnica mais rotineira em muitos laboratórios. Uma vez coletadas seções seriais, a imagem serial no TEM é simples e pode fornecer imagens EM com tamanhos px subnanômetros em x e y, permitindo interrogatórios de alta resolução das estruturas subcelulares - um requisito potencial para muitas questões de pesquisa. O estudo de caso aqui apresentado demonstra o uso de ssTEM e reconstrução 3D no estudo de contatos endoplasmicas de rcístulo (ER)-organela em hepatócitos hepáticos, onde os contatos ER-organela foram observados pela primeira vez25,26.
Apesar de ser contíguo com o envelope nuclear, o ER também faz contatos próximos com inúmeras outras organelas celulares, incluindo lysosomes, mitocôndrias, gotículas lipídicas e a membrana plasmática27. Os contatos er-organela foram implicados no metabolismo lipídico28, fosfoinostito e sinalização de cálcio29, regulação da autofagia e resposta ao estresse30,31. Os contatos er-organela e outros contatos interorganelle são estruturas altamente dinâmicas que respondem às necessidades metabólicas celulares e pistas extracelulares. Eles têm sido mostrados variando morfologicamente em seu tamanho e forma e as distâncias entre as membranas organela32,33. Acredita-se que essas diferenças ultraestruturais provavelmente refletem suas diferentes composições proteicas/lipídicas e funcionam34,35. No entanto, ainda é uma tarefa desafiadora definir contatos interorganelle e analisá-los36. Por isso, é necessário um protocolo confiável, porém simples, para examinar e caracterizar contatos interorganelle para investigações posteriores.
Como os contatos er-organela podem variar de 10 a 30 nm na separação membrana-membrana, o padrão-ouro para identificação tem sido historicamente TEM. O TEM de seção fina revelou localização específica de subdomínios para proteínas de ER residentes em contatos de membranadistinta 37. Tradicionalmente, isso tem revelado contatos er-organela com resolução nm, mas muitas vezes apenas apresentou uma visão 2D dessas interações. No entanto, as abordagens vEM revelam a apresentação ultraestrutural e o contexto desses sites de contato em 3D, permitindo a reconstrução completa dos contatos e classificação mais precisa de contatos (ponto vs. tubular vs. cisterna-like) e quantificação38,39. Além de ser o primeiro tipo de célula onde foram observados contatos ER-organela25,26, os hepatócitos possuem um extenso sistema de outros contatos interorganelles que servem a papéis vitais em sua arquitetura e fisiologia28,40. No entanto, ainda falta uma caracterização morfológica completa da ER-organela e de outros contatos interorganelles em hepatócitos. Assim, como os contatos interorganelle formam e remodelam durante a regeneração e reparação é de particular relevância para a biologia hepatocita e função hepática.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum trays</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira v6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C/4960/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T027</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>DiaTOME</td>
			<td>ultra 45&#176;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>D032</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers N5</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji TrakEM2 plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 36% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>F003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar coated slot grid</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with applicator rod</td>
			<td>Medisca</td>
			<td>6258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15364769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde 25% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>G011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNA/Methyl Nadic Anhydride</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>M011</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 2% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>O005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0050/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reuseable adhesive</td>
			<td>Blue Tack</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Lead Citrate</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>L037</td>
			<td>Section stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0250</td>
			<td>to make 0.1 M Caco buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>918-6872</td>
			<td>Cyanoacrylate glue, Step 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAAB 812 Resin</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T023</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two part Epoxy Resin</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>132-605</td>
			<td>Alternative: Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>100 &#181;m thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weldwood Original Contact cement</td>
			<td>DAP</td>
			<td>107</td>
			<td>Contact adhesive: Step 3.1.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional characterization of interorganelle contact sites in hepatocytes using serial section electron microscopy

A microscopia eletrônica de transmissão tem sido considerada por muito tempo o padrão-ouro para a visualização da ultraestrutura celular. No entanto, a análise é muitas vezes limitada a duas dimensões, dificultando a capacidade de descrever totalmente a ultraestrutura tridimensional (3D) e a relação funcional entre organelas. A microscopia eletrônica de volume (vEM) descreve uma coleção de técnicas que permitem o interrogatório da ultraestrutura celular em 3D em resoluções de mesoescala, microescala e nanoescala. 
Este protocolo fornece um método acessível e robusto para adquirir dados vEM usando a transmissão de seção serial EM (TEM) e abrange os aspectos técnicos do processamento de amostras até a reconstrução 3D digital em um único e simples fluxo de trabalho. Para demonstrar a utilidade dessa técnica, apresenta-se a relação ultraestrutural 3D entre o regúrio endoplasmático e mitocôndrias e seus locais de contato em hepatócitos hepáticos. Os contatos interorganelle servem papéis vitais na transferência de íons, lipídios, nutrientes e outras pequenas moléculas entre organelas. No entanto, apesar de sua descoberta inicial em hepatócitos, ainda há muito a aprender sobre suas características físicas, dinâmicas e funções. 
Os contatos de Interorganelle podem exibir uma gama de morfologias, variando na proximidade das duas organelas umas com as outras (tipicamente ~10-30 nm) e a extensão do local de contato (de contatos pontuados a contatos cisternas maiores). O exame de contatos próximos requer imagens de alta resolução, e a seção serial TEM é adequada para visualizar a ultraestruturação 3D de contatos interorganelle durante a diferenciação de hepatócitos, bem como alterações na arquitetura hepatócito associada a doenças metabólicas.

Para esta técnica, as regiões de interesse são selecionadas com base no objetivo de pesquisa biológica e identificadas antes do corte e secção do tecido incorporado. Da mesma forma, o tamanho da face do bloco pode ser ditado pela questão da pesquisa; neste caso, a amostra foi aparada para deixar uma face de bloco de aproximadamente 0,3 mm x 0,15 mm (Figura 4A). Isso permitiu duas grades de 9 seções seriais por grade, fornecendo 18 seções seriais e incorporando um volume de tecido ...

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Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Um protocolo simples e abrangente para adquirir detalhes tridimensionais de locais de contato de membrana entre organelas em hepatócitos do fígado ou células em outros tecidos.

Caracterização tridimensional de Sítios de Contato Interorganelle em Hepatócitos usando Microscopia eletrônica de seção serial

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Este protocolo permite a reconstrução 3D de organelas de forma simples e robusta, ao mesmo tempo em que é acessível a laboratórios que atualmente não possuem microscópios eletrônicos de volume especializado. Esta técnica é extremamente flexível, fornecendo excelente resolução X/Y, ao mesmo tempo em que pode re-imagem amostras, se necessário. Também é compatível com tomografia de inclinação quando é necessária uma resolução Z muito alta.Esta técnica permite interrogatórios de morfologia organela no contexto inter organela. Portanto, pode ser estendido para examinar quaisquer condições patológicas com defeitos organelas. Essa abordagem pode fornecer informações sobre interações organelas e eventos de tráfico celular.Esse método também pode ser aplicado a outros tecidos, modelos organoides e sistemas de cultura celular, além de hepatócitos. Os usuários iniciantes podem encontrar seção serial e pegar desafiador sem perdas. Recomenda-se ser proficiente em seção ultrafina regular antes de aplicar este protocolo a uma amostra preciosa.Comece aparando cuidadosamente o tecido embutido em resina usando uma lâmina de barbear com a amostra presa no adaptador de corte. Transfira a arca do espécime juntamente com o mandril e a amostra para o braço do espécime do microtome e posicione a arca do espécime para que o alcance de viagem da arca funcione de cima para baixo. Coloque e tranque a faca de diamante no suporte da faca, garantindo que o ângulo de corte da faca esteja definido adequadamente.Tranque o porta-faca no palco com segurança. Desligue o palco, ligue o palco iluminado, mova cautelosamente a faca em direção ao espécime, ajustando continuamente o ângulo lateral da faca, inclinação do espécime e rotação do espécime, ajustando os botões relevantes até que a face do bloco esteja alinhada à borda da faca. Coloque a parte superior e inferior da janela de corte do braço do espécime e deixe o espécime logo abaixo da borda da faca.Encha o barco da faca com água limpa e dupla destilada e certifique-se de que a superfície da água esteja nivelada com a borda da faca e ligeiramente côncava. Então, comece a cortar seções. Pare o corte logo após a amostra ter passado a ponta da faca.Use uma grade de ranhura vazia para estimar o número de seções para coletar em cada grade. Usando um cílio em cada mão, quebre suavemente a fita em fitas menores que podem caber no comprimento da grade de ranhura. Anote mentalmente suas posições relativas dentro da amostra.Usando uma haste aplicadora de vidro, passe uma gota de clorofórmio sobre as seções para achatá-las. Pegue a primeira grade de ranhura vazia com as primeiras fórceps numeradas e mergulhe-a suavemente no Triton X-100 e, em seguida, duas vezes na água destilada. Use um pedaço de papel filtro para remover o excesso de água da borda das fórceps.Usando fórceps, abaixe suavemente aproximadamente 2/3 da grade de fenda revestida de formvar na água do barco da faca. Certifique-se de que o lado formvar está voltado para baixo e a longa borda direita da fenda está na superfície da água e paralela à borda da água. Puxe suavemente a grade na água em direção às fitas de modo que, após o curso de retorno, as seções derivam em direção à grade.Continue a fazer isso em wafts cada vez menores, até que a borda direita da fita se a linha com a borda direita do slot. Em seguida, com o último waft, leve suavemente a grade para pegar as seções até a grade de ranhura. Coloque várias pelotas de hidróxido de sódio sob uma tampa de placa de Petri para fornecer um ambiente livre de dióxido de carbono.Em seguida, cuidadosamente pipeta 40-microliter gotas do citrato de chumbo de Reynold no parafilme, uma gota para cada grade. Inverta cada grade na queda do citrato de chumbo e deixe protegido pela tampa da placa de Petri por 7 a 10 minutos. Enquanto as grades estão manchando, coloque cinco gotas de aproximadamente 300 microliter de água destilada para cada rede no parafilme.No final da incubação do citrato de chumbo, transfira cada rede para uma gota de água destilada para lavar por um minuto sem respirar diretamente nas grades. Repita isso mais quatro vezes. Use fórceps cruzados numerados para pegar a primeira grade.Toque na borda da grade para filtrar o papel para afastar a maior parte da água e deixe secar nos fórceps por pelo menos 20 minutos. Repita isso para cada grade. Em baixa ampliação, observe a ordem, localização e posição das seções seriais.Navegue até a parte central da série na grade. Navegue pela amostra e identifique uma região de interesse. Em seguida, observe a amostra na ampliação desejada.Considere coletar a série em uma ampliação ligeiramente menor, pois as seções muitas vezes não estão perfeitamente alinhadas, e as imagens podem precisar ser cortadas mais tarde. Em seguida, tire imagens de referência em ampliações mais baixas. Isso ajudará a apreciar o contexto da região de interesse, é uma localização áspera em diferentes ampliações em relação aos limites da seção e características de referência dentro da amostra.Use-os para sinalizar a região de interesse em outras seções. Para fazer referências na tela, use massa adesiva reutilizável, adesivos ou um pedaço de papel do projetor aéreo colado na tela para colocar marcadores temporários na tela. Isso permitirá a reimaginação rotineira das mesmas características da região de interesse no centro da imagem ao longo do conjunto de dados.Abra a pilha de imagens, especifique as medidas do voxel e selecione a guia Segmentação para iniciar a segmentação. Clique em Novo no painel do editor de segmentação para definir novos objetos na lista de materiais. Clique com o botão direito do mouse para alterar a cor do objeto e clique duas vezes para renomear o objeto.Para segmentação manual, escolha a ferramenta de segmentação abaixo da lista de materiais e selecione a ferramenta de pincel padrão para destacar os pixels. A imagem de microscopia eletrônica de dois hepatócitos opostos é mostrada aqui. Imagens de ampliação mais elevadas permitem a observação dos detalhes morfológicos das diferentes organelas com resolução de nanômetros.A imagem representativa mostra a versão segmentada do mesmo tomograma, traço do ritúlume endoplasmático, mitocôndrias e os contatos intermembranos entre o ER e as mitocôndrias de diferentes espaços são mostrados aqui. A imagem representativa mostra uma orto-fatia inclinada sobreposta com traços de segmentação e sua posição relativa dentro de toda a mitocôndria. A reconstrução 3D das organelas segmentadas e os contatos endoplasmáticos de órticia-mitocôndrias em diferentes ângulos são mostrados aqui.Como este protocolo é compatível com a tomografia de inclinação quando é necessária uma resolução Z muito alta, ajuda a resolver estruturas pequenas ou complicadas. Esta técnica é perfeita para a avaliação inicial da relação espacial entre diferentes organelas e, portanto, particularmente útil no campo de progresso dos contatos de membrana na homeostase da membrana.

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