Name: three-dimensional characterization of interorganelle contact sites in hepatocytes using serial section electron microscopy
Uploaded: 2022-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy at JoVE.com

Мы благодарим Джоанну Хэнли, Ребекку Фиадейро и Аню Страатман-Ивановскую за экспертную техническую помощь. Мы также благодарим членов лаборатории Стефана и Яна Уайта за полезные обсуждения. J.J.B. поддерживается финансированием MRC Лаборатории молекулярной клеточной биологии MRC в UCL, код награды MC_U12266B. C.J.S. поддерживается финансированием MRC для Лаборатории молекулярной клеточной биологии MRC University Unit в UCL, код награды MC_UU_00012/6. P.G. финансируется Европейским исследовательским советом, код гранта ERC-2013-StG-337057.

Все животные содержались в соответствии с руководящими принципами Министерства внутренних дел Великобритании, а сбор тканей проводился в соответствии с Законом Великобритании о животных (научные процедуры) 1986 года.
1. Фиксация и подготовка образца
<ol><li>Рассей?...

Доступный метод vEM для визуализации структуры органелл и взаимодействий в 3D описан в этом протоколе. Морфология межорганных контактов в гепатоцитах представлена здесь в качестве тематического исследования. Однако этот подход также применялся для исследования множества других образц...

С момента своего изобретения в 1930-х годах электронные микроскопы позволили исследователям визуализировать структурные компоненты клеток и тканей 1,2. Большинство исследований предоставили 2D-информацию, так как построение 3D-моделей требует кропотливой последовательной коллекции секций, ручной фотографии, обработки негатива, ручной трассировки, а также создания и сборки 3D-моделей из листов стекла, пластика или пенополистирола 3,4. Почти 70 лет спустя были достигнуты значительные успехи во многих аспектах процесса, от производительности микроскопа, сбора последовательных секций, автоматизированной цифровой визуализации, сложного программного и аппаратного обеспечения для 3D-реконструкции, визуализации и анализа до альтернативных подходов к тому, что теперь в совокупности называется объемом EM (vEM). Эти методы vEM, как правило, считаются обеспечивающими 3D-ультраструктурную информацию с нанометровым разрешением в микронных масштабах и охватывающие просвечивающую электронную микроскопию (TEM) и более новые методы сканирующей электронной микроскопии (SEM); смотреть отзывы 5,6,7,8.
Например, сфокусированный ионный пучок SEM (FIB-SEM) использует сфокусированный ионный пучок внутри SEM для фрезерования поверхности блока между последовательными SEM-изображениями поверхности блока, что позволяет повторное автоматическое фрезерование / визуализацию образца и создание 3D-набора данных для реконструкции 9,10. В отличие от этого, SEM последовательного блока SEM (SBF-SEM) использует ультрамикротом внутри SEM для удаления материала из поверхности блока до визуализации 11,12, в то время как массивная томография является неразрушающим процессом, который требует сбора последовательных секций на крышках, пластинах или ленте, прежде чем настроить автоматизированный рабочий процесс визуализации интересующей области в последовательных секциях в SEM для создания набора 3D-данных13 . Подобно массивной томографии, последовательный срез TEM (ssTEM) требует, чтобы физические участки были собраны перед визуализацией; однако эти участки собираются на сетках ТЕА и изображаются в ТЕА 14,15,16. ssTEM можно продлить, выполнив наклонную томографию 17,18,19. Последовательная наклонная томография обеспечивает лучшее разрешение в x, y и z, и, хотя она использовалась для реконструкции целых клеток20, она достаточно сложна. Этот протокол фокусируется на практических аспектах ssTEM как наиболее доступного метода vEM, доступного для многих лабораторий EM, которые в настоящее время могут не иметь доступа к специализированным инструментам секционирования или vEM, но выиграют от создания данных 3D vEM.
Последовательная ультрамикротомия для 3D-реконструкции ранее считалась сложной задачей. Было трудно разрезать прямые ленты равномерной толщины сечения, уметь расставлять и подбирать ленты нужного размера, в правильном порядке, на сетки с достаточной опорой, но без сетчатых стержней, скрывающих интересующие участки, а главное, без потери секций, так как неполный ряд может помешать полной 3D-реконструкции21. Тем не менее, усовершенствования коммерческих ультрамикротомов, алмазной резки и обрезки ножей 22,23, электронных люцентных поддерживающих пленок на сетках 21,24 и клеев для вспомогательной адгезии сечения и сохранения ленты 13,21 - это лишь некоторые из постепенных достижений за эти годы, которые сделали технику более рутинной во многих лабораториях. После того, как последовательные участки были собраны, последовательная визуализация в TEM проста и может предоставить электромагнитные изображения с размерами субнанометра в x и y, что позволяет опрашивать субклеточные структуры с высоким разрешением - потенциальное требование для многих исследовательских вопросов. Представленное здесь тематическое исследование демонстрирует использование ssTEM и 3D-реконструкции при изучении эндоплазматических ретикулумных (ER)-органеллных контактов в гепатоцитах печени, где впервые наблюдались контакты ER-органелл25,26.
Будучи смежным с ядерной оболочкой, ER также устанавливает тесные контакты с многочисленными другими клеточными органеллами, включая лизосомы, митохондрии, липидные капли и плазматическую мембрану27. Контакты с ER-органеллами были вовлечены в метаболизм липидов28, передачу сигналов фосфоинозитида и кальция29, регуляцию аутофагии и реакцию на стресс30,31. Контакты ER-органелл и другие межорганные контакты являются высокодинамичными структурами, которые реагируют на клеточные метаболические потребности и внеклеточные сигналы. Было показано, что они морфологически различаются по размеру и форме, а расстояния между мембранами органелл 32,33. Считается, что эти ультраструктурные различия, вероятно, отражают их различные белковые / липидные составы и функцию34,35. Тем не менее, по-прежнему является сложной задачей определить межорганизационные контакты и проанализировать их36. Следовательно, для дальнейших исследований требуется надежный, но простой протокол для изучения и характеристики межорганизационных контактов.
Поскольку контакты ER-органелл могут варьироваться от 10 до 30 нм при мембранном разделении, золотым стандартом идентификации исторически был TEM. Тонкое сечение TEM выявило специфическую локализацию поддомена для резидентных ER-белков при различных мембранных контактах37. Традиционно это выявляло контакты ER-органелл с разрешением nm, но часто представляло только 2D-вид этих взаимодействий. Тем не менее, подходы vEM раскрывают ультраструктурное представление и контекст этих контактных участков в 3D, что позволяет полностью реконструировать контакты и более точную классификацию контактов (точечные и трубчатые против цистерноподобных) и количественную оценку38,39. Помимо того, что гепатоциты являются первым типом клеток, где наблюдалиськонтакты ER-органелл 25,26, они имеют обширную систему других межорганных контактов, которые играют жизненно важную роль в их архитектуре и физиологии28,40. Однако тщательная морфологическая характеристика ЭР-органелл и других межорганных контактов в гепатоцитах все еще отсутствует. Соответственно, то, как межорганные контакты формируются и ремоделируются во время регенерации и восстановления, имеет особое значение для биологии гепатоцитов и функции печени.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum trays</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira v6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C/4960/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T027</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>DiaTOME</td>
			<td>ultra 45&#176;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>D032</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers N5</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji TrakEM2 plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 36% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>F003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar coated slot grid</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with applicator rod</td>
			<td>Medisca</td>
			<td>6258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15364769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde 25% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>G011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNA/Methyl Nadic Anhydride</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>M011</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 2% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>O005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0050/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reuseable adhesive</td>
			<td>Blue Tack</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Lead Citrate</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>L037</td>
			<td>Section stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0250</td>
			<td>to make 0.1 M Caco buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>918-6872</td>
			<td>Cyanoacrylate glue, Step 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAAB 812 Resin</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T023</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two part Epoxy Resin</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>132-605</td>
			<td>Alternative: Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>100 &#181;m thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weldwood Original Contact cement</td>
			<td>DAP</td>
			<td>107</td>
			<td>Contact adhesive: Step 3.1.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional characterization of interorganelle contact sites in hepatocytes using serial section electron microscopy

Просвечивающая электронная микроскопия долгое время считалась золотым стандартом визуализации клеточной ультраструктуры. Однако анализ часто ограничивается двумя измерениями, препятствуя способности полностью описать трехмерную (3D) ультраструктуру и функциональную связь между органеллами. Объемная электронная микроскопия (vEM) описывает набор методов, которые позволяют исследовать клеточную ультраструктуру в 3D в мезомасштабном, микромасштабном и наноразмерном разрешениях. 
Этот протокол обеспечивает доступный и надежный метод получения данных vEM с использованием передачи EM последовательного сечения (TEM) и охватывает технические аспекты обработки образцов до цифровой 3D-реконструкции в едином, простом рабочем процессе. Чтобы продемонстрировать полезность этой методики, представлена 3D ультраструктурная связь между эндоплазматическим ретикулумом и митохондриями и их контактными сайтами в гепатоцитах печени. Межорганные контакты играют жизненно важную роль в переносе ионов, липидов, питательных веществ и других небольших молекул между органеллами. Однако, несмотря на их первоначальное открытие в гепатоцитах, еще многое предстоит узнать об их физических особенностях, динамике и функциях. 
Межорганные контакты могут отображать диапазон морфологий, варьирующихся в близости двух органелл друг к другу (обычно ~ 10-30 нм) и протяженности места контакта (от пунктатных контактов до более крупных 3D-цистерноподобных контактов). Исследование близких контактов требует визуализации с высоким разрешением, а последовательное сечение ТЭМ хорошо подходит для визуализации 3D-ультраструктуры межорганных контактов при дифференцировке гепатоцитов, а также изменений в архитектуре гепатоцитов, связанных с метаболическими заболеваниями.

Для этого метода области, представляющие интерес, выбираются на основе цели биологического исследования и идентифицируются до обрезки и разрезания встроенной ткани. Аналогичным образом, размер грани блока может быть продиктован исследовательским вопросом; в этом случае образец обре?...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy at JoVE.com

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Простой и всеобъемлющий протокол для получения трехмерных деталей мембранных контактов между органеллами в гепатоцитах из печени или клетками в других тканях.

Трехмерная характеристика межорганизационных контактных участков в гепатоцитах с помощью электронной микроскопии серийного сечения

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Этот протокол позволяет проводить 3D-реконструкцию органелл простым и надежным способом, будучи доступным для лабораторий, которые в настоящее время не имеют специализированных объемных электронных микроскопов. Этот метод чрезвычайно гибок, обеспечивая отличное разрешение X / Y, в то же время имея возможность повторно изображать образцы при необходимости. Он также совместим с наклонной томографией, когда требуется очень высокое разрешение Z.Этот метод позволяет исследовать морфологию органелл в межорганельном контексте. Поэтому его можно расширить для обследования любых патологических состояний с дефектами органелл. Этот подход может дать представление о взаимодействиях органелл и событиях клеточного трафика.Этот метод также может быть применен к другим тканям, органоидным моделям и системам клеточных культур, в дополнение к гепатоцитам. Начинающие пользователи могут найти последовательное секционирование и подобрать вызов без потерь. Рекомендуется владеть регулярным ультратонким сечением, прежде чем применять этот протокол к драгоценному образцу.Начните с тщательной обрезки ткани, встроенной в смолу, с помощью лезвия бритвы с образцом, запертым в адаптере для обрезки. Перенесите образец ковчега вместе с патроном и образцом на образец руки микротома и расположите образец ковчега так, чтобы диапазон перемещения ковчега простирался сверху вниз. Поместите и зафиксируйте алмазный нож в держателе ножа, убедившись, что угол резания ножа установлен соответствующим образом.Надежно зафиксируйте держатель ножа в сцене. Выключите понижающее освещение сцены, включите подсветку сцены, осторожно переместите нож к образцу, постоянно регулируя боковой угол ножа, наклон образца и вращение образца, регулируя соответствующие ручки, пока лицевая сторона блока не будет выровнена по краю ножа. Установите верхнюю и нижнюю части режущего окна руки образца и оставьте образец чуть ниже края ножа.Наполните лодку с ножом чистой, дважды дистиллированной водой и убедитесь, что поверхность воды равна кромке ножа и слегка вогнута. Затем приступайте к резке секций. Прекратите резку сразу после того, как образец пройдет лезвие ножа.Используйте сетку пустых слотов, чтобы оценить количество секций для сбора в каждой сетке. Используя ресницы в каждой руке, аккуратно разбейте ленту на более мелкие ленты, которые могут поместиться в длину сетки слота. Мысленно запишите их относительное положение в выборке.Используя стеклянный стержень аппликатора, наведите каплю хлороформа на секции, чтобы сгладить их. Возьмите первую пустую щелевую сетку с первыми пронумерованными щипцами и осторожно окуните ее в Triton X-100, а затем два раза в дистиллированную воду. Используйте лист фильтровальной бумаги, чтобы удалить лишнюю воду с края щипцов.Используя щипцы, осторожно опустите примерно 2/3 щелевой сетки с покрытием в воду ножевой лодки. Убедитесь, что сторона формвара обращена вниз, а длинный правый край прорези находится на поверхности воды и параллельно кромке воды. Осторожно положите сетку в воде к лентам, чтобы при обратном ударе секции дрейфовали к сетке.Продолжайте делать это все меньшими и меньшими взмахами, пока правый край ленты не выровняется с правым краем прорези. Затем, с последним взмахом, осторожно поднесите сетку вверх, чтобы поднять секции в сетку слотов. Поместите несколько гранул гидроксида натрия под крышку чашки Петри, чтобы обеспечить среду, свободную от углекислого газа.Затем аккуратно пипетку 40-микролитровой капли свинцового цитрата Рейнольда на парапленку, по одной капле на каждую сетку. Переверните каждую сетку на каплю цитрата свинца и оставьте защищенной крышкой чашки Петри на 7-10 минут. Пока сетки окрашиваются, поместите пять примерно 300-микролитровых капель дистиллированной воды на каждую сетку на парапленке.В конце инкубации свинцового цитрата переложите каждую сетку на каплю дистиллированной воды для промывания в течение одной минуты, не дыша прямо на сетках. Повторите это еще четыре раза. Используйте пронумерованные перекрестные щипцы, чтобы подобрать первую сетку.Прикоснитесь к краю сетки, чтобы фильтровать бумагу, чтобы отвести большую часть воды и дать высохнуть в щипцах не менее 20 минут. Повторите это для каждой сетки. При небольшом увеличении следите за порядком, расположением и положением последовательных секций.Перейдите к средней части серии на сетке. Просмотрите образец и определите интересующий регион. Затем понаблюдайте за образцом при нужном увеличении.Рассмотрите возможность сбора рядов при немного меньшем увеличении, так как участки часто не идеально выровнены, и изображения, возможно, придется обрезать позже. Затем сделайте эталонные изображения с меньшим увеличением. Это поможет оценить контекст интересующего региона, его грубое расположение при разных увеличениях по отношению к границам секций и ориентировочные особенности в выборке.Используйте их, чтобы обозначить интересующий регион в других разделах. Для ссылок на экран используйте многоразовую клеевую шпаклевку, наклейки или кусок бумаги для проектора, прикрепленный к экрану, чтобы разместить временные маркеры на экране. Это позволит рутинно переосмысливать одни и те же особенности интересующей области в центре изображения по всему набору данных.Откройте стек изображений, укажите измерения вокселя и перейдите на вкладку Сегментация, чтобы начать сегментацию. Нажмите кнопку Создать на панели редактора сегментации, чтобы определить новые объекты в списке материалов. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы изменить цвет объекта, и дважды щелкните, чтобы переименовать объект.Для сегментации вручную выберите инструмент сегментации под списком материалов и выберите инструмент кисти по умолчанию, чтобы выделить пикселы. Здесь показано изображение электронной микроскопии двух противоположных гепатоцитов. Визуализация с более высоким увеличением позволяет наблюдать морфологические детали различных органелл с нанометровым разрешением.Репрезентативное изображение показывает сегментированную версию той же томограммы, здесь показаны следы эндоплазматического ретикулума, митохондрий и межмембранные контакты между ER и митохондриями разных пространств. Репрезентативное изображение показывает наклонный орто-срез, наложенный на следы сегментации и его относительное положение во всей митохондрии. Здесь показана 3D-реконструкция сегментоядерных органелл и контактов эндоплазматического ретикулума-митохондрий под разными углами.Поскольку этот протокол совместим с наклонной томографией, когда требуется очень высокое разрешение Z, он помогает разрешать небольшие или запутанные структуры. Этот метод идеально подходит для первоначальной оценки пространственных отношений между различными органеллами, и, следовательно, особенно полезен в прогрессирующем поле мембранных контактов при мембранном гомеостазе.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Подготовка эмбрионов для электронной микроскопии Drosophila Эмбриональные трубки сердца

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Нано-FEM: Белка Локализация с использованием фото-активированного микроскопии локализации и электронная микроскопия

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET визуализации в трехмерных гидрогелей

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Трехмерная Суперразрешение Микроскопия F-актин филаментов интерферометрической фотоактивированного локализации микроскопии (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Характеристика кальцификации событий с использованием живого оптической и электронной микроскопии методы в морской Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D митохондриальной Ультраструктура дрозофилы косвенные полет мышцы показали серийный Секция электрон томография

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Подготовка биологический образец высокого давления замораживания, при содействии Микроволновая печь контрастности и минимальным смолы, встраивание образов тома

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

Целевые исследования с использованием серийного блока лица и целенаправленной ионного луча сканирования электронной микроскопии

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Последовательная блочно-лицевая сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) образцов биологических тканей

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...