Name: a tnbs-induced rodent model to study the pathogenic role of mechanical stress in crohn's disease
Uploaded: 2022-03-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease at JoVE.com

Questo lavoro è supportato in parte da sovvenzioni di NIH (R01 DK124611 a XZS) e del Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (W81XWH-20-1-0681 a XZS). Il lavoro di istologia è stato svolto con l'aiuto del laboratorio di patologia chirurgica utmb.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Texas Medical Branch (#0907051C). Per lo studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley maschi o femmine, di circa 8-9 settimane.
1. Preparazione animale
<ol><li>Ratti veloci per 24 ore e trattarli con lassativo (detergente intestinale, vedi Tabella dei materiali) durante la notte.</li>
	<li>Il giorno successivo,...

<ol>
	<li>Kappelman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+and+geographic+distribution+of+Crohn's+disease+and+ulcerative+colitis+in+the+United+States.">The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).</li><li>Hwang, J. M., Varma, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+for+inflammatory+bowel+disease.">Surgery for inflammatory bowel disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).</li><li>Latella, G., Rieder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+fibrosis:+Ready+to+be+reversed.">Intestinal fibrosis: Ready to be reversed.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).</li><li>Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms,+management,+and+treatment+of+fibrosis+in+patients+with+inflammatory+bowel+diseases.">Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).</li><li>Bettenworth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Crohn's+disease-associated+small+bowel+strictures+and+fibrosis+on+cross-sectional+imaging:+A+systematic+review.">Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review.</a> Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).</li><li>Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+hyperplasia/hypertrophy+is+the+most+prominent+histological+change+in+Crohn's+fibrostenosing+bowel+strictures:+A+semiquantitative+analysis+by+using+a+novel+histological+grading+scheme.">Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).</li><li>Olaison, G., Smedh, K., Sj&#246;dahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+course+of+Crohn's+disease+after+ileocolic+resection:+Endoscopically+visualised+ileal+ulcers+preceding+symptoms.">Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms.</a> Gut. 33 (3), 331-335 (1992).</li><li>Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+is+a+pro-inflammatory+stimulus+in+the+gut:+In+vitro,+in+vivo+and+ex+vivo+evidence.">Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence.</a> PLoS One. 9, 106242 (2014).</li><li>Gabella, G., Yamey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+collagen+by+smooth+muscle+in+the+hyertrophic+intestine.">Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine.</a> Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).</li><li>Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstruction+and+pseudo-obstruction+in+inflammatory+bowel+disease.">Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease.</a> Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).</li><li>Johnson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+stiffness+corresponding+to+strictured+bowel+induces+a+fibrogenic+response+in+human+colonic+fibroblasts.">Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts.</a> Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).</li><li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology.">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li><li>Cox, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertonic+saline+modulation+of+intestinal+tissue+stress+and+fluid+balance.">Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance.</a> Shock. 29 (5), 598-602 (2008).</li><li>Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+gene+expression+in+gut+smooth+muscle+cells.">Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells.</a> Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).</li><li>Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+motility+dysfunction+in+bowel+obstruction:+Role+of+stretch-induced+COX-2.">Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).</li><li>Gutierrez, J. A., Perr, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stretch+modulates+TGF-beta1+and+alpha1(I)+collagen+expression+in+fetal+human+intestinal+smooth+muscle+cells.">Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells.</a> American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).</li><li>Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTGF+is+a+central+mediator+of+tissue+remodeling+and+fibrosis+and+its+inhibition+can+reverse+the+process+of+fibrosis.">CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis.</a> Fibrogenesis Tissue Repair. 5, 24 (2012).</li><li>Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+the+Cyr61/CCN1+and+CTGF/CCN2+proteins.">Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins.</a> The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).</li><li>Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immune+and+genetic+responses+in+rat+models+of+Crohn's+colitis+and+ulcerative+colitis.">Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).</li><li>Antoniou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TNBS-induced+colitis+animal+model:+An+overview.">The TNBS-induced colitis animal model: An overview.</a> Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).</li><li>Shi, X. Z., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+of+Cav1.2+channel+with+VIP+and+VIP+receptor+agonists+and+antagonists:+A+novel+approach+to+designing+promotility+and+antimotility+agents.">Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).</li><li>Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+and+therapeutic+benefits+of+COX-2+inhibitor+on+motility+dysfunction+in+bowel+obstruction:+Roles+of+PGE2+and+EP+receptors.">Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).</li><li>Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon.">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li><li>Mudter, J., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Il-6+signaling+in+inflammatory+bowel+disease:+Pathophysiological+role+and+clinical+relevance.">Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance.</a> Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).</li><li>Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mechano-transcription+process+as+therapeutic+intervention+in+gastrointestinal+disorders.">Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).</li></ol>

La colite indotta da TNBS è stata introdotta nel 1989 ed è stata utilizzata come modello sperimentale della malattia di Crohn da allora 19,20,23. Le caratteristiche significative di questo modello nei roditori includono lo sviluppo di un'infiammazione transmurale che assomiglia molto alle lesioni istopatologiche sviluppate nella malattia di Crohn umana19,20. Precedenti...

La malattia infiammatoria intestinale (IBD), compresa la colite ulcerosa (UC) e il morbo di Crohn (CD), è caratterizzata da infiammazione cronica nel tratto gastrointestinale (GI). Colpisce ~ 1-2 milioni di americani1. I costi annuali stimati per l'assistenza IBD negli Stati Uniti sono di $ 11,8 miliardi. A differenza della UC, il CD è caratterizzato da infiammazione transmurale e formazione di stenosi 2,3. La formazione di stenosi (stenosi) si verifica fino al 70% dei pazienti con CD3 e può essere causata da infiammazione transmurale (stenosi infiammatoria) o fibrosi intestinale (stenosi fibrotica)4,5. La fibrosi intestinale è caratterizzata da un'eccessiva deposizione di collagene e da altre matrici extracellulari (ECM) con cellule muscolari lisce (SMC) come uno dei principali tipi di cellule mesenchimali coinvolte nel processo 3,4. L'iperplasia della muscolatura liscia associata all'ipertrofia è un altro cambiamento istologico significativo nella stenosi fibrotica nella CD6. Sebbene la formazione di stenosi nella CD sia associata a infiammazione cronica, nessun trattamento antinfiammatorio è efficace, ad eccezione del trattamento chirurgico 2,6. Tuttavia, le recidive post-chirurgiche sono quasi il 100%, dato il tempo sufficiente 2,7. Come risposta infiammatoria, la fibrosi e l'iperplasia SMC possono anche svilupparsi in condizioni non infiammatorie (cioè ostruzione intestinale) nell'intestino 8,9; si ritiene che sia i meccanismi dipendenti dall'infiammazione che quelli indipendenti siano coinvolti nella formazione dellastenosi 3,4. Dato che un'ampia ricerca sui meccanismi dipendenti dall'infiammazione non si è tradotta in alcuna terapia efficace per la formazione della stenosi, sono necessari studi sul possibile ruolo dei meccanismi indipendenti dall'infiammazione nella fibrosi intestinale.
Come fattore non infiammatorio, lo stress meccanico (SM) associato a edema, infiltrazione di cellule infiammatorie, deformazione dei tessuti, fibrosi e stenosi 10,11,12,13 è comunemente riscontrato nell'IBD, in particolare nella CD, che è caratterizzata da infiammazione transmurale. Lo stress meccanico è più notevole nella CD stenotica, dove la stenosi (infiammatoria o fibrotica) nel sito di infiammazione presenta stress meccanico nel tessuto locale e porta alla distensione del lume nel segmento prossimale al sito di ostruzione10,14. Precedenti studi in vitro hanno dimostrato che lo stress meccanico altera l'espressione genica di specifici mediatori infiammatori (cioè COX-2, IL-6)8,14,15 e fattori di crescita (cioè TGF-β) nei tessuti gastrointestinali, in particolare nelle cellule muscolari lisce intestinali (SMC)16. Studi recenti hanno anche scoperto che l'espressione di specifici mediatori pro-fibrotici come il fattore di crescita del tessuto connettivo (CTGF) è altamente sensibile allo stress meccanico17,18. È stato ipotizzato che lo stress meccanico potrebbe svolgere un ruolo patogeno indipendente nell'infiammazione, nella fibrosi e nel rimodellamento dei tessuti associati a CD. Tuttavia, il significato patogeno dello stress meccanico nell'infiammazione intestinale, nella fibrosi e nell'iperplasia della muscolatura liscia nella CD rimane in gran parte inesplorato. Ciò può essere in parte dovuto al fatto che l'infiammazione è un processo più visibile e meglio studiato rispetto allo stress meccanico. Ancora più importante, non esiste un modello animale ben definito di IBD per distinguere l'effetto dello stress meccanico da quello dell'infiammazione.
Il lavoro attuale descrive un modello di roditore di colite simile al Crohn indotta dall'iniezione intracolonica del reagente apteno acido solfonico 2,4,6-trinitrobenzene (TNBS)19,20, che può servire allo scopo di studiare il ruolo dello stress meccanico nella CD. È stato riscontrato che l'instillazione di TNBS ha indotto un'infiammazione transmurale localizzata (~ 2 cm di lunghezza) con restringimento del lume (stenosi) nel colon distale. La stenosi porta a marcata distensione intestinale (stress meccanico)14,15 ma infiammazione non visibile nel segmento del colon prossimale al sito di instillazione. Al contrario, il segmento del colon distale al sito di stenosi non presenta né infiammazione né stress meccanico. Cambiamenti significativi sito-specifici nell'espressione genica, nell'infiammazione, nella fibrosi e nell'iperplasia SMC sono stati osservati nei tre diversi siti. I risultati suggeriscono che lo stress meccanico, in particolare l'espressione genica indotta dallo stress meccanico, può svolgere un ruolo fondamentale nello sviluppo della fibrosi e dell'iperplasia nella colite di Crohn.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACT-1 Control Software Ver2.63</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DXM1200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1851196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1845097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer</td>
			<td>Dako</td>
			<td>AR310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako-Agilent Masson&#39;s Trichrome Kit ref# AR173</td>
			<td>Dako</td>
			<td>AR173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DXM1200 Digital Color HR Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DXM1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4352930E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Z Anesthesia</td>
			<td>E-Z Systems Inc.</td>
			<td>EZ-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>9.0.2 (161)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Corning Hank&#39;s Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium)</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>21-021-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23-900-667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Digital Imaging System</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>9120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical grade open end polyurethane catheter</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8890703013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E800 Upright Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 &#956;m, 7 x 8.5 cm</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1620215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative</td>
			<td>Miralax</td>
			<td>C8175</td>
			<td>Dose: 17g in 226 mL of water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250) 
			250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma H&#38;E Stain Kit #1</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS (Picrylsulfonic acid solution)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>92822</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tnbs-induced rodent model to study the pathogenic role of mechanical stress in crohn's disease

Le malattie infiammatorie intestinali (IBD) come il morbo di Crohn (CD) sono disturbi infiammatori cronici del tratto gastrointestinale che colpiscono circa 20 per 1.00.000 in Europa e negli Stati Uniti. La CD è caratterizzata da infiammazione transmurale, fibrosi intestinale e stenosi luminale. Sebbene le terapie antinfiammatorie possano aiutare a controllare l'infiammazione, non hanno efficacia sulla fibrosi e sulla stenosi nella CD. La patogenesi della CD non è ben compresa. Gli studi attuali si concentrano principalmente sulla delineazione dei meccanismi di risposta immunitaria intestinale disregolati. Mentre l'infiammazione transmurale associata a CD, la fibrosi intestinale e la stenosi luminale rappresentano tutte uno stress meccanico alla parete intestinale, il ruolo dello stress meccanico nella CD non è ben definito. Per determinare se lo stress meccanico svolge un ruolo patogeno indipendente nella CD, è stato sviluppato un protocollo di colite CD-like indotta da TNBS nei roditori. Questo modello di infiammazione e fibrosi transmurale indotta da TNBS assomiglia ai segni patologici della CD nel colon. È indotta dall'instillazione intracolonica di TNBS nel colon distale di ratti adulti Sprague-Dawley. In questo modello, l'infiammazione transmurale porta alla stenosi nel sito di instillazione del TNBS (Sito I). La distensione meccanica si osserva nella porzione prossimale al sito di instillazione (Sito P), rappresentando lo stress meccanico ma non l'infiammazione visibile. La porzione del colon distale all'infiammazione (Sito D) non presenta né infiammazione né stress meccanico. Sono stati osservati cambiamenti distintivi dell'espressione genica, della risposta immunitaria, della fibrosi e della crescita muscolare liscia in diversi siti (P, I e D), evidenziando un profondo impatto dello stress meccanico. Pertanto, questo modello di colite simile alla CD ci aiuterà a comprendere meglio i meccanismi patogenetici della CD, in particolare il ruolo dello stress meccanico e dell'espressione genica indotta dallo stress meccanico nella disregolazione immunitaria, nella fibrosi intestinale e nel rimodellamento dei tessuti nella CD.

Visione macroscopica della colite simile al Crohn indotta dall'instillazione intra-colon di TNBS Come mostrato nella Figura 1, l'instillazione intracolonica di TNBS nei ratti ha indotto un'infiammazione transmurale localizzata (~ 2 cm di lunghezza) con parete intestinale ispessita e lume ristretto (stenosi) nel sito di instillazione nel colon distale (Figura 1A). Il sito di instillazione di TNBS è indicato come sito I. Come risultato dell'in...

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A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease

Il presente protocollo descrive lo sviluppo di un modello di colite simile al Crohn nei roditori. L'infiammazione transmurale porta alla stenosi nel sito di instillazione del TNBS e l'allargamento meccanico è osservato nel segmento prossimale alla stenosi. Questi cambiamenti consentono di studiare lo stress meccanico nella colite.

Un modello di roditore indotto da TNBS per studiare il ruolo patogeno dello stress meccanico nella malattia di Crohn

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting ...

Quindi, nel nostro protocollo, l'instillazione intra-colonica di TNBS porta all'infiammazione transmurale nel sito di instillazione e alla distensione meccanica nel segmento prossimale all'infiammazione. Quindi questo imita la malattia di Crohn stenotica. Poiché il segmento prossimale è meccanicamente disteso ma non mostra un'infiammazione visibile, uno studio comparativo del segmento prossimale e del sito di infiammazione aiuta a determinare se lo stress meccanico svolge un ruolo nella colite di Crohn.Studi precedenti si concentrano solo sul sito di infiammazione. Il nostro protocollo che lavora su diversi siti del modello evidenzia un ruolo critico dello stress meccanico nella malattia di Crohn, in particolare nella malattia di Crohn stenotica. Per iniziare, posizionare i ratti sul tavolo dell'anestesia in posizione supina.Per indurre la colite, inserire un catetere poliuretanico di grado medico, aperto, attraverso l'ano per circa sette-otto centimetri dal bordo anale e instillare delicatamente TNBS nel colon. Somministrare i ratti di controllo fittizi con 250 microlitri di soluzione salina. Per aiutare la distribuzione di TNBS o soluzione salina ed evitare fuoriuscite, mantenere i ratti in posizione supina con la testa rivolta verso il basso con un angolo di circa 30 gradi, con l'ano chiuso per due minuti.Aprire l'addome del ratto usando forbici e pinze chirurgiche. Rimuovere con attenzione l'intero colon sopra il canale anale e trasferire immediatamente il colon in un tampone HBSS 1x ghiacciato. Raddrizzare i due punti nel buffer e misurare la lunghezza dei due punti utilizzando un righello.Prendi un filo di nylon e giralo intorno al colon per misurare la circonferenza esterna dei segmenti del colon in controllo e dei ratti trattati con TNBS. Prendi tessuti a tutto spessore per l'istologia. Tagliare il colon lungo la tavola mesenterica e pulire accuratamente il colon con il tampone HBSS.Valutare il colon per il punteggio di infiammazione macroscopica in base ai criteri predefiniti con modifiche minime. Raccogliere campioni di tessuto del colon da ratti trattati con TNBS nei siti P, I e D.Site P è la porzione da due a tre centimetri prima del margine orale del sito di infiammazione. Il sito I è il sito di infiammazione in cui viene instillato il TNBS, in genere da quattro a sei centimetri dalla fine del colon.Infine, il sito D è la porzione da uno a due centimetri distale al margine aborale del sito di infiammazione. L'instillazione intra-colonica di TNBS nei ratti ha indotto un'infiammazione transmurale localizzata di circa due centimetri di lunghezza con parete intestinale ispessita e lume ristretto nel sito di instillazione nel colon distale. Il sito di instillazione di TNBS è stato indicato come sito I.As risultato di infiammazione transmurale e stenosi, sia l'infiammazione che lo stress meccanico erano presenti nel sito I.La stenosi nel sito I ha portato a una marcata distensione del lume nel segmento prossimale al sito di instillazione di TNBS, indicato come sito P.La circonferenza del colon era significativamente aumentata nei siti P e I rispetto al colon di controllo fittizio.Mentre meccanicamente disteso, il sito P non ha mostrato infiammazione visibile. Al contrario, il segmento del colon distale all'instillazione di TNBS indicato come sito D non presentava né infiammazione né distensione meccanica. Il punteggio macroscopico dell'infiammazione nel sito I nei ratti trattati con TNBS è stato notevolmente aumentato rispetto ai controlli fittizi nei siti P e D dei ratti colite.I punteggi di infiammazione nei siti P e D non sono stati significativamente aumentati rispetto alla finzione. Quindi è importante studiare non solo il sito I ma i siti P e D nel modello, in quanto ciò aiuta a riconoscere il significato patogeno dello stress meccanico nella malattia di Crohn. Per determinare ulteriormente se lo stress meccanico è un fattore patogeno nell'infiammazione intestinale, si può anche provare a rilasciare la distensione meccanica alimentando gli animali esclusivamente con una dieta liquida e vedere se questo aiuta con l'infiammazione e la funzione intestinale.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Ricerca

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