Name: a tnbs-induced rodent model to study the pathogenic role of mechanical stress in crohn's disease
Uploaded: 2022-03-01T14:30:00
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Este trabalho é apoiado em parte por subvenções do NIH (R01 DK124611 para XZS) e do Departamento de Defesa dos EUA (W81XWH-20-1-0681 para XZS). O trabalho de histologia foi feito com a ajuda do Laboratório de Patologia Cirúrgica da UTMB.

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com o comitê institucional de cuidados e uso de animais da University of Texas Medical Branch (#0907051C). Ratos de Sprague-Dawley masculinos ou femininos, com ~8-9 semanas de idade, foram usados para o estudo.
1. Preparação animal
<ol><li>Ratos rápidos por 24 horas e tratá-los com laxante (limpador de intestino, ver Tabela de Materiais) durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, anestesiam ra...

<ol>
	<li>Kappelman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+and+geographic+distribution+of+Crohn's+disease+and+ulcerative+colitis+in+the+United+States.">The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).</li><li>Hwang, J. M., Varma, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+for+inflammatory+bowel+disease.">Surgery for inflammatory bowel disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).</li><li>Latella, G., Rieder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+fibrosis:+Ready+to+be+reversed.">Intestinal fibrosis: Ready to be reversed.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).</li><li>Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms,+management,+and+treatment+of+fibrosis+in+patients+with+inflammatory+bowel+diseases.">Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).</li><li>Bettenworth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Crohn's+disease-associated+small+bowel+strictures+and+fibrosis+on+cross-sectional+imaging:+A+systematic+review.">Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review.</a> Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).</li><li>Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+hyperplasia/hypertrophy+is+the+most+prominent+histological+change+in+Crohn's+fibrostenosing+bowel+strictures:+A+semiquantitative+analysis+by+using+a+novel+histological+grading+scheme.">Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).</li><li>Olaison, G., Smedh, K., Sj&#246;dahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+course+of+Crohn's+disease+after+ileocolic+resection:+Endoscopically+visualised+ileal+ulcers+preceding+symptoms.">Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms.</a> Gut. 33 (3), 331-335 (1992).</li><li>Lin, Y. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstruction+and+pseudo-obstruction+in+inflammatory+bowel+disease.">Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease.</a> Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).</li><li>Johnson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+stiffness+corresponding+to+strictured+bowel+induces+a+fibrogenic+response+in+human+colonic+fibroblasts.">Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts.</a> Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).</li><li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology.">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li><li>Cox, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertonic+saline+modulation+of+intestinal+tissue+stress+and+fluid+balance.">Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance.</a> Shock. 29 (5), 598-602 (2008).</li><li>Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+gene+expression+in+gut+smooth+muscle+cells.">Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells.</a> Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).</li><li>Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+motility+dysfunction+in+bowel+obstruction:+Role+of+stretch-induced+COX-2.">Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).</li><li>Gutierrez, J. A., Perr, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stretch+modulates+TGF-beta1+and+alpha1(I)+collagen+expression+in+fetal+human+intestinal+smooth+muscle+cells.">Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells.</a> American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).</li><li>Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTGF+is+a+central+mediator+of+tissue+remodeling+and+fibrosis+and+its+inhibition+can+reverse+the+process+of+fibrosis.">CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis.</a> Fibrogenesis Tissue Repair. 5, 24 (2012).</li><li>Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+the+Cyr61/CCN1+and+CTGF/CCN2+proteins.">Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins.</a> The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).</li><li>Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immune+and+genetic+responses+in+rat+models+of+Crohn's+colitis+and+ulcerative+colitis.">Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).</li><li>Antoniou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TNBS-induced+colitis+animal+model:+An+overview.">The TNBS-induced colitis animal model: An overview.</a> Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).</li><li>Shi, X. Z., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+of+Cav1.2+channel+with+VIP+and+VIP+receptor+agonists+and+antagonists:+A+novel+approach+to+designing+promotility+and+antimotility+agents.">Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).</li><li>Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+and+therapeutic+benefits+of+COX-2+inhibitor+on+motility+dysfunction+in+bowel+obstruction:+Roles+of+PGE2+and+EP+receptors.">Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).</li><li>Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon.">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li><li>Mudter, J., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Il-6+signaling+in+inflammatory+bowel+disease:+Pathophysiological+role+and+clinical+relevance.">Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance.</a> Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).</li><li>Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mechano-transcription+process+as+therapeutic+intervention+in+gastrointestinal+disorders.">Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).</li></ol>

A colite induzida pelo TNBS foi introduzida em 1989 e tem sido usada como modelo experimental da doença de Crohn desde então 19,20,23. Características significativas deste modelo em roedores incluem o desenvolvimento de uma inflamação transmural que se assemelha muito às lesões histopatológicas desenvolvidas na doença humana de Crohn19,20. Estudos anteriores sob...

A doença inflamatória intestinal (DII), incluindo colite ulcerativa (UC) e doença de Crohn (CD), é caracterizada por inflamação crônica no trato gastrointestinal (GI). Afeta ~1-2 milhões de americanos1. Os custos anuais estimados para os cuidados com o IBD nos EUA são de US$ 11,8 bilhões. Ao contrário da UC, o CD é caracterizado pela inflamação transmural e formação de rigidridade 2,3. A formação rigorosa (estenose) ocorre em até 70% dos pacientes com CD3 e pode ser causada por inflamação transmural (estenose inflamatória) ou fibrose intestinal (estenose fibrosa)4,5. A fibrose intestinal é caracterizada pela deposição excessiva de colágeno e outras matrizes extracelulares (ECM) com células musculares lisas (SMC) como um dos principais tipos de células mesenquimais envolvidas no processo 3,4. A hiperplasia muscular lisa associada à hipertrofia é outra mudança histológica significativa na estenose fibrosa no CD6. Embora a formação de rigor em CD esteja associada à inflamação crônica, nenhum tratamento anti-inflamatório é eficaz, exceto o tratamento cirúrgico 2,6. No entanto, as recidivas pós-cirurgia são quase 100%, dado tempo suficiente 2,7. Como resposta inflamatória, a fibrose e a hiperplasia SMC também podem desenvolver-se em condições não inflamatórias (ou seja, obstrução intestinal) no intestino 8,9; acredita-se que tanto mecanismos dependentes da inflamação quanto independentes estejam envolvidos na formação rigorosa 3,4. Dado que uma extensa pesquisa sobre os mecanismos dependentes da inflamação não se traduziu em nenhuma terapia eficaz para a formação de estritos, são necessários estudos sobre o possível papel de mecanismos independentes da inflamação na fibrose intestinal.
Como fator não inflamatório, o estresse mecânico (EM) associado ao edema, infiltração de células inflamatórias, deformação tecidual, fibrose e estenose 10,11,12,13 é comumente encontrado no DIB, especialmente o CD, que é caracterizado por inflamação transmural. O estresse mecânico é mais notável no CD estenético, onde a estenose (inflamatória ou fibrosa) no local da inflamação apresenta estresse mecânico no tecido local e leva à distensão do lúmen no segmento proximal ao local da obstrução10,14. Estudos in vitro anteriores demonstraram que o estresse mecânico altera a expressão genética de mediadores inflamatórios específicos (ou seja, COX-2, IL-6)8,14,15 e fatores de crescimento (ou seja, TGF-β) nos tecidos gastrointestinais, especialmente células musculares lisas do intestino (SMC)16. Estudos recentes também descobriram que a expressão de mediadores pró-fibrosos específicos, como o fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF) é altamente sensível ao estresse mecânico17,18. Foi a hipótese de que o estresse mecânico poderia desempenhar um papel patogênico independente na inflamação associada ao CD, fibrose e remodelagem tecidual. No entanto, a significância patogênica do estresse mecânico na inflamação intestinal, fibrose e hiperplasia muscular lisa em CD permanece em grande parte inexplorada. Isso pode ser em parte porque a inflamação é um processo mais visível e melhor estudado do que o estresse mecânico. Mais importante, não houve nenhum modelo animal bem definido de IBD para distinguir o efeito do estresse mecânico do da inflamação.
O trabalho atual descreve um modelo de roedor da colite semelhante a Crohn induzida pela injeção intracolônica de reagente hapten 2,4,6-6-trinitrobenzeno ácido sulfônico (TNBS)19,20, que pode servir para estudar o papel do estresse mecânico em CD. Verificou-se que a instilação TNBS induziu uma inflamação transmural localizada (~2 cm de comprimento) com estreitamento de lúmen (estenose) no cólon distal. A estenose leva à distensão intestinal marcada (estresse mecânico)14,15, mas não inflamação visível no segmento cólon proximal ao local de instilação. Pelo contrário, o segmento de cólon distal ao local da estenose não apresenta inflamação nem estresse mecânico. Foram observadas alterações significativas na expressão genética, inflamação, fibrose e hiperplasia SMC nos três locais diferentes. Os resultados sugerem que o estresse mecânico, particularmente a expressão genética induzida pelo estresse mecânico, pode desempenhar um papel crítico no desenvolvimento de fibrose e hiperplasia na colite de Crohn.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACT-1 Control Software Ver2.63</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DXM1200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1851196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1845097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer</td>
			<td>Dako</td>
			<td>AR310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako-Agilent Masson&#39;s Trichrome Kit ref# AR173</td>
			<td>Dako</td>
			<td>AR173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DXM1200 Digital Color HR Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DXM1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4352930E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Z Anesthesia</td>
			<td>E-Z Systems Inc.</td>
			<td>EZ-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>9.0.2 (161)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Corning Hank&#39;s Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium)</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>21-021-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23-900-667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Digital Imaging System</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>9120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical grade open end polyurethane catheter</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8890703013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E800 Upright Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 &#956;m, 7 x 8.5 cm</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1620215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative</td>
			<td>Miralax</td>
			<td>C8175</td>
			<td>Dose: 17g in 226 mL of water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250) 
			250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma H&#38;E Stain Kit #1</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS (Picrylsulfonic acid solution)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>92822</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tnbs-induced rodent model to study the pathogenic role of mechanical stress in crohn's disease

Doenças inflamatórias intestinais (DII) como a doença de Crohn (CD) são doenças inflamatórias crônicas do trato gastrointestinal que afetam aproximadamente 20 por 1.00.000 na Europa e nos EUA. O CD é caracterizado por inflamação transmural, fibrose intestinal e estenose luminal. Embora terapias anti-inflamatórias possam ajudar a controlar a inflamação, elas não têm eficácia na fibrose e estenose em CD. A patogênese do CD não é bem compreendida. Os estudos atuais se concentram principalmente na delineação de mecanismos de resposta imune intestinal desregulados. Embora a inflamação transmural associada ao CD, a fibrose intestinal e a estenose luminal representem estresse mecânico na parede intestinal, o papel do estresse mecânico no CD não é bem definido. Para determinar se o estresse mecânico desempenha um papel patogênico independente no CD, um protocolo do modelo de colite induzida por TNBS em roedores foi desenvolvido. Este modelo de inflamação transmural e fibrose induzido pelo TNBS se assemelha a marcas patológicas do CD no cólon. É induzida pela instilação intracolônica de TNBS no cólon distal de ratos adultos Sprague-Dawley. Neste modelo, a inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS (Site I). A distensão mecânica é observada na porção proximal ao local de instilação (Local P), representando estresse mecânico, mas não inflamação visível. A porção córica distal à inflamação (Local D) não apresenta inflamação nem estresse mecânico. Foram observadas alterações distintas da expressão genética, resposta imune, fibrose e crescimento muscular suave em diferentes locais (P, I e D), destacando um profundo impacto do estresse mecânico. Portanto, este modelo de colite semelhante a CD nos ajudará a entender melhor os mecanismos patogênicos do CD, particularmente o papel do estresse mecânico e da expressão genética induzida pelo estresse mecânico na desregulação imunológica, fibrose intestinal e remodelação tecidual em CD.

Visão macroscópica da colite semelhante a Crohn induzida pela instilação intra-cólon do TNBS Como mostrado na Figura 1, a instilação intracolônica de TNBS em ratos induziu uma inflamação transmural localizada (~2 cm de comprimento) com parede intestinal espessa e lúmen estreito (estenose) no local da instilação no cólon distal (Figura 1A). O site da instilação TNBS é referido como site I. Como resultado de inflamação transm...

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A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease

O presente protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo de colite semelhante a Crohn em roedores. A inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS, e o alargamento mecânico é observado no segmento proximal à estenose. Essas mudanças permitem estudar o estresse mecânico na colite.

Um modelo de roedor induzido pela TNBS para estudar o papel patogênico do estresse mecânico na doença de Crohn

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting ...

Assim, em nosso protocolo, a instilação intra-cólon de TNBS leva à inflamação transmural no local de instilação e à distensão mecânica no segmento proximal à inflamação. Então isso imita a doença de Crohn estenótico. Como o segmento proximal é mecanicamente distendido, mas não mostra uma inflamação visível, um estudo comparativo do segmento proximal e do local da inflamação ajuda a determinar se o estresse mecânico desempenha um papel na colite de Crohn.Estudos anteriores focam apenas no local da inflamação. Nosso protocolo de trabalho em diferentes locais no modelo destaca um papel crítico do estresse mecânico na doença de Crohn, particularmente na doença de Crohn estentica. Para começar, coloque os ratos na mesa de anestesia em uma posição supina.Para induzir colite, insira um cateter de poliuretano de grau médico, de ponta aberta através do ânus por aproximadamente sete a oito centímetros da beira anal, e insira suavemente TNBS no cólon. Administre os ratos de controle falsos com 250 microlitres de soro fisiológico. Para ajudar na distribuição de TNBS ou soro fisiológico e evitar derramamentos, mantenha os ratos em uma posição supina com a cabeça virada para baixo em um ângulo de aproximadamente 30 graus, com o ânus fechado por dois minutos.Abra o abdômen de rato usando tesouras de grau cirúrgico e fórceps. Remova cuidadosamente todo o cólon acima do canal anal e transfira o cólon imediatamente para o tampão HBSS 1x gelado. Endireitar o cólon no tampão e medir o comprimento do cólon usando uma régua.Pegue um fio de nylon e circule-o ao redor do cólon para medir a circunferência externa dos segmentos de cólon em controle e ratos tratados com TNBS. Tome tecidos de espessura total para histologia. Abra o cólon ao longo da placa mesentérica e limpe o cólon completamente com tampão HBSS.Avalie o cólon para escore de inflamação macroscópica com base nos critérios predefinidos com modificações mínimas. Coletar amostras de tecido cólon de ratos tratados com TNBS nos locais P, I e D.Site P é a porção de dois a três centímetros antes da margem oral do local da inflamação. O local I é o local de inflamação onde o TNBS é instilado, tipicamente de quatro a seis centímetros do final do cólon.Por fim, o local D é a porção de um a dois centímetros distal à margem aboral do local da inflamação. A instilação intra-cólon de TNBS em ratos induziu uma inflamação transmural localizada de aproximadamente dois centímetros de comprimento com parede intestinal espessa e lúmen estreito no local da instilação no cólon distal. O local da instilação do TNBS foi referido como local I.As resultado de inflamação transmural e estenose, tanto inflamação quanto estresse mecânico estavam presentes no local I.A estenose no local eu levei à distensão de lumen marcada no segmento proximal ao local da instilação TNBS, referida como local P.A circunferência do cólon foi significativamente aumentada nos locais P e Eu comparado ao controle sham colon.Embora mecanicamente distendido, o local P não apresentou inflamação visível. Pelo contrário, o segmento cólon distal à instilação TNBS referido como local D não apresentou inflamação nem distensão mecânica. O escore macroscópico de inflamação no local I nos ratos tratados com TNBS foi dramaticamente aumentado em comparação com os controles falsos nos locais P e D de ratos de colite.Os escores de inflamação nos locais P e D não foram significativamente aumentados em comparação com sham. Por isso, é importante estudar não apenas o site I, mas os locais P e D no modelo, pois isso ajuda a reconhecer a significância patogênica do estresse mecânico na doença de Crohn. Para determinar ainda mais se o estresse mecânico é um fator patogênico na inflamação intestinal, pode-se também tentar liberar a distensão mecânica alimentando os animais exclusivamente com dieta líquida e ver se isso ajuda com inflamação e função intestinal.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Imunologia e Infecção

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Leishmaniose cutânea na pele do dorso de Hamsters: um modelo útil para o rastreamento de drogas leishmanicidas

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

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Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Analisar o papel dos Nasopharyngeal-associado do tecido linforreticular (NALT) nas respostas do rato para Vacinas

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

O Modelo WinCF - Um Microcosmo barato e tratável de um muco Plugged Bronquíolo para estudar a Microbiologia do Pulmão Infecções

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Um modelo de cultura primária de células bolsas serosas Ex Vivo frango para estudar a patogênese de doenças infecciosas bolsas serosas vírus

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

Produção de partículas Pseudotyped para estudar a alta patogenicidade coronavírus em uma configuração de nível 2 de biossegurança

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...