Name: a tnbs-induced rodent model to study the pathogenic role of mechanical stress in crohn's disease
Uploaded: 2022-03-01T14:30:00
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Este trabajo es apoyado en parte por subvenciones de NIH (R01 DK124611 a XZS) y el Departamento de Defensa de los Estados Unidos (W81XWH-20-1-0681 a XZS). El trabajo de histología se realizó con la ayuda del Laboratorio de Patología Quirúrgica de UTMB.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Rama Médica de la Universidad de Texas (#0907051C). Se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho o hembra, de ~ 8-9 semanas de edad, para el estudio.
1. Preparación animal
<ol><li>Ayuna a las ratas durante 24 horas y trátalas con laxante (limpiador intestinal, ver Tabla de materiales) durante la noche.</li>
	<li>Al día siguiente, ...

<ol>
	<li>Kappelman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+and+geographic+distribution+of+Crohn's+disease+and+ulcerative+colitis+in+the+United+States.">The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).</li><li>Hwang, J. M., Varma, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+for+inflammatory+bowel+disease.">Surgery for inflammatory bowel disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).</li><li>Latella, G., Rieder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+fibrosis:+Ready+to+be+reversed.">Intestinal fibrosis: Ready to be reversed.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).</li><li>Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms,+management,+and+treatment+of+fibrosis+in+patients+with+inflammatory+bowel+diseases.">Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).</li><li>Bettenworth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Crohn's+disease-associated+small+bowel+strictures+and+fibrosis+on+cross-sectional+imaging:+A+systematic+review.">Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review.</a> Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).</li><li>Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+hyperplasia/hypertrophy+is+the+most+prominent+histological+change+in+Crohn's+fibrostenosing+bowel+strictures:+A+semiquantitative+analysis+by+using+a+novel+histological+grading+scheme.">Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).</li><li>Olaison, G., Smedh, K., Sj&#246;dahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+course+of+Crohn's+disease+after+ileocolic+resection:+Endoscopically+visualised+ileal+ulcers+preceding+symptoms.">Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms.</a> Gut. 33 (3), 331-335 (1992).</li><li>Lin, Y. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstruction+and+pseudo-obstruction+in+inflammatory+bowel+disease.">Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease.</a> Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).</li><li>Johnson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+stiffness+corresponding+to+strictured+bowel+induces+a+fibrogenic+response+in+human+colonic+fibroblasts.">Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts.</a> Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).</li><li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology.">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li><li>Cox, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertonic+saline+modulation+of+intestinal+tissue+stress+and+fluid+balance.">Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance.</a> Shock. 29 (5), 598-602 (2008).</li><li>Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+gene+expression+in+gut+smooth+muscle+cells.">Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells.</a> Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).</li><li>Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+motility+dysfunction+in+bowel+obstruction:+Role+of+stretch-induced+COX-2.">Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).</li><li>Gutierrez, J. A., Perr, H. 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E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTGF+is+a+central+mediator+of+tissue+remodeling+and+fibrosis+and+its+inhibition+can+reverse+the+process+of+fibrosis.">CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis.</a> Fibrogenesis Tissue Repair. 5, 24 (2012).</li><li>Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+the+Cyr61/CCN1+and+CTGF/CCN2+proteins.">Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins.</a> The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).</li><li>Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+of+Cav1.2+channel+with+VIP+and+VIP+receptor+agonists+and+antagonists:+A+novel+approach+to+designing+promotility+and+antimotility+agents.">Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).</li><li>Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+and+therapeutic+benefits+of+COX-2+inhibitor+on+motility+dysfunction+in+bowel+obstruction:+Roles+of+PGE2+and+EP+receptors.">Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).</li><li>Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon.">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li><li>Mudter, J., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Il-6+signaling+in+inflammatory+bowel+disease:+Pathophysiological+role+and+clinical+relevance.">Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance.</a> Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).</li><li>Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mechano-transcription+process+as+therapeutic+intervention+in+gastrointestinal+disorders.">Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).</li></ol>

La colitis inducida por TNBS se introdujo en 1989 y se ha utilizado como modelo experimental de la enfermedad de Crohn desde entonces 19,20,23. Las características significativas de este modelo en roedores incluyen el desarrollo de una inflamación transmural que se asemeja mucho a las lesiones histopatológicas desarrolladas en la enfermedad de Crohn humana19,20. Estud...

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII), incluida la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC), se caracteriza por una inflamación crónica en el tracto gastrointestinal (GI). Afecta a ~1-2 millones de estadounidenses1. Los costos anuales estimados para la atención de la EII en los Estados Unidos son de $ 11.8 mil millones. A diferencia de la CU, la EC se caracteriza por inflamación transmural y formación deestenosis 2,3. La formación de estenosis (estenosis) ocurre en hasta el 70% de los pacientes con EC3 y puede ser causada por inflamación transmural (estenosis inflamatoria) o fibrosis intestinal (estenosis fibrótica)4,5. La fibrosis intestinal se caracteriza por una deposición excesiva de colágeno y otras matrices extracelulares (ECM) con células del músculo liso (SMC) como uno de los principales tipos de células mesenquimales implicadas en el proceso 3,4. La hiperplasia del músculo liso asociada con hipertrofia es otro cambio histológico significativo en la estenosis fibrótica en laEC 6. Aunque la formación de estenosis en la EC se asocia con inflamación crónica, ningún tratamiento antiinflamatorio es efectivo, excepto el tratamiento quirúrgico 2,6. Sin embargo, las recurrencias postquirúrgicas son casi del 100%, dado el tiempo suficiente 2,7. Como respuesta inflamatoria, la fibrosis y la hiperplasia SMC también pueden desarrollarse en condiciones no inflamatorias (es decir, obstrucción intestinal) en el intestino 8,9; se cree que tanto los mecanismos dependientes de la inflamación como los independientes están involucrados en la formación deestenosis 3,4. Dado que la extensa investigación sobre los mecanismos dependientes de la inflamación no se ha traducido en ninguna terapia efectiva para la formación de estenosis, se necesitan estudios sobre el posible papel de los mecanismos independientes de la inflamación en la fibrosis intestinal.
Como factor no inflamatorio, el estrés mecánico (EM) asociado con edema, infiltración de células inflamatorias, deformación tisular, fibrosis y estenosis 10,11,12,13 se encuentra comúnmente en la EII, especialmente la EC, que se caracteriza por inflamación transmural. El estrés mecánico es más notable en la EC estenótica, donde la estenosis (inflamatoria o fibrótica) en el sitio de inflamación presenta estrés mecánico en el tejido local y conduce a la distensión de la luz en el segmento proximal al sitio de obstrucción10,14. Estudios previos in vitro han demostrado que el estrés mecánico altera la expresión génica de mediadores inflamatorios específicos (es decir, COX-2, IL-6)8,14,15 y factores de crecimiento (es decir, TGF-β) en los tejidos gastrointestinales, especialmente las células del músculo liso intestinal (SMC)16. Estudios recientes también encontraron que la expresión de mediadores profibróticos específicos como el factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) es altamente sensible al estrés mecánico17,18. Se planteó la hipótesis de que el estrés mecánico podría desempeñar un papel patógeno independiente en la inflamación asociada a la EC, la fibrosis y la remodelación de los tejidos. Sin embargo, la importancia patogénica del estrés mecánico en la inflamación intestinal, la fibrosis y la hiperplasia del músculo liso en la EC permanece en gran medida inexplorada. Esto puede deberse en parte a que la inflamación es un proceso más visible y mejor estudiado que el estrés mecánico. Más importante aún, no ha habido un modelo animal bien definido de EII para distinguir el efecto del estrés mecánico del de la inflamación.
El presente trabajo describe un modelo de roedor de colitis similar a la enfermedad de Crohn inducida por inyección intracolínica del reactivo de hapteno ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS)19,20, que puede servir para estudiar el papel del estrés mecánico en la EC. Se encontró que la instilación de TNBS indujo una inflamación transmural localizada (~ 2 cm de longitud) con estrechamiento de la luz (estenosis) en el colon distal. La estenosis conduce a una marcada distensión intestinal (estrés mecánico)14,15 pero no a una inflamación visible en el segmento colónico proximal al sitio de instilación. Por el contrario, el segmento del colon distal al sitio de estenosis no presenta inflamación ni estrés mecánico. Se observaron cambios significativos específicos del sitio en la expresión génica, la inflamación, la fibrosis y la hiperplasia SMC en los tres sitios diferentes. Los resultados sugieren que el estrés mecánico, particularmente la expresión génica inducida por el estrés mecánico, puede desempeñar un papel crítico en el desarrollo de fibrosis e hiperplasia en la colitis de Crohn.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACT-1 Control Software Ver2.63</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DXM1200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1851196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1845097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer</td>
			<td>Dako</td>
			<td>AR310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako-Agilent Masson&#39;s Trichrome Kit ref# AR173</td>
			<td>Dako</td>
			<td>AR173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DXM1200 Digital Color HR Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DXM1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4352930E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Z Anesthesia</td>
			<td>E-Z Systems Inc.</td>
			<td>EZ-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>9.0.2 (161)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Corning Hank&#39;s Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium)</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>21-021-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23-900-667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Digital Imaging System</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>9120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical grade open end polyurethane catheter</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8890703013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E800 Upright Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 &#956;m, 7 x 8.5 cm</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1620215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative</td>
			<td>Miralax</td>
			<td>C8175</td>
			<td>Dose: 17g in 226 mL of water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250) 
			250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma H&#38;E Stain Kit #1</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS (Picrylsulfonic acid solution)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>92822</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tnbs-induced rodent model to study the pathogenic role of mechanical stress in crohn's disease

Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) como la enfermedad de Crohn (EC) son trastornos inflamatorios crónicos del tracto gastrointestinal que afectan aproximadamente a 20 por cada 1,00,000 en Europa y Estados Unidos. La EC se caracteriza por inflamación transmural, fibrosis intestinal y estenosis luminal. Aunque las terapias antiinflamatorias pueden ayudar a controlar la inflamación, no tienen eficacia en la fibrosis y la estenosis en la EC. La patogénesis de la EC no se entiende bien. Los estudios actuales se centran principalmente en delinear los mecanismos desregulados de la respuesta inmune intestinal. Si bien la inflamación transmural asociada a la EC, la fibrosis intestinal y la estenosis luminal representan estrés mecánico en la pared intestinal, el papel del estrés mecánico en la EC no está bien definido. Para determinar si el estrés mecánico desempeña un papel patógeno independiente en la EC, se ha desarrollado un protocolo de modelo de colitis similar a la EC inducido por TNBS en roedores. Este modelo de inflamación transmural y fibrosis inducida por TNBS se asemeja a las características patológicas de la EC en el colon. Es inducida por la instilación intracolonica de TNBS en el colon distal de ratas Sprague-Dawley adultas. En este modelo, la inflamación transmural conduce a estenosis en el sitio de instilación de TNBS (Sitio I). La distensión mecánica se observa en la porción proximal al sitio de instilación (Sitio P), lo que representa estrés mecánico pero no inflamación visible. La porción colónica distal a la inflamación (Sitio D) no presenta inflamación ni estrés mecánico. Se observaron cambios distintivos de la expresión génica, la respuesta inmune, la fibrosis y el crecimiento del músculo liso en diferentes sitios (P, I y D), destacando un profundo impacto del estrés mecánico. Por lo tanto, este modelo de colitis similar a la EC nos ayudará a comprender mejor los mecanismos patógenos de la EC, particularmente el papel del estrés mecánico y la expresión génica inducida por el estrés mecánico en la desregulación inmune, la fibrosis intestinal y la remodelación de tejidos en la EC.

Visión macroscópica de la colitis similar a la de Crohn inducida por la instilación intracolónica de TNBS Como se muestra en la Figura 1, la instilación intracolónica de TNBS en ratas indujo una inflamación transmural localizada (~ 2 cm de longitud) con pared intestinal engrosada y lumen estrechado (estenosis) en el sitio de instilación en el colon distal (Figura 1A). El sitio de instilación de TNBS se conoce como sitio I. Como resul...

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A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease

El presente protocolo describe el desarrollo de un modelo de colitis similar a la enfermedad de Crohn en roedores. La inflamación transmural conduce a estenosis en el sitio de instilación de TNBS, y se observa agrandamiento mecánico en el segmento proximal a la estenosis. Estos cambios permiten estudiar el estrés mecánico en la colitis.

Un modelo de roedor inducido por TNBS para estudiar el papel patogénico del estrés mecánico en la enfermedad de Crohn

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting ...

Por lo tanto, en nuestro protocolo, la instilación intracolónica de TNBS conduce a la inflamación transmural en el sitio de instilación y la distensión mecánica en el segmento proximal a la inflamación. Así que esto imita la enfermedad de Crohn estenótica. Como el segmento proximal está distendido mecánicamente pero no muestra una inflamación visible, un estudio comparativo del segmento proximal y el sitio de inflamación ayuda a determinar si el estrés mecánico juega un papel en la colitis de Crohn.Los estudios anteriores se centran solo en el sitio de la inflamación. Nuestro protocolo que trabaja en diferentes sitios en el modelo destaca un papel crítico del estrés mecánico en la enfermedad de Crohn, particularmente en la enfermedad de Crohn estenótica. Para comenzar, coloque las ratas en la mesa de anestesia en posición supina.Para inducir la colitis, inserte un catéter de poliuretano de grado médico, abierto, a través del ano durante aproximadamente siete a ocho centímetros desde el borde anal, e instile suavemente TNBS en el colon. Administrar las ratas de control simuladas con 250 microlitros de solución salina. Para ayudar a la distribución de TNBS o solución salina y evitar derrames, mantenga a las ratas en posición supina con la cabeza hacia abajo en un ángulo de aproximadamente 30 grados, con el ano cerrado durante dos minutos.Abra el abdomen de la rata con tijeras y fórceps de grado quirúrgico. Retire cuidadosamente todo el colon por encima del canal anal y transfiera el colon inmediatamente al tampón 1x HBSS helado. Enderece los dos puntos en el búfer y mide la longitud de los dos puntos con una regla.Tome un hilo de nylon y rodee alrededor del colon para medir la circunferencia externa de los segmentos de colon en control y las ratas tratadas con TNBS. Tome tejidos de espesor completo para histología. Abra el colon a lo largo de la placa mesentérica y limpie el colon a fondo con el tampón HBSS.Evalúe el colon para la puntuación de inflamación macroscópica en función de los criterios predefinidos con modificaciones mínimas. Recolectar muestras de tejido colónico de ratas tratadas con TNBS en los sitios P, I y D.Site P es la porción de dos a tres centímetros antes del margen oral del sitio de inflamación. El sitio I es el sitio de inflamación donde se inculca TNBS, generalmente de cuatro a seis centímetros del extremo del colon.Finalmente, el sitio D es la porción de uno a dos centímetros distal al margen aboral del sitio de inflamación. La instilación intracolónica de TNBS en ratas indujo una inflamación transmural localizada de aproximadamente dos centímetros de longitud con pared intestinal engrosada y luz estrechada en el sitio de instilación en el colon distal. El sitio de instilación de TNBS se denominó sitio I.As resultado de la inflamación transmural y la estenosis, tanto la inflamación como el estrés mecánico estaban presentes en el sitio I.La estenosis en el sitio I condujo a una marcada distensión de la luz en el segmento proximal al sitio de instilación de TNBS, conocido como sitio P.La circunferencia del colon aumentó significativamente en los sitios P e I en comparación con el colon de control simulado.Aunque mecánicamente distendido, el sitio P no mostró inflamación visible. Por el contrario, el segmento colónico distal a la instilación TNBS denominada sitio D no presentó inflamación ni distensión mecánica. La puntuación macroscópica de la inflamación en el sitio I en las ratas tratadas con TNBS aumentó dramáticamente en comparación con los controles simulados en los sitios P y D de ratas con colitis.Las puntuaciones de inflamación en los sitios P y D no aumentaron significativamente en comparación con la simulación. Por lo tanto, es importante estudiar no solo el sitio I, sino también los sitios P y D en el modelo, ya que esto ayuda a reconocer la importancia patogénica del estrés mecánico en la enfermedad de Crohn. Para determinar aún más si el estrés mecánico es un factor patógeno en la inflamación intestinal, también se puede tratar de liberar la distensión mecánica alimentando a los animales exclusivamente con dieta líquida y ver si esto ayuda con la inflamación y la función intestinal.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Investigación

Inmunología e Infección

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Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudiar la heterogeneidad de diferenciación de los macrófagos humanos y polarización

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