Name: organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا. يشكر المؤلفون شركة Bioinformatics Solutions Inc. (واترلو ، كندا) و SPARC BioCentre (التحليل الجزيئي) في مستشفى الأطفال المرضى (تورونتو ، كندا) لمساهماتهم في الحصول على بيانات MS.

1. الاعتبارات المادية وإعداد العينات مسبقا
<ol><li>استخدم فقط المذيبات عالية النقاء (الأسيتون والكلوروفورم والميثانول) (>99.5٪) والمواد الكيميائية الخالية من الرطوبة الزائدة.</li>
	<li>تحضير محاليل كلوريد الصوديوم وكبريتات الزنك (1 م) في الماء. ملاحظة: يمكن تخزين محاليل الملح إلى أجل غير ...

يتم تحقيق التوصيف الأمثل للتصلب المتعدد عند استنفاد SDS المتبقي أقل من 10 أجزاء في المليون. في حين أن النهج البديلة ، مثل FASP والهضم على الخرز ، توفر استنفاد SDS الكمي مع الاسترداد المتغير31،32،33 ، فإن الهدف الأساسي من هطول الأمطار هو تحقيق أقصى قدر من...

أصبح تحليل البروتيوم بواسطة مطياف الكتلة صارما بشكل متزايد ، نظرا للحساسية المحسنة والدقة وسرعة المسح الضوئي وتعدد استخدامات أجهزة MS الحديثة. تساهم تطورات التصلب المتعدد في زيادة كفاءة تحديد البروتين وزيادة دقة الكمية1،2،3،4،5. مع تحسين أجهزة MS ، يطلب الباحثون استراتيجية متسقة لإعداد العينات الأمامية قادرة على الاسترداد الكمي للبروتينات عالية النقاء في أقل وقت ممكن عبر جميع مراحل سير العمل 6,7,8,9,10,11 . لتعكس بدقة حالة البروتيوم للنظام البيولوجي ، يجب عزل البروتينات من مصفوفة العينة الأصلية بطريقة فعالة وغير متحيزة. تحقيقا لهذه الغاية ، بما في ذلك الفاعل بالسطح ، مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، يضمن استخراج البروتين الفعال والذوبان12. ومع ذلك ، فإن SDS تتداخل بشدة مع تأين الرش الكهربائي ، مما يتسبب في قمع إشارة MS الشديد إذا لم يتم القضاء عليها بشكل صحيح13.
تتوفر استراتيجيات استنفاد SDS مختلفة لتحليل البروتيوم اللاحق ، مثل الاحتفاظ بالبروتينات فوق مرشح قطع الوزن الجزيئي الموجود داخل خراطيش الدوران التي يمكن التخلص منها 14،15،16. يفضل استخدام طريقة تحضير العينات بمساعدة المرشح (FASP) لأنها تستنفد SDS بشكل فعال أقل من 10 جزء في المليون ، مما يسهل MS الأمثل. ومع ذلك ، فإن استعادة البروتين باستخدام FASP متغيرة ، مما دفع إلى استكشاف تقنيات أخرى. تطورت الأساليب الكروماتوغرافية التي تلتقط البروتين (أو الفاعل بالسطح) بشكل انتقائي إلى خراطيش مريحة مختلفة أو تنسيقات قائمة على الخرز17،18،19،20،21. بالنظر إلى هذه الاستراتيجيات البسيطة والمتسقة (من الناحية المثالية) لتنقية البروتين ، غالبا ما يتم تجاهل النهج الكلاسيكي لهطول الأمطار بالبروتين باستخدام المذيبات العضوية كنهج واعد لعزل البروتين. في حين تبين أن هطول الأمطار المذيبات يستنفد SDS إلى ما دون المستويات الحرجة بنجاح ، فإن استعادة البروتين كانت مصدر قلق طويل الأمد لهذا النهج. لاحظت مجموعات متعددة تحيزا في استعادة البروتين ، مع غلة هطول الأمطار المنخفضة بشكل غير مقبول كدالة لتركيز البروتين والوزن الجزيئي وكره الماء22,23. نظرا لتنوع بروتوكولات هطول الأمطار المبلغ عنها في الأدبيات ، تم تطوير ظروف هطول الأمطار الموحدة. في عام 2013 ، أبلغ Crowell et al. لأول مرة عن اعتماد القوة الأيونية على كفاءة هطول الأمطار للبروتينات في 80٪ من الأسيتون24. بالنسبة لجميع البروتينات التي تم فحصها ، تبين أن إضافة ما يصل إلى 30 ملليمتر كلوريد الصوديوم ضرورية لتحقيق أقصى قدر من الغلة (ما يصل إلى 100٪ من الانتعاش). في الآونة الأخيرة ، أظهر نيكرسون وآخرون أن الجمع بين قوة أيونية أعلى (تصل إلى 100 ملليمتر) مع درجة حرارة مرتفعة (20 درجة مئوية) أثناء هطول الأمطار الأسيتون أعطى استردادا كميا قريبا في 2-5 دقيقة25. لوحظ انخفاض طفيف في استعادة البروتينات منخفضة الوزن الجزيئي (LMW). ولذلك، أظهر تقرير لاحق أعده باغالابادي وآخرون الاسترداد الناجح لبروتينات الكائنات الحية المحورة وببتيدات (≤5 كيلوداد) عن طريق الجمع بين أملاح محددة، ولا سيما كبريتات الزنك، مع مستوى أعلى من المذيبات العضوية (97٪ من الأسيتون)26.
في حين أن تحسين بروتوكول هطول الأمطار يضفي استراتيجية أكثر موثوقية لتنقية البروتين للبروتينات القائمة على MS ، فإن نجاح هطول الأمطار التقليدي يعتمد بشكل كبير على تقنية المستخدم. الهدف الأساسي من هذا العمل هو تقديم استراتيجية قوية لهطول الأمطار تسهل عزل حبيبات البروتين عن المادة الفائقة الملوثة. تم تطوير خرطوشة ترشيح يمكن التخلص منها للقضاء على السحب عن طريق عزل البروتين المجمع فوق مرشح غشاء PTFE المسامي27. تتم إزالة مكونات التداخل MS في supernatant بشكل فعال في خطوة طرد مركزي قصيرة ومنخفضة السرعة. توفر خرطوشة المرشح التي يمكن التخلص منها أيضا خرطوشة SPE قابلة للتبديل، مما يسهل تنظيف العينات لاحقا بعد إعادة الذوبان وهضم البروتين الاختياري، قبل قياس الطيف الكتلي.
يتم عرض سلسلة من سير عمل هطول الأمطار البروتيني الموصى به هنا ، بما في ذلك بروتوكولات الأسيتون والكلوروفورم / الميثانول / الماءالمعدلة 28 ، في شكل تقليدي (قائم على القارورة) وشبه آلي في خرطوشة ترشيح واستخراج ثنائية الحالة يمكن التخلص منها. يتم تسليط الضوء على عمليات استرداد البروتين الناتجة وكفاءة استنفاد SDS ، إلى جانب تغطية LC-MS / MS البروتينية من أسفل إلى أعلى ، لإظهار النتيجة المتوقعة من كل بروتوكول. وتناقش الفوائد والعيوب العملية المرتبطة بكل نهج.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >AC177170010</td>
			<td >&#8804;0.002 % aldehyde</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetonitrile</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A998-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ammonium Bicarbonate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>A6141-1KG</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta mercaptoethanol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bromophenol blue</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td >Bromophenol blue sodium salt</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >C298-400</td>
			<td >Chloroform</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formic Acid</td>
			<td >Honeywell</td>
			<td >56302</td>
			<td >Eluent additive for LC-MS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of standard protein mixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycerol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >356352-1L-M</td>
			<td >For molecular biology, &#62; 99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A4641</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A452SK-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >75-400-102</td>
			<td >up to 21,000 xg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >05-408-130</td>
			<td >tapered bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (2 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >02-681-321</td>
			<td >rounded bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (0.1-10 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >21-197-28</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (1-200 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-302</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (200-1000 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-303</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >13-710-903</td>
			<td >Micropipet Trio pack</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pepsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>P0525000</td>
			<td >Lyophilized powder,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#62;3200 units/ mg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProTrap XG</td>
			<td >Proteoform Scientific</td>
			<td >PXG-0002</td>
			<td >50 complete units per box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >S9888-1KG</td>
			<td >ACS reagent, &#62;99 %</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >28312</td>
			<td >powdered solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >timsTOF Pro Mass Spectrometer</td>
			<td >Bruker</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of liver proteome extract</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trifluoroacetic Acid</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >L06374.AP</td>
			<td >99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP152-500</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >9002-07-7</td>
			<td >From bovine pancreas, TPCK-treated</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Urea</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1610731</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water (deionized)</td>
			<td>Sartorius Arium Mini Water Purification System</td>
			<td>76307-662</td>
			<td >Type 1 ultrapure (18.2 M&#937; cm)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zinc Sulfate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>307491-100G</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry

في حين أن التطورات المتعددة في أدوات قياس الطيف الكتلي (MS) قد حسنت التحليل النوعي والكمي للبروتينات، فإن النهج الأمامية الأكثر موثوقية لعزل البروتينات وإثرائها ومعالجتها قبل التصلب المتعدد أمر بالغ الأهمية لتوصيف البروتيوم الناجح. إن استرداد البروتين المنخفض وغير المتناسق والشوائب المتبقية مثل المواد الخافضة للتوتر السطحي تضر بتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. غالبا ما يعتبر هطول الأمطار البروتينية غير موثوق به ، ويستغرق وقتا طويلا ، ويمثل تحديا تقنيا للأداء مقارنة باستراتيجيات إعداد العينات الأخرى. يتم التغلب على هذه المخاوف من خلال استخدام بروتوكولات هطول الأمطار البروتينية المثلى. بالنسبة لهطول الأمطار الأسيتون ، فإن الجمع بين أملاح محددة ، والتحكم في درجة الحرارة ، وتكوين المذيبات ، ووقت هطول الأمطار أمر بالغ الأهمية ، في حين أن كفاءة ترسيب الكلوروفورم / الميثانول / الماء تعتمد على السحب السليم والتلاعب بالقارورة. بدلا من ذلك ، يتم تبسيط بروتوكولات هطول الأمطار هذه وشبه آلية داخل خرطوشة دوران يمكن التخلص منها. يتم توضيح النتائج المتوقعة من ترسيب البروتين القائم على المذيبات في الشكل التقليدي واستخدام خرطوشة ترشيح واستخراج يمكن التخلص منها على مرحلتين. ويشمل ذلك التوصيف التفصيلي للمخاليط البروتينية عن طريق تحليل LC-MS/MS من أسفل إلى أعلى. كما يظهر الأداء المتفوق لسير العمل القائم على SDS بالنسبة للبروتين غير الملوث.

ويلخص الشكل 4 استنفاد SDS المتوقع بعد هطول البروتينات على أساس القارورة أو الخرطوشة في خرطوشة مرشح يمكن التخلص منها باستخدام الأسيتون. تتم مقارنة الحضانة التقليدية بين عشية وضحاها (-20 درجة مئوية) في الأسيتون ببروتوكول هطول الأمطار السريع للأسيتون في درجة حرارة الغرفة (الخطو...

Watch this Scientific Journal Video about Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry at JoVE.com

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

يصف هذا البروتوكول هطول البروتين القائم على المذيبات في ظل ظروف خاضعة للرقابة من أجل الاسترداد والتنقية القويين والسريعين لعينات البروتيوم قبل قياس الطيف الكتلي.

ترسيب البروتين العضوي القائم على المذيبات لتنقية البروتيوم القوية قبل قياس الطيف الكتلي

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

تم تصميم هذه البروتوكولات لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش وكذلك نقاء البروتينات من خلال هطول الأمطار القائمة على المذيبات. سنعرض لك بعض الحيل لإجراء هطول الأمطار في القوارير ، بالإضافة إلى نهج شبه آلي بتنسيق خرطوشة دوارة. لقد قمنا أيضا بتحسين بروتوكول هطول الأمطار ليكون متسقا وسريعا.يستغرق البروتوكول بأكمله بضع دقائق فقط. توضح هذه البروتوكولات أن هطول الأمطار المذيبة للبروتينات مثالي لإعداد العينات قبل قياس الطيف الكتلي. سوف تتناسب البروتوكولات بسلاسة مع سير العمل الاحترافي من أسفل إلى أعلى وكذلك من أعلى إلى أسفل.سيعرض لنا اليوم زيهنغ دانغ وفيكتوريا ميلر ، كبير العلماء في Proteoform Scientific في هاليفاكس ، نوفا سكوتيا ماصة 90 ميكرولتر من محلول البروتين الخالي من الجسيمات في أنبوب طرد مركزي دقيق من البولي بروبلين. ثم أضف 10 ميكرولترات من كلوريد الصوديوم المائي الخلد و 400 ميكرولتر من الأسيتون إلى محلول العينة ، وقم بتغطية القارورة واضغط عليها بلطف لدمج المذيبات. اسمح للقارورة باحتضانها.درجة حرارة الغرفة دون عائق لمدة لا تقل عن دقيقتين بعد الحضانة ، والطرد المركزي للعينات التي تشير إلى اتجاه القارورة وتدور لمدة دقيقتين على الأقل عند 10،000 RCF أو أعلى في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، لوحظت حبيبة بيضاء مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب. عند هذه النقطة، قم بفك غطاء الأنبوب وصب السوبرنات في حاوية نفايات عن طريق عكس الأنبوب.استخدم منشفة ورقية لسحب أي مذيب متبقي من القارورة. ل SDS التي تحتوي على عينات. استغني بعناية عن 400 ميكرولتر من الأسيتون الطازج دون إزعاج الكريات.قم بتوسيط العينة على الفور لمدة دقيقة واحدة عند 10،000 مرة من G أو أعلى في درجة حرارة الغرفة عن طريق وضع القارورة في الدوار في نفس اتجاه الدوران الأولي. قم بحساب مذيب الغسيل كما هو موضح سابقا. جفف العينة مع فتح الغطاء لمدة دقيقة واحدة تقريبا.في غطاء الدخان ، قبل ذوبان الكريات. استغني عن 100 ميكرولتر من محلول البروتين في قارورة من البولي بروبلين. في غطاء الدخان ، أضف 400 ميكرولتر من الميثانول متبوعا ب 100 ميكرولتر من الكلوروفورم.قم بتغطية القارورة والدوامة لفترة وجيزة للخلط. قم بتوزيع 300 ميكرولتر من الماء بسرعة مباشرة في وسط القارورة. قم بتغطية القارورة واتركها تجلس على سطح المقعد دون إزعاج لمدة دقيقة واحدة ، بعد وضع قارورة البولي بروبيلين في جهاز طرد مركزي وتدويرها لمدة خمس دقائق عند 10،000 مرة من الغرام أو أعلى في درجة حرارة الغرفة.ويلاحظ أن القارورة تحتوي على طبقتين من المذيبات وحبيبة بيضاء مرئية حتى تصل القارورة إلى حوالي 45 درجة. قم بإزالة ما يقرب من 700 ميكرولتر من المذيب من الطبقة العليا بمعدل موحد باستخدام طرف ماصة صغير كبير بالملليلتر واحد في البداية وبعد ذلك بطرف ماصة 200 ميكرولتر حتى يشكل خرزة في القارورة. أضف 400 ميكرولتر من الميثانول الطازج إلى قارورة العينة دون إزعاج الكريات عن طريق توزيع المذيب على جانب القارورة.قم بتغطية القارورة ودمج طبقات المذيبات عن طريق هز القارورة بلطف لتدوير المذيبات معا. لمراقبة بيليه البروتين الأبيض مع ملاحظة اتجاه القارورة في جهاز الطرد المركزي الدوار لمدة لا تقل عن 10 دقائق عند 10،000 مرة غرام أو أعلى في درجة حرارة الغرفة. زاوية القارورة مع بيليه متجهة لأسفل.ضع طرف ماصة على طول الحافة العلوية للقارورة وقم بإزالة السوبرناتانت بطرف ماصة صغير واحد ملليلتر بمعدل بطيء ولكن موحد. الاحتفاظ بحوالي 20 ميكرولتر من المذيبات. اترك المذيب المتبقي ليجف في غطاء الدخان.لتعجيل البروتين. باستخدام خرطوشة ترشيح يمكن التخلص منها، قم بتوصيل القابس بخرطوشة الترشيح العلوية. الجمع بين 90 ميكرولتر من محلول البروتين 10 ميكرولتر من أكواس الخلد واحد ، كلوريد الصوديوم و 400 ميكرولتر من الأسيتون.احتضان لمدة لا تقل عن دقيقتين على سطح المقعد ، والطرد المركزي لعينة البروتين المحضرة مع القابس لا يزال متصلا بخرطوشة الترشيح لمدة دقيقتين في 2،500 مرة G.At درجة حرارة الغرفة ، وعكس الخرطوشة وفك وإزالة القابس من قاعدة خرطوشة. ضع خرطوشة الترشيح في جهاز طرد مركزي نظيف لعينة البروتين لمدة ثلاث دقائق عند 500 مرة G في درجة حرارة الغرفة. تخلص من التدفق من خلال المذيب من القارورة السفلية.اغسل حبيبات البروتين بإضافة 400 ميكرولتر من الأسيتون إلى خرطوشة الترشيح ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند 500 مرة من G في درجة حرارة الغرفة أو حتى لا يبقى أي مذيب في الخرطوشة العلوية. اتباع بروتوكولات هطول الأمطار البروتين التي سبق إثباتها. إعادة إذابة البروتين عن طريق ترطيب الغشاء في قاعدة خرطوشة الترشيح عن طريق توزيع اثنين إلى خمسة ميكرولترات من بروبانول ISO مباشرة إلى الغشاء مباشرة قبل الشروع في بروتوكول إعادة الذوبان لإعادة إذابة حبيبات البروتين إعداد 80٪ من الحجم حسب الحجم من حمض الفورميك في الماء.قبل تبريد هذا المحلول الحمضي عند 20 درجة مئوية تحت الصفر وخرطوشة الترشيح التي تحتوي على البروتين المترسب. قم بتوزيع 50 ميكرولتر من حمض الفورميك المخفف البارد في غطاء الخرطوشة المبرد والدوامة لمدة 30 ثانية. أعد خرطوشة الترشيح إلى الفريزر عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 10 دقائق.كرر خطوات الدوامة والحضانة السابقة. أضف 450 ميكرولتر من الماء إلى الحجم النهائي البالغ 500 ميكرولتر. تخفيف حمض الفورميك إلى 8٪ عكس خرطوشة فك وإزالة القابس من قاعدة خرطوشة وتوصيل خرطوشة SPE إلى قارورة.قم بتدوير البروتين من خلال خرطوشة SPE في جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق عند 800 مرة G.إذا بقي المذيب في الخرطوشة العلوية ، فقم بإعادة الخرطوشة إلى جهاز الطرد المركزي وكرر الدوران. شطف عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من 5٪ الأسيتونيتريل مع 0.1٪ من TFA في الماء إلى خرطوشة SPE ، والتدفق من خلال خرطوشة SPE لمدة دقيقتين في 2000 مرة G.بالنسبة للبروتينات منخفضة الوزن الجزيئي أو الببتيدات المهضومة ، قم بإخراج العينة عن طريق تدفق 300 ميكرولتر. A 50٪ acetonitrile مع 0.1٪ من TFA لمدة خمس دقائق في 2 ، 500 مرة G.For البروتينات السليمة.تابع بخطوة مراوغة إضافية باستخدام 300 ميكرولتر من 75٪ أسيتونيتريل مع 0.1٪ حمض الزهد Trifluoro. الجمع بين اثنين من المستخلصات الناتجة. يقارن الشكل استنفاد SDS بعد القارورة القائمة على البروتينات أو هطول الأمطار في خرطوشة مرشح يمكن التخلص منها.استخدام الأسيتون مع بروتوكولات السرعة التقليدية وبروتوكولات CMW. تقلل جميع الأساليب من SDS للسماح بالتحليل الأمثل لقياس الطيف الكتلي. يوضح هذا الشكل الاسترداد الكمي للبروتين من خلال اتباع هطول الأمطار السريع للأسيتون وهطول الأمطار CMW من خلال تحليل صفحة SDS لتحليل إجمالي خلية الخميرة المعالجة.تم الحصول على استرداد متسق مع جميع بروتوكولات هطول الأمطار. يلغي هطول الأمطار في خرطوشة الترشيح التي يمكن التخلص منها الحاجة إلى ماصة SDS التي تحتوي على supernatant بعناية مع الاحتفاظ بالبروتينات المجمعة فوق مرشح الغشاء. وبالتالي لم يتم الكشف عن أي نطاقات مرئية في الكسور الفائقة عبر ثلاث نسخ متماثلة مستقلة.يوضح هطول البروتين القائم على الخرطوشة الاسترداد المتفوق لعينة مهضومة من البيبسين من بلازما البقر بالنسبة لهطول الأمطار القائم على القارورة. ولوحظت اختلافات أكثر أهمية في الإنتاجية في الخرطوشة عند استخدام كلوريد الصوديوم أثناء استخدام مذيب الزنك مما أدى إلى أعلى عائد. يحدد هذا الرقم كثافة ذروة الببتيد من كل عينة ببتيد بنسبة أعلى من واحدة تعكس وفرة أعلى من الببتيد للعينات التي تتم معالجتها في خراطيش المرشح التي يمكن التخلص منها.يقارن الشكل عدد الببتيدات المحددة لكل بروتين عبر مستحضرات العينات الثلاثة المكررة. وتبين معاملات الارتباط من 0.94 إلى 0.95 في هذه الرسوم البيانية الاتساق العالي لنهج إعداد العينات لتحليل مطياف الكتلة من القاعدة إلى القمة. لذلك بمجرد تشكيل هذه الكريات ، فأنت تريد حقا تجنب إزعاجها.إذا احتفظت بها كحبيبات سليمة ، فستحصل على عائد أعلى. لذا تأكد من عدم نسيان غسل تلك الكريات بالأسيتون الإضافي. هذا هو التأكد من أننا نتخلص من SDS مع الحفاظ على نظافة عينتنا قدر الإمكان وهذا يعطينا أفضل تحليل لقياس الطيف الكتلي.لذلك وجدنا أن إزالة المذيب الزائد عن طريق عكس العينة أبسط بكثير من محاولة ماصة العينة. ستحصل على عوائد أكثر اتساقا بهذه الطريقة. أدى أداء هطول الأسيتون في درجة حرارة الغرفة إلى استرداد أكثر اتساقا وأسرع من هطول الأمطار التقليدي في الثلاجة.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Complexometric Titration, Precipitation Titration, and Gravimetry

SCIENTISTS IN ACTION

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

تحليل ديناميات البروتين عن طريق صرف الهيدروجين الطيف الكتلي

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

تحليل المركبات المتطايرة الحساسة والأكسدة عن طريق نظام الباردة مدخل والكترون تأثير الطيف الكتلي

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

تصور المحيطة الطيف الكتلي مع استخدام انعراجي التصوير الفوتوغرافي

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

مقايسة HS-الآلية للتحديد الكمي لبروتينات الخلية المضيفة في صيدلية البروتين اللوني السائل أيون التنقل قطوف الطيف الكتلي

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Fizzy Extraction of Volatile Organic Compounds Combined with Atmospheric Pressure Chemical Ionization Quadrupole Mass Spectrometry

فيزي استخراج المركبات العضوية المتطايرة جنبا إلى جنب مع الضغط الجوي التأين الكيميائي الأقطاب الكتلة الطيف الكتلي

Chemical analysis of volatile and semivolatile compounds dissolved in liquid samples can be challenging. The dissolved components need to be brought to ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

تحليل التنفس في الوقت الحقيقي باستخدام التأين نانوليكتروسبراي الثانوية بالإضافة إلى دقة عالية الطيف الكتلي

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

توليف وتحليل الطيف الكتلي اليغو-بيبتويدس

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

تحليل البروتين أبنية ومجمعات البروتين-يجند بالتكامل الهيكلي الكتلي

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining as a Tool to Uncover Novel Natural Products

استخراج الجينوم الموجه بالطيف الكتلي كأداة للكشف عن المنتجات الطبيعية الجديدة

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

نهج قياس الطيف الكتلي للكهربائية الشعرية لتوصيف البروتين والايض كورونا المكتسبة من المواد النانوية

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...