Name: organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00
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这项工作由加拿大自然科学和工程研究委员会资助。作者感谢生物信息学解决方案公司（加拿大滑铁卢）和病童医院（加拿大多伦多）的SPARC BioCentre（分子分析）对获取MS数据的贡献。

1. 材料考虑和样品预制备
<ol><li>仅使用高纯度溶剂（丙酮，氯仿，甲醇）（>99.5%）和化学品，不含过量水分。</li>
	<li>在水中制备氯化钠和硫酸锌溶液（1M）。 注意：盐溶液可以在室温下无限期储存，只要它们没有污染物或微生物生长。</li>
	<li>使用最小的聚丙烯（PP）微量离心机小瓶，足以保留所需体积的样品和溶剂以诱导沉淀。</li>
	<li>确保待沉淀样品中的SDS浓度不大于2%（w / v...

当残余SDS耗尽到10 ppm以下时，可实现最佳的MS表征。虽然FASP和磁珠消化等替代方法提供定量SDS耗尽，回收率为31，32，33，但沉淀的主要目标是同时最大化纯度和产量。这取决于在不干扰蛋白质沉淀的情况下有效分离上清液（含有SDS）。使用基于小瓶的沉淀，一旦通过移液去除了大部分上清液，一些聚集的沉淀物就越来越有可能...

由于现代MS仪器的灵敏度，分辨率，扫描速度和多功能性的增强，质谱法的蛋白质组分析变得越来越严格。MS的进步有助于提高蛋白质鉴定效率和更精确的定量1，2，3，4，5。通过改进的MS仪器，研究人员需要一种相应一致的前端样品制备策略，能够在工作流程的所有阶段在最短的时间内定量回收高纯度蛋白质6，7，8，9，10，11.为了准确反映生物系统的蛋白质组状态，必须以高效和无偏倚的方式从天然样品基质中分离蛋白质。为此，包括变性表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），确保蛋白质12的高效提取和增溶。然而，SDS强烈干扰电喷雾电离，如果不能适当地消除13，则引起严重的MS信号抑制。
各种SDS耗尽策略可用于随后的蛋白质组分析，例如保留高于一次性旋转柱14，15，16中包含的分子量截止过滤器的蛋白质。过滤辅助样品制备方法（FASP）受到青睐，因为它有效地将SDS消耗在10 ppm以下，从而促进最佳MS。然而，FASP的蛋白质回收率是可变的，这促使了对其他技术的探索。选择性捕获蛋白质（或表面活性剂）的色谱方法已经演变成各种方便的墨盒或基于磁珠的格式17，18，19，20，21。鉴于这些简单且（理想情况下）一致的蛋白质纯化策略，使用有机溶剂进行蛋白质沉淀的经典方法经常被忽视为一种有前途的蛋白质分离方法。虽然溶剂沉淀被证明可以成功地将SDS消耗到临界水平以下，但蛋白质回收一直是这种方法的长期关注点。多个研究小组观察到蛋白质回收偏倚，沉淀率与蛋白质浓度、分子量和疏水性22，23的函数关系低得令人无法接受。由于文献中报道的降水方案的多样性，开发了标准化的降水条件。2013年，Crowell等人首次报道了离子强度对80%丙酮24中蛋白质沉淀效率的依赖性。对于检查的所有蛋白质，添加高达30 mM的氯化钠对于最大化产量（高达100%回收率）至关重要。最近，Nickerson等人表明，在丙酮沉淀期间，更高的离子强度（高达100mM）与高温（20°C）的组合在2-5 min25内给出了近乎定量的回收。观察到低分子量（LMW）蛋白的回收率略有下降。因此，Baghalabadi等人的后续报告证明，通过将特定盐，特别是硫酸锌与更高水平的有机溶剂（97%丙酮）26结合，可以成功回收LMW蛋白和肽（≤5 kDa）26。
虽然改进沉淀方案为基于MS的蛋白质组学提供了更可靠的蛋白质纯化策略，但常规沉淀的成功在很大程度上取决于用户技术。这项工作的主要目标是提出一种强大的沉淀策略，有助于从污染的上清液中分离蛋白质沉淀。开发了一种一次性过滤滤芯，通过在多孔PTFE膜过滤器27上方分离聚集的蛋白质来消除移液。上清液中的MS干扰组分在短时间的低速离心步骤中被有效去除。一次性滤芯还提供可互换的 SPE 滤芯，便于在质谱分析之前进行再溶解和可选蛋白质消解后的后续样品清理。
这里介绍了一系列推荐的蛋白质组沉淀工作流程，包括常规（基于小瓶）和半自动格式的常规（基于小瓶）的改性丙酮和氯仿/甲醇/水28 方案，以及一次性双态过滤和提取滤芯中的半自动形式。突出显示了所得的蛋白质回收率和SDS消耗效率，以及自下而上的LC-MS / MS蛋白质组覆盖率，以证明每个方案的预期结果。讨论了与每种方法相关的实际优点和缺点。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >AC177170010</td>
			<td >&#8804;0.002 % aldehyde</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetonitrile</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A998-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ammonium Bicarbonate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>A6141-1KG</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta mercaptoethanol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bromophenol blue</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td >Bromophenol blue sodium salt</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >C298-400</td>
			<td >Chloroform</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formic Acid</td>
			<td >Honeywell</td>
			<td >56302</td>
			<td >Eluent additive for LC-MS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of standard protein mixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycerol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >356352-1L-M</td>
			<td >For molecular biology, &#62; 99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A4641</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A452SK-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >75-400-102</td>
			<td >up to 21,000 xg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >05-408-130</td>
			<td >tapered bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (2 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >02-681-321</td>
			<td >rounded bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (0.1-10 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >21-197-28</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (1-200 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-302</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (200-1000 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-303</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >13-710-903</td>
			<td >Micropipet Trio pack</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pepsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>P0525000</td>
			<td >Lyophilized powder,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#62;3200 units/ mg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProTrap XG</td>
			<td >Proteoform Scientific</td>
			<td >PXG-0002</td>
			<td >50 complete units per box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >S9888-1KG</td>
			<td >ACS reagent, &#62;99 %</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >28312</td>
			<td >powdered solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >timsTOF Pro Mass Spectrometer</td>
			<td >Bruker</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of liver proteome extract</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trifluoroacetic Acid</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >L06374.AP</td>
			<td >99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP152-500</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >9002-07-7</td>
			<td >From bovine pancreas, TPCK-treated</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Urea</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1610731</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water (deionized)</td>
			<td>Sartorius Arium Mini Water Purification System</td>
			<td>76307-662</td>
			<td >Type 1 ultrapure (18.2 M&#937; cm)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zinc Sulfate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>307491-100G</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry

虽然质谱（MS）仪器的多项进步改进了蛋白质组的定性和定量分析，但在MS之前分离，富集和处理蛋白质的更可靠的前端方法对于成功的蛋白质组表征至关重要。低且不一致的蛋白质回收率和残留杂质（如表面活性剂）对MS分析有害。与其他样品制备策略相比，蛋白质沉淀通常被认为是不可靠，耗时且技术上具有挑战性的。通过采用最佳的蛋白质沉淀方案可以克服这些问题。对于丙酮沉淀，特定盐的组合、温度控制、溶剂组成和沉淀时间至关重要，而氯仿/甲醇/水沉淀的效率取决于适当的移液和样品瓶操作。或者，这些沉淀方案在一次性旋转墨盒中简化和半自动化。本研究阐述了以传统形式使用一次性两级过滤和提取滤芯的溶剂型蛋白质沉淀的预期结果。这包括通过自下而上的LC-MS / MS分析对蛋白质组学混合物进行详细表征。基于SDS的工作流程相对于未受污染的蛋白质也表现出卓越的性能。

图4 总结了使用丙酮在一次性滤芯中基于小瓶或盒式促进的蛋白质沉淀后预期的SDS耗尽。将常规的丙酮过夜孵育（-20°C）与室温下的快速丙酮沉淀方案（步骤2）以及CMW沉淀（步骤4）进行比较。残余SDS通过亚甲基蓝活性物质（MBAS）测定29进行定量。简而言之，将100μL样品与100μLMBAS试剂（250mg亚甲基蓝，50g硫酸钠，10mL硫酸，在水中稀释至1.0L）混合，然后加入4...

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Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

本方案描述了在受控条件下的溶剂型蛋白质沉淀，以便在质谱分析之前稳定快速地回收和纯化蛋白质组样品。

有机溶剂基蛋白质沉淀，在质谱分析之前实现强大的蛋白质组纯化

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

这些方案旨在通过溶剂型沉淀最大限度地提高蛋白质的回收率和纯度。我们将向您展示一些在小瓶中进行沉淀的技巧，以及离心柱形式的半自动方法。我们还优化了降水方案，使其一致且快速。整个协议只需几分钟。这些方案表明，蛋白质的溶剂沉淀是质谱之前样品制备的理想选择。这些协议将无缝融入自下而上以及自上而下的专业工作流程。今天将为我们展示的是Ziheng Dang和新斯科舍省哈利法克斯Proteoform Scientific的高级科学家Victoria Miller，将90微升无颗粒蛋白质溶液移液到聚丙烯微量离心管中。然后在样品溶液中加入10微升一摩尔氯化钠水溶液和400微升丙酮，盖上盖子并轻轻敲击小瓶以混合溶剂。让小瓶孵育它。室温不受干扰孵育后至少两分钟，离心样品注意小瓶的方向，并在室温下以10， 000 RCF或更高的速度旋转至少两分钟。离心后，在管底部观察到可见的白色沉淀。此时，打开管子的盖子，并通过倒置管子将上层物倒入废物容器中。使用纸巾从小瓶中抽出任何残留溶剂。对于包含样品的 SDS。小心地分配400微升新鲜丙酮，不要干扰颗粒。通过将小瓶以与初始旋转相同的方向放入转子中，立即在室温下以 10， 000 倍 G 或更高的温度将样品中心化一分钟。如前所述计算洗涤溶剂。打开盖子干燥样品约一分钟。在通风橱中，在颗粒溶解之前。将100微升蛋白质溶液分配到聚丙烯小瓶中。在通风橱中，加入400微升甲醇，然后加入100微升氯仿。盖上小瓶盖并短暂涡旋以混合。快速将300微升水直接分配到小瓶的中心。盖上小瓶，让它在工作台上不受干扰地放置一分钟，然后将聚丙烯小瓶放入离心机中，并在室温下以 10， 000 倍 G 或更高的速度旋转五分钟。观察到小瓶具有两个溶剂层和一个可见的白色颗粒，直到小瓶处于大约45度。首先使用大的1毫升微量移液器吸头以均匀的速率从上层除去约700微升溶剂，然后使用200微升移液器吸头，直到它在小瓶中形成珠子。通过将溶剂分配到样品瓶侧面，在不干扰沉淀的情况下向样品瓶中加入 400 微升新鲜甲醇。盖上小瓶的盖子，并通过轻轻摇动小瓶将溶剂旋转在一起来合并溶剂层。观察白色蛋白质沉淀，注意小瓶在转子离心机中的方向，在室温下以10， 000倍G或更高。使小瓶倾斜，使颗粒朝下。将移液器吸头沿小瓶的上边缘放置，并用一毫升微量移液器吸头以缓慢但均匀的速率除去上清液。保留约20微升溶剂。让残留溶剂在通风橱中干燥。沉淀蛋白质。使用一次性滤芯将塞子连接到上部滤芯。混合90微升蛋白质溶液10微升一摩尔水，氯化钠和400微升丙酮。在工作台上孵育至少两分钟，将制备好的蛋白质样品，塞子仍然连接到过滤柱上，在室温 G.At 2， 500 倍下离心两分钟，倒置滤芯并从滤芯底座上拧下并取下塞子。将过滤柱放入干净的小瓶中，在室温下以500倍G离心蛋白质样品三分钟。丢弃来自下小瓶的溶剂。通过向过滤柱中加入400微升丙酮来洗涤蛋白质沉淀，在室温下以500倍G离心三分钟，或直到上部滤芯中没有溶剂残留。遵循先前演示的蛋白质沉淀方案。通过在过滤滤芯底部润湿膜来重新溶解蛋白质，方法是将 2 到 5 微升的 ISO 丙醇直接分配到膜上，然后立即进行再溶解方案以重新溶解蛋白质沉淀制备 80% 体积的甲酸在水中的溶液。在零下20摄氏度下预冷该酸溶液，并在含有沉淀蛋白质的过滤滤芯中预冷。将 50 微升冷稀释甲酸分配到冷却的墨盒盖中并涡旋 30 秒。将滤芯在零下 20 摄氏度下放回冰箱 10 分钟。重复前面的涡旋和孵育步骤。加入450微升水，最终体积为500微升。将甲酸稀释至8%倒置卡式瓶，拧下并从卡式瓶底座上取下塞子，然后将SPE卡式瓶连接到小瓶上。在室温下以800倍G离心通过SPE滤芯旋转蛋白质5分钟.如果溶剂残留在上部滤芯中，则将滤芯返回离心机并重复离心。通过向SPE柱中加入300微升5%乙腈和0.1%TFA水溶液冲洗，以2000倍G流过SPE柱两分钟.对于低分子量蛋白质或消化肽，通过流动300微升洗脱样品。50%乙腈与0.1%的TFA在2， 500倍G下持续5分钟。使用300微升75%乙腈和0.1%三氟苦行酸进行额外的躲避步骤。合并两个生成的提取物。该图比较了一次性滤芯中基于小瓶或沉淀蛋白质后的SDS耗竭。使用丙酮与传统的快速和CMW方案。所有方法都可以降低SDS，以实现最佳的质谱分析。该图显示了通过对加工酵母全细胞裂解物进行SDS页面分析的快速丙酮沉淀和CMW沉淀的定量蛋白质回收率。所有沉淀方案均获得一致的回收率。在一次性滤芯中进行沉淀，无需小心移液含有上清液的SDS，同时将聚集的蛋白质保留在膜过滤器上方。因此，在三个独立重复的上清液级分中没有检测到可见条带。与基于小瓶的沉淀相比，基于柱的蛋白质沉淀显示出胃蛋白酶消化的牛血浆样品的回收率更高。当使用氯化钠时，在滤芯中观察到更显着的产量差异，而使用锌溶剂导致最高产量。该图量化了每个肽样品的肽峰强度，其比率高于1，反映了在一次性滤芯中处理的样品的肽丰度更高。该图比较了三种重复样品制备中每种蛋白质的鉴定肽数。这些图表中的相关系数为0.94至0.95，证明了自下而上质谱分析的样品制备方法的高度一致性。因此，一旦颗粒形成，您真的要避免干扰它。如果您将其保留为完整的颗粒，您将获得更高的产量。因此，请确保不要忘记用额外的丙酮清洗该颗粒。这确保了我们摆脱了SDS，使我们的样品尽可能干净，这为我们提供了最佳的质谱分析。因此，我们发现通过倒置来去除多余的溶剂比尝试移液样品要简单得多。通过这种方式，您将获得更稳定的产量。在室温下进行丙酮沉淀比在冰箱中进行传统沉淀更一致、更快速的回收。

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