Name: organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. De auteurs bedanken Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) en SPARC BioCentre (Molecular Analysis) van het Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) voor hun bijdragen aan de verwerving van MS-gegevens.

1. Materiaaloverwegingen en monstervoorbereiding
<ol><li>Gebruik alleen oplosmiddelen met een hoge zuiverheidsgraad (aceton, chloroform, methanol) (>99,5%) en chemicaliën, vrij van overtollig vocht.</li>
	<li>Bereid natriumchloride- en zinksulfaatoplossingen (1 M) in water. OPMERKING: Zoutoplossingen kunnen voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden bewaard, zolang ze vrij zijn van verontreiniging of microbiële groei.</li>
	<li>Gebruik de kleinste polypropyleen (PP) microcentrifugeflacon die...

Optimale MS-karakterisering wordt bereikt wanneer het resterende SDS onder 10 ppm wordt uitgeput. Terwijl alternatieve benaderingen, zoals FASP en on-bead digestion, kwantitatieve SDS-uitputting bieden met variabel herstel 31,32,33, is het primaire doel van neerslag om de zuiverheid en opbrengst tegelijkertijd te maximaliseren. Dit hangt af van het effectief isoleren van het supernatant (dat de SDS bevat) zonder de eiwitkorrel t...

Proteoomanalyse door massaspectrometrie is steeds rigoureuzer geworden, vanwege de verbeterde gevoeligheid, resolutie, scansnelheid en veelzijdigheid van moderne MS-instrumenten. Ms-vooruitgang draagt bij aan een grotere efficiëntie van eiwitidentificatie en nauwkeuriger kwantificering 1,2,3,4,5. Met verbeterde MS-instrumentatie eisen onderzoekers een overeenkomstig consistente front-end monstervoorbereidingsstrategie die in staat is tot kwantitatief herstel van zeer zuivere eiwitten in minimale tijd in alle stadia van de workflow 6,7,8,9,10,11 . Om de proteoomstatus van een biologisch systeem nauwkeurig weer te geven, moeten eiwitten op een efficiënte en onbevooroordeelde manier uit de inheemse monstermatrix worden geïsoleerd. Hiertoe zorgt het opnemen van een denaturerende oppervlakteactieve stof, zoals natriumdodecylsulfaat (SDS), voor efficiënte eiwitextractie en oplosbaarheid12. SDS interfereert echter sterk met elektrospray-ionisatie, waardoor ernstige MS-signaalonderdrukking ontstaat als het niet goed wordt geëlimineerd13.
Verschillende SDS-depletiestrategieën zijn beschikbaar voor daaropvolgende proteoomanalyse, zoals het vasthouden van eiwitten boven een moleculair gewichtsafsnijdingsfilter in wegwerpspinpatronen 14,15,16. De filterondersteunde monstervoorbereidingsmethode (FASP) heeft de voorkeur omdat het sds effectief onder 10 ppm uitput, waardoor optimale MS mogelijk wordt. Eiwitherstel met FASP is echter variabel, wat leidde tot de verkenning van andere technieken. Chromatografische benaderingen die selectief eiwitten (of oppervlakteactieve stoffen) vastleggen, zijn geëvolueerd naar verschillende handige cartridges of op kralen gebaseerde formaten 17,18,19,20,21. Gezien deze eenvoudige en (idealiter) consistente strategieën voor eiwitzuivering, wordt de klassieke benadering van eiwitprecipitatie met organische oplosmiddelen vaak over het hoofd gezien als een veelbelovende benadering van eiwitisolatie. Hoewel is aangetoond dat oplosmiddelprecipitatie SDS met succes onder kritieke niveaus uitput, is eiwitterugwinning al lang een zorg van deze aanpak. Meerdere groepen hebben een eiwitherstelbias waargenomen, met onaanvaardbaar lage neerslagopbrengsten als functie van eiwitconcentratie, molecuulgewicht en hydrofobiciteit 22,23. Vanwege de diversiteit aan neerslagprotocollen die in de literatuur worden gerapporteerd, werden gestandaardiseerde neerslagcondities ontwikkeld. In 2013 rapporteerden Crowell et al. voor het eerst de afhankelijkheid van ionische sterkte van de neerslagefficiëntie van eiwitten in 80% aceton24. Voor alle onderzochte eiwitten bleek de toevoeging van maximaal 30 mM natriumchloride essentieel om de opbrengsten te maximaliseren (tot 100% herstel). Meer recent toonden Nickerson et al. aan dat de combinatie van nog hogere ionische sterkte (tot 100 mM) met verhoogde temperatuur (20 °C) tijdens acetonprecipitatie bijna kwantitatief herstel gaf in 2-5 min25. Een lichte daling in het herstel van laagmoleculaire gewicht (LMW) eiwitten werd waargenomen. Daarom toonde een daaropvolgend rapport van Baghalabadi et al. de succesvolle terugwinning van LMW-eiwitten en peptiden (≤5 kDa) aan door specifieke zouten, met name zinksulfaat, te combineren met een hoger gehalte aan organisch oplosmiddel (97% aceton)26.
Terwijl het verfijnen van het neerslagprotocol een betrouwbaardere eiwitzuiveringsstrategie biedt voor op MS gebaseerde proteomics, is het succes van conventionele neerslag sterk afhankelijk van de gebruikerstechniek. Een primair doel van dit werk is om een robuuste precipitatiestrategie te presenteren die de isolatie van de eiwitpellet van het verontreinigende supernatant vergemakkelijkt. Een wegwerpfiltratiepatroon werd ontwikkeld om pipetteren te elimineren door geaggregeerd eiwit te isoleren boven een poreusPTFE-membraanfilter 27. MS-storende componenten in het supernatant worden effectief verwijderd in een korte, lage snelheid centrifugatiestap. Het wegwerpfilterpatroon biedt ook een verwisselbare SPE-cartridge, die het mogelijk maakt om monsters op te ruimen na resolubilisatie en optionele eiwitvertering, vóór massaspectrometrie.
Een reeks aanbevolen proteoomprecipitatieworkflows worden hier gepresenteerd, waaronder gemodificeerde aceton- en chloroform / methanol / water28-protocollen , in een conventioneel (op basis van flacons) en een semi-geautomatiseerd formaat in een wegwerp tweetoestandsfiltratie- en extractiepatroon. De resulterende eiwitterugwinningen en SDS-depletie-efficiënties worden benadrukt, samen met bottom-up LC-MS / MS-proteoomdekking, om de verwachte uitkomst van elk protocol aan te tonen. De praktische voor- en nadelen van elke aanpak worden besproken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >AC177170010</td>
			<td >&#8804;0.002 % aldehyde</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetonitrile</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A998-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ammonium Bicarbonate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>A6141-1KG</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta mercaptoethanol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bromophenol blue</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td >Bromophenol blue sodium salt</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >C298-400</td>
			<td >Chloroform</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formic Acid</td>
			<td >Honeywell</td>
			<td >56302</td>
			<td >Eluent additive for LC-MS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of standard protein mixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycerol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >356352-1L-M</td>
			<td >For molecular biology, &#62; 99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A4641</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A452SK-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >75-400-102</td>
			<td >up to 21,000 xg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >05-408-130</td>
			<td >tapered bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (2 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >02-681-321</td>
			<td >rounded bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (0.1-10 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >21-197-28</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (1-200 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-302</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (200-1000 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-303</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >13-710-903</td>
			<td >Micropipet Trio pack</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pepsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>P0525000</td>
			<td >Lyophilized powder,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#62;3200 units/ mg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProTrap XG</td>
			<td >Proteoform Scientific</td>
			<td >PXG-0002</td>
			<td >50 complete units per box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >S9888-1KG</td>
			<td >ACS reagent, &#62;99 %</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >28312</td>
			<td >powdered solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >timsTOF Pro Mass Spectrometer</td>
			<td >Bruker</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of liver proteome extract</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trifluoroacetic Acid</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >L06374.AP</td>
			<td >99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP152-500</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >9002-07-7</td>
			<td >From bovine pancreas, TPCK-treated</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Urea</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1610731</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water (deionized)</td>
			<td>Sartorius Arium Mini Water Purification System</td>
			<td>76307-662</td>
			<td >Type 1 ultrapure (18.2 M&#937; cm)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zinc Sulfate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>307491-100G</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry

Hoewel meerdere ontwikkelingen in massaspectrometrie (MS) -instrumenten de kwalitatieve en kwantitatieve proteoomanalyse hebben verbeterd, zijn betrouwbaardere front-endbenaderingen om eiwitten te isoleren, verrijken en verwerken vóór MS van cruciaal belang voor succesvolle proteoomkarakterisering. Lage, inconsistente eiwitterugwinning en resterende onzuiverheden zoals oppervlakteactieve stoffen zijn schadelijk voor MS-analyse. Eiwitprecipitatie wordt vaak als onbetrouwbaar, tijdrovend en technisch uitdagend beschouwd om uit te voeren in vergelijking met andere monstervoorbereidingsstrategieën. Deze zorgen worden overwonnen door gebruik te maken van optimale eiwitprecipitatieprotocollen. Voor acetonprecipitatie is de combinatie van specifieke zouten, temperatuurregeling, oplosmiddelsamenstelling en precipitatietijd van cruciaal belang, terwijl de efficiëntie van chloroform / methanol / waterprecipitatie afhankelijk is van de juiste pipettering en flaconmanipulatie. Als alternatief zijn deze neerslagprotocollen gestroomlijnd en semi-geautomatiseerd in een wegwerpspincartridge. De verwachte resultaten van eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen in het conventionele formaat en met behulp van een wegwerp-, tweetrapsfiltratie- en extractiepatroon worden in dit werk geïllustreerd. Dit omvat de gedetailleerde karakterisering van proteomische mengsels door bottom-up LC-MS/MS-analyse. De superieure prestaties van sds-gebaseerde workflows worden ook aangetoond ten opzichte van niet-verontreinigde eiwitten.

Figuur 4 geeft een overzicht van de verwachte SDS-uitputting na injectieflacongebaseerde of patroongefaciliteerde precipitatie van eiwitten in een wegwerpfilterpatroon met behulp van aceton. Conventionele nachtelijke incubatie (-20 °C) in aceton wordt vergeleken met het snelle acetonprecipitatieprotocol bij kamertemperatuur (stap 2), evenals CMW-neerslag (stap 4). Residueel SDS werd gekwantificeerd door de methyleenblauwactieve stoffen (MBAS) assay29. In het kort wer...

Watch this Scientific Journal Video about Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry at JoVE.com

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

Het huidige protocol beschrijft eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen onder gecontroleerde omstandigheden voor robuust en snel herstel en zuivering van proteoommonsters voorafgaand aan massaspectrometrie.

Organische eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen voor robuuste proteoomzuivering vóór massaspectrometrie

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Deze protocollen zijn ontworpen om het herstel en de zuiverheid van eiwitten te maximaliseren door middel van op oplosmiddelen gebaseerde precipitatie. We gaan je een paar trucs laten zien om neerslag in flacons uit te voeren, evenals een semi-geautomatiseerde aanpak in een spincartridgeformaat. We hebben ook het neerslagprotocol geoptimaliseerd om consistent en snel te zijn.Het hele protocol duurt slechts een paar minuten. Deze protocollen tonen aan dat oplosmiddelprecipitatie van eiwitten ideaal is voor monstervoorbereiding voorafgaand aan massaspectrometrie. De protocollen passen naadloos in zowel bottom-up als top-down pro-workflows.Ziheng Dang en Victoria Miller, Senior scientist bij Proteoform Scientific in Halifax, Nova Scotia Pipette 90 microliter deeltjesvrije eiwitoplossing in een polypropyleen microcentrifugebuis, demonstreren voor ons vandaag. Voeg vervolgens 10 microliter van één mol waterig natriumchloride en 400 microliter aceton toe aan de monsteroplossing, dop en tik zachtjes op de injectieflacon om de oplosmiddelen te combineren. Laat de injectieflacon het uitbroeden.Kamertemperatuur ongestoord gedurende minimaal twee minuten na incubatie, centrifugeer de monsters met inachtneming van de oriëntatie van de injectieflacon en draai gedurende minimaal twee minuten bij 10.000 RCF of hoger bij kamertemperatuur. Na de centrifugatie wordt een zichtbare witte pellet waargenomen aan de onderkant van de buis. Maak op dit punt de buis los en decanteer het superaat in een afvalcontainer door de buis om te keren.Gebruik een papieren handdoek om eventuele resterende oplosmiddelen uit de injectieflacon te halen. Voor SDS met monsters. Doseer voorzichtig 400 microliter verse aceton zonder de pellet te verstoren.Centreer het monster onmiddellijk gedurende één minuut op 10.000 maal G of hoger bij kamertemperatuur door de injectieflacon in dezelfde richting als de eerste spin in de rotor te plaatsen. Tel het wasmiddel zoals eerder beschreven. Droog het monster met de dop open gedurende ongeveer één minuut.In een zuurkast, voor een pelletoplosbaarheid. Doseer 100 microliter van de eiwitoplossing in een polypropyleen injectieflacon. Voeg in de zuurkast een 400 microliter methanol toe, gevolgd door 100 microliter chloroform.Sluit de injectieflacon en vortex kort af om te mengen. Doseer snel 300 microliter water rechtstreeks in het midden van de injectieflacon. Sluit de injectieflacon af en laat deze een minuut ongestoord op het bankblad zitten, nadat u de polypropyleenflacon in een centrifuge hebt geplaatst en deze gedurende vijf minuten op 10.000 maal G of hoger bij kamertemperatuur hebt laten draaien.De injectieflacon heeft twee oplosmiddellagen en een zichtbare witte pellet tot de injectieflacon op ongeveer 45 graden. Verwijder ongeveer 700 microliter van het oplosmiddel uit de bovenste laag met een uniforme snelheid met behulp van een grote micropipetpunt van één milliliter in eerste instantie en later met een pipetpunt van 200 microliter totdat deze een kraal vormt in de injectieflacon. Voeg 400 microliter verse methanol toe aan de monsterflacon zonder de pellet te verstoren door het oplosmiddel langs de zijkant van de injectieflacon af te geven.Sluit de injectieflacon af en combineer de oplosmiddellagen door de injectieflacon voorzichtig te wiegen om de oplosmiddelen samen te draaien. Om de witte eiwitkorrel te observeren die de oriëntatie van de injectieflacon in de rotorcentrifuge noteert gedurende minimaal 10 minuten bij 10.000 keer G of hoger bij kamertemperatuur. Zet de injectieflacon schuin met de pellet naar beneden gericht.Plaats een pipetpunt langs de bovenrand van de injectieflacon en verwijder het supernatant met een micropipetpunt van één milliliter in een langzame maar uniforme snelheid. Met behoud van ongeveer 20 microliter oplosmiddel. Laat het resterende oplosmiddel drogen in de zuurkast.Om het eiwit neer te slaan. Bevestig met behulp van een wegwerpfiltratiepatroon de stekker aan de bovenste filtratiecartridge. Combineer 90 microliter eiwitoplossing 10 microliter van één mol aquas, natriumchloride en 400 microliter aceton.Incubeer gedurende minimaal twee minuten op de bovenkant van de bank, centrifugeer het bereide eiwitmonster met de plug nog steeds bevestigd aan de filtratiecartridge gedurende twee minuten bij 2.500 keer G.At kamertemperatuur, keer de patroon om en schroef los en verwijder de plug van de cartridgebasis. Plaats de filtratiepatroon in een schone injectieflaconcentrifugeer het eiwitmonster gedurende drie minuten bij 500 maal G bij kamertemperatuur. Gooi de stroom door oplosmiddel uit de onderste injectieflacon weg.Was de eiwitpellet door 400 microliter aceton aan de filtratiepatroon toe te voegen, centrifugeer gedurende drie minuten op 500 maal G bij kamertemperatuur of totdat er geen oplosmiddel in de bovenste patroon achterblijft. Volgens de eerder gedemonstreerde eiwitprecipitatieprotocollen. Relubiliteer het eiwit door het membraan aan de basis van de filtratiecartridge te bevochtigen door twee tot vijf microliter ISO-propanol rechtstreeks aan het membraan te geven onmiddellijk voordat u overgaat tot het oplosbaarheidsprotocol voor oplosbaarheid van de eiwitpellet bereid 80 volume-volume oplossing van mierenzuur in water.Koel deze zure oplossing af op min 20 graden Celsius en de filtratiepatroon met neergeslagen eiwit. Doseer 50 microliter koud verdund mierenzuur in de gekoelde cartridgedop en vortex gedurende 30 seconden. Breng de filtratiepatroon gedurende 10 minuten terug naar de vriezer bij min 20 graden Celsius.Herhaal de vorige vortex- en incubatiestappen. Voeg 450 microliter water toe aan een eindvolume van 500 microliter. Verdun het mierenzuur tot 8%Draai de patroon om, schroef de patroon los en verwijder de stekker uit de cartridgebasis en bevestig de SPE-cartridge aan de injectieflacon.Draai het eiwit door de SPE-patroon in een centrifuge bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten bij 800 maal G.Als het oplosmiddel in de bovenste patroon blijft, breng dan de patroon terug naar de centrifuge en herhaal de spin. Spoel door 300 microliter 5% acetonitril met 0,1% TFA in water aan de SPE-patroon toe te voegen, stroom gedurende twee minuten door de SPE-cartridge bij 2000 keer G.Voor eiwitten met een laag molecuulgewicht of verteerde peptiden elueert u het monster door 300 microliter te laten stromen. Een 50%acetonitril met 0,1% TFA gedurende vijf minuten bij 2.500 keer G.Voor intacte eiwitten.Volg met een extra elusiestap met behulp van 300 microliter 75% acetonitril met 0,1% trifluor ascetinezuur. Combineer de twee resulterende extracten. De figuur vergelijkt de SDS-uitputting na injectieflacon op basis van of precipitatie van eiwitten in een wegwerpfilterpatroon.Het gebruik van aceton met de conventionele rapid- en CMW-protocollen. Alle benaderingen verminderen SDS om optimale massaspectrometrie-analyse mogelijk te maken. Deze figuur toont kwantitatief eiwitherstel door snelle acetonprecipitatie en CMW-precipitatie te volgen door middel van SDS-paginaanalyse van een verwerkt gisttotaalcellysaat.Consistent herstel werd verkregen met alle neerslagprotocollen. Precipitatie in een wegwerpfiltratiepatroon elimineert de noodzaak om SDS met supernatant zorgvuldig te pipetteren met behoud van de geaggregeerde eiwitten boven een membraanfilter. Er werden dus geen zichtbare banden gedetecteerd in de supernatantfracties over drie onafhankelijke replicaties.De op cartridges gebaseerde eiwitprecipitatie toont een superieur herstel van een pepsine verteerd monster van runderplasma ten opzichte van precipitatie op basis van injectieflacons. Meer significante verschillen in opbrengst worden opgemerkt in de cartridge bij het gebruik van natriumchloride, terwijl het gebruik van zinkoplosmiddel resulteerde in de hoogste opbrengst. Dit cijfer kwantificeert de piekintensiteit van het peptide van elk peptidemonster met een verhouding boven één die een hogere peptide-abundantie weerspiegelt voor monsters die zijn verwerkt in de wegwerpfilterpatronen.De figuur vergelijkt het aantal geïdentificeerde peptiden per eiwit over de drie replicaat monsterpreparaten. De correlatiecoëfficiënten van 0,94 tot 0,95 in deze grafieken tonen de hoge consistentie aan van de monstervoorbereidingsbenadering voor bottom-up massaspectrometrieanalyse. Dus als die pellet eenmaal is gevormd, wil je echt voorkomen dat je hem stoort.Als je het als een intacte pellet bewaart, krijg je een hogere opbrengst. Vergeet dus niet om die pellet te wassen met extra aceton. Dit zorgt ervoor dat we het SDS verwijderen en ons monster zo schoon mogelijk houden en dat geeft ons de beste massaspectrometrie-analyse.Dus we ontdekten dat het verwijderen van het overtollige oplosmiddel door het om te keren een stuk eenvoudiger is dan proberen het monster te pipetteren. Je krijgt op deze manier consistentere opbrengsten. Het uitvoeren van acetonprecipitatie bij kamertemperatuur resulteerde in een consistenter en sneller herstel dan traditionele neerslag in de vriezer.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Complexometric Titration, Precipitation Titration, and Gravimetry

SCIENTISTS IN ACTION

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Het analyseren van Protein Dynamics gebruik van waterstof Exchange Massaspectrometrie

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

Analyse van vluchtige en oxidatie gevoelige verbindingen met behulp van een Cold Inlaat Systeem en Electron Impact Massaspectrometrie

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualisatie van Ambient Massaspectrometrie met het gebruik van Schlieren fotografie

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Fizzy Extraction of Volatile Organic Compounds Combined with Atmospheric Pressure Chemical Ionization Quadrupole Mass Spectrometry

Fizzy Extractie van vluchtige organische verbindingen gecombineerd met atmosferische druk Chemische ionisatie Quadrupole Mass Spectrometry

Chemical analysis of volatile and semivolatile compounds dissolved in liquid samples can be challenging. The dissolved components need to be brought to ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Real-time adem analyse met behulp van secundaire Nanoelectrospray ionisatie gekoppeld aan massaspectrometrie voor hoge resolutie

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Synthese en analyse van de Spectrometrie van de massa van Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Analyseren van platforms voor eiwit en eiwit-Ligand complexen door integratieve structurele massaspectrometrie

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining as a Tool to Uncover Novel Natural Products

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining als een instrument om nieuwe natuurlijke producten te ontdekken

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Capillaire elektroforese massaspectrometrie benaderingen voor karakterisering van het eiwit en metaboliet corona verworven door nanomaterialen

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...