Name: organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00
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Ces travaux ont été financés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada. Les auteurs remercient Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) et SPARC BioCentre (Molecular Analysis) de l’Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) pour leur contribution à l’acquisition de données sur la SP.

1. Considérations matérielles et pré-préparation de l’échantillon
<ol><li>Utilisez uniquement des solvants de haute pureté (acétone, chloroforme, méthanol) (>99,5%) et des produits chimiques, exempts d’excès d’humidité.</li>
	<li>Préparer des solutions de chlorure de sodium et de sulfate de zinc (1 M) dans l’eau. REMARQUE: Les solutions salines peuvent être stockées indéfiniment à température ambiante, à condition qu’elles soient exemptes de contaminants ou de croissance m...

La caractérisation optimale de la SEP est obtenue lorsque la FDS résiduelle est épuisée en dessous de 10 ppm. Alors que d’autres approches, telles que le FASP et la digestion sur billes, offrent un épuisement quantitatif des FDS avec une récupération variable 31,32,33, l’objectif principal des précipitations est de maximiser la pureté et le rendement simultanément. Cela dépend de l’isolation efficace du surnagea...

L’analyse du protéome par spectrométrie de masse est devenue de plus en plus rigoureuse, en raison de la sensibilité, de la résolution, de la vitesse de balayage et de la polyvalence accrues des instruments MS modernes. Les progrès de la SEP contribuent à une plus grande efficacité d’identification des protéines et à une quantification plus précise 1,2,3,4,5. Grâce à l’amélioration de l’instrumentation de la SEP, les chercheurs exigent une stratégie de préparation d’échantillons front-end cohérente capable de récupérer quantitativement des protéines de haute pureté en un minimum de temps à toutes les étapes du flux de travail 6,7,8,9,10,11 . Pour refléter avec précision l’état protéomique d’un système biologique, les protéines doivent être isolées de la matrice de l’échantillon natif de manière efficace et impartiale. À cette fin, l’inclusion d’un tensioactif dénaturant, tel que le dodécylsulfate de sodium (SDS), assure une extraction et une solubilisation efficaces des protéines12. Cependant, les FDS interfèrent fortement avec l’ionisation par électropulvérisation, provoquant une suppression sévère du signal MS si elle n’est pas correctement éliminée13.
Diverses stratégies d’épuisement des FDS sont disponibles pour une analyse ultérieure du protéome, telles que la rétention de protéines au-dessus d’un filtre de coupure de poids moléculaire contenu dans des cartouches de spin jetables 14,15,16. La méthode de préparation d’échantillons assistée par filtre (FASP) est privilégiée car elle épuise efficacement les FDS en dessous de 10 ppm, facilitant ainsi une SEP optimale. Cependant, la récupération des protéines avec LE FASP est variable, ce qui a incité à l’exploration d’autres techniques. Les approches chromatographiques qui capturent sélectivement les protéines (ou tensioactifs) ont évolué en diverses cartouches pratiques ou formats à base de billes 17,18,19,20,21. Compte tenu de ces stratégies simples et (idéalement) cohérentes de purification des protéines, l’approche classique de la précipitation des protéines avec des solvants organiques est souvent négligée comme une approche prometteuse de l’isolement des protéines. Bien qu’il soit démontré que la précipitation des solvants épuise les FDS en dessous des niveaux critiques avec succès, la récupération des protéines est une préoccupation de longue date de cette approche. Plusieurs groupes ont observé un biais de récupération des protéines, avec des rendements de précipitations inacceptablement bas en fonction de la concentration en protéines, du poids moléculaire et de l’hydrophobicité22,23. En raison de la diversité des protocoles de précipitations rapportés dans la littérature, des conditions de précipitations normalisées ont été élaborées. En 2013, Crowell et al. ont signalé pour la première fois la dépendance de la force ionique à l’efficacité des précipitations des protéines dans 80% d’acétone24. Pour toutes les protéines examinées, l’ajout de chlorure de sodium jusqu’à 30 mM s’est avéré essentiel pour maximiser les rendements (jusqu’à 100 % de récupération). Plus récemment, Nickerson et al. ont montré que la combinaison d’une force ionique encore plus élevée (jusqu’à 100 mM) avec une température élevée (20 ° C) pendant les précipitations d’acétone donnait une récupération presque quantitative en 2-5 min25. Une légère baisse de la récupération des protéines de faible poids moléculaire (LMW) a été observée. Par conséquent, un rapport ultérieur de Baghalabadi et al. a démontré la récupération réussie des protéines et des peptides LMW (≤5 kDa) en combinant des sels spécifiques, en particulier le sulfate de zinc, avec un niveau plus élevé de solvant organique (97% d’acétone)26.
Bien que l’affinement du protocole de précipitation confère une stratégie de purification des protéines plus fiable pour la protéomique basée sur la SEP, le succès des précipitations conventionnelles repose fortement sur la technique de l’utilisateur. L’un des principaux objectifs de ces travaux est de présenter une stratégie de précipitation robuste qui facilite l’isolement de la pastille de protéine du surnageant contaminant. Une cartouche de filtration jetable a été développée pour éliminer le pipetage en isolant les protéines agrégées au-dessus d’un filtre à membrane poreuse en PTFE27. Les composants interférants de la SEP dans le surnageant sont efficacement éliminés lors d’une étape de centrifugation courte et à basse vitesse. La cartouche filtrante jetable offre également une cartouche SPE interchangeable, qui facilite le nettoyage ultérieur des échantillons après laolubilisation et la digestion facultative des protéines, avant la spectrométrie de masse.
Une série de flux de travail recommandés pour la précipitation du protéome sont présentés ici, y compris les protocoles modifiés acétone et chloroforme/méthanol/eau28 , dans un format conventionnel (à base de flacons) et semi-automatisé dans une cartouche de filtration et d’extraction jetable à deux états. Les récupérations de protéines et l’efficacité de l’épuisement des FDS qui en résultent sont mises en évidence, ainsi que la couverture ascendante du protéome LC-MS/MS, afin de démontrer le résultat attendu de chaque protocole. Les avantages et les inconvénients pratiques associés à chaque approche sont discutés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >AC177170010</td>
			<td >&#8804;0.002 % aldehyde</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetonitrile</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A998-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ammonium Bicarbonate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>A6141-1KG</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta mercaptoethanol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bromophenol blue</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td >Bromophenol blue sodium salt</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >C298-400</td>
			<td >Chloroform</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formic Acid</td>
			<td >Honeywell</td>
			<td >56302</td>
			<td >Eluent additive for LC-MS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of standard protein mixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycerol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >356352-1L-M</td>
			<td >For molecular biology, &#62; 99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A4641</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A452SK-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >75-400-102</td>
			<td >up to 21,000 xg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >05-408-130</td>
			<td >tapered bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (2 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >02-681-321</td>
			<td >rounded bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (0.1-10 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >21-197-28</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (1-200 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-302</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (200-1000 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-303</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >13-710-903</td>
			<td >Micropipet Trio pack</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pepsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>P0525000</td>
			<td >Lyophilized powder,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#62;3200 units/ mg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProTrap XG</td>
			<td >Proteoform Scientific</td>
			<td >PXG-0002</td>
			<td >50 complete units per box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >S9888-1KG</td>
			<td >ACS reagent, &#62;99 %</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >28312</td>
			<td >powdered solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >timsTOF Pro Mass Spectrometer</td>
			<td >Bruker</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of liver proteome extract</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trifluoroacetic Acid</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >L06374.AP</td>
			<td >99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP152-500</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >9002-07-7</td>
			<td >From bovine pancreas, TPCK-treated</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Urea</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1610731</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water (deionized)</td>
			<td>Sartorius Arium Mini Water Purification System</td>
			<td>76307-662</td>
			<td >Type 1 ultrapure (18.2 M&#937; cm)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zinc Sulfate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>307491-100G</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry

Bien que les multiples progrès réalisés dans les instruments de spectrométrie de masse (SEP) aient amélioré l’analyse qualitative et quantitative du protéome, des approches frontales plus fiables pour isoler, enrichir et traiter les protéines avant la SEP sont essentielles à la caractérisation réussie du protéome. Une récupération faible et incohérente des protéines et des impuretés résiduelles telles que les tensioactifs nuisent à l’analyse de la SEP. La précipitation des protéines est souvent considérée comme peu fiable, longue et techniquement difficile à effectuer par rapport à d’autres stratégies de préparation d’échantillons. Ces préoccupations sont surmontées en utilisant des protocoles optimaux de précipitation des protéines. Pour la précipitation de l’acétone, la combinaison de sels spécifiques, le contrôle de la température, la composition du solvant et le temps de précipitation sont essentiels, tandis que l’efficacité de la précipitation du chloroforme / méthanol / eau dépend d’un pipetage et d’une manipulation du flacon appropriés. Alternativement, ces protocoles de précipitation sont rationalisés et semi-automatisés dans une cartouche de rotation jetable. Les résultats attendus de la précipitation des protéines à base de solvant dans le format conventionnel et de l’utilisation d’une cartouche de filtration et d’extraction jetable en deux étapes sont illustrés dans ce travail. Cela comprend la caractérisation détaillée des mélanges protéomiques par analyse ascendante LC-MS/MS. Les performances supérieures des flux de travail basés sur les FDS sont également démontrées par rapport aux protéines non contaminées.

La figure 4 résume l’épuisement prévu des FDS à la suite d’une précipitation de protéines à base de flacon ou facilitée par une cartouche dans une cartouche filtrante jetable utilisant de l’acétone. L’incubation nocturne conventionnelle (-20 °C) dans l’acétone est comparée au protocole de précipitation rapide de l’acétone à température ambiante (étape 2), ainsi qu’aux précipitations CMW (étape 4). La FDS résiduelle a été quantifiée par le dosage des subst...

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Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

Le présent protocole décrit la précipitation protéique à base de solvant dans des conditions contrôlées pour une récupération et une purification robustes et rapides des échantillons de protéome avant la spectrométrie de masse.

Précipitation de protéines à base de solvants organiques pour une purification robuste du protéome avant la spectrométrie de masse

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Ces protocoles sont conçus pour maximiser la récupération ainsi que la pureté des protéines grâce à la précipitation à base de solvants. Nous allons vous montrer quelques astuces pour effectuer la précipitation dans des flacons, ainsi qu’une approche semi-automatisée dans un format de cartouche de spin. Nous avons également optimisé le protocole de précipitations pour qu’il soit cohérent et rapide.L’ensemble du protocole ne prend que quelques minutes. Ces protocoles démontrent que la précipitation des protéines par solvant est idéale pour la préparation des échantillons avant la spectrométrie de masse. Les protocoles s’intégreront parfaitement dans les flux de travail professionnels ascendants et descendants.Ziheng Dang et Victoria Miller, scientifique principale chez Proteoform Scientific à Halifax, en Nouvelle-Écosse, feront une démonstration pour nous aujourd’hui Pipeter 90 microlitres de solution protéique sans particules dans un tube microcentrifuge en polypropylène. Ajoutez ensuite 10 microlitres de chlorure de sodium aqueux à une mole et 400 microlitres d’acétone dans la solution échantillon, bouchez et tapotez doucement le flacon pour combiner les solvants. Laissez le flacon l’incuber.Température ambiante non perturbée pendant au moins deux minutes après l’incubation, centrifuger les échantillons en notant l’orientation du flacon et faire tourner pendant au moins deux minutes à 10 000 FCR ou plus à température ambiante. Après la centrifugation, une pastille blanche visible est observée au fond du tube. À ce stade, décapsulez le tube et décantez le surnate dans un conteneur à déchets en retournant le tube.Utilisez une serviette en papier pour aspirer tout solvant résiduel du flacon. Pour les FDS contenant des échantillons. Distribuez soigneusement 400 microlitres d’acétone fraîche sans déranger la pastille.Utiliser immédiatement l’échantillon pendant une minute à 10 000 fois G ou plus à température ambiante en plaçant le flacon dans le rotor dans la même orientation que la rotation initiale. Décompter le solvant de lavage comme décrit précédemment. Sécher l’échantillon avec le bouchon ouvert pendant environ une minute.Dans une hotte, avant une solubilisation des granulés. Distribuer 100 microlitres de la solution protéique dans un flacon en polypropylène. Dans la hotte, ajoutez 400 microlitres de méthanol suivis de 100 microlitres de chloroforme.Boucher brièvement le flacon et le vortex pour mélanger. Distribuez rapidement 300 microlitres d’eau directement au centre du flacon. Boucher le flacon et laisser reposer sur la paillasse sans être dérangé pendant une minute, après avoir placé le flacon en polypropylène dans une centrifugeuse et le faire tourner pendant cinq minutes à 10 000 fois G ou plus à température ambiante.On observe que le flacon a deux couches de solvant et une pastille blanche visible jusqu’au flacon à environ 45 degrés. Retirez environ 700 microlitres du solvant de la couche supérieure à un débit uniforme à l’aide d’une grande pointe de micro-pipette d’un millilitre d’abord et plus tard avec une pointe de pipette de 200 microlitres jusqu’à ce qu’elle forme un cordon dans le flacon. Ajouter 400 microlitres de méthanol frais dans le flacon d’échantillon sans perturber la pastille en distribuant le solvant sur le côté du flacon.Boucher le flacon et combiner les couches de solvant en secouant doucement le flacon pour agiter les solvants ensemble. Observer la pastille de protéine blanche en notant l’orientation du flacon dans la centrifugeuse du rotor pendant au moins 10 minutes à 10 000 fois G ou plus à température ambiante. Inclinez le flacon avec la pastille vers le bas.Placez un embout de pipette le long du bord supérieur du flacon et retirez le surnageant avec un micro-embout de pipette d’un millilitre à un rythme lent mais uniforme. Retenir environ 20 microlitres de solvant. Laisser sécher le solvant résiduel dans la hotte.Pour précipiter la protéine. À l’aide d’une cartouche de filtration jetable, fixez le bouchon à la cartouche de filtration supérieure. Combiner 90 microlitres de solution protéique 10 microlitres d’une mole aquas, du chlorure de sodium et 400 microlitres d’acétone.Incuber pendant au moins deux minutes sur la paillasse, centrifuger l’échantillon de protéines préparées avec le bouchon encore attaché à la cartouche de filtration pendant deux minutes à 2 500 fois G.At température ambiante, retourner la cartouche et dévisser et retirer le bouchon de la base de la cartouche. Placer la cartouche de filtration dans un flacon centrifugeur propre de l’échantillon de protéines pendant trois minutes à 500 fois G à température ambiante. Jetez le solvant d’écoulement du flacon inférieur.Lavez la pastille de protéine en ajoutant 400 microlitres d’acétone à la cartouche de filtration, centrifugez pendant trois minutes à 500 fois G à température ambiante ou jusqu’à ce qu’il ne reste plus de solvant dans la cartouche supérieure. Suivre les protocoles de précipitation des protéines précédemment démontrés. Resolubiliser la protéine en mouillant la membrane à la base de la cartouche de filtration en distribuant deux à cinq microlitres de propanol ISO directement sur la membrane immédiatement avant de procéder au protocole de résolubilisation pour la résolubilisation de la pastille de protéine préparer une solution volumique à 80 % en volume d’acide formique dans l’eau.Pré-refroidir cette solution acide à moins 20 degrés Celsius et la cartouche de filtration contenant des protéines précipitées. Distribuez 50 microlitres d’acide formique dilué à froid dans le bouchon de la cartouche refroidie et le vortex pendant 30 secondes. Remettre la cartouche de filtration au congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant 10 minutes.Répétez les étapes précédentes du vortex et de l’incubation. Ajouter 450 microlitres d’eau à un volume final de 500 microlitres. Diluer l’acide formique à 8%Dévissez la cartouche, retirez le bouchon de la base de la cartouche et fixez la cartouche SPE au flacon.Faites tourner la protéine à travers la cartouche SPE dans une centrifugeuse à température ambiante pendant cinq minutes à 800 fois G.Si le solvant reste dans la cartouche supérieure, remettez la cartouche dans la centrifugeuse et répétez l’essorage. Rincer en ajoutant 300 microlitres d’acétonitrile à 5% avec 0,1% de TFA dans l’eau à la cartouche SPE, écouler à travers la cartouche SPE pendant deux minutes à 2000 fois G.Pour les protéines de faible poids moléculaire ou les peptides digérés, éluer l’échantillon en faisant couler 300 microlitres. A 50% d’acétonitrile avec 0,1% de TFA pendant cinq minutes à 2 500 fois G.For protéines intactes.Poursuivez avec une étape d’élusion supplémentaire en utilisant 300 microlitres d’acétonitrile à 75% avec 0,1% d’acide ascétique trifluoro. Combinez les deux extraits obtenus. La figure compare la déplétion de la SDS après une base de flacon ou la précipitation de protéines dans une cartouche filtrante jetable.Utilisation de l’acétone avec les protocoles conventionnels rapide et CMW. Toutes les approches réduisent les FDS pour permettre une analyse optimale par spectrométrie de masse. Cette figure montre la récupération quantitative des protéines en suivant la précipitation rapide de l’acétone et la précipitation CMW grâce à l’analyse de page SDS d’un lysat cellulaire total de levure traitée.Une récupération constante a été obtenue avec tous les protocoles de précipitations. La précipitation dans une cartouche de filtration jetable élimine le besoin de pipeter soigneusement les FDS contenant du surnageant tout en retenant les protéines agrégées au-dessus d’un filtre à membrane. Ainsi, aucune bande visible n’a été détectée dans les fractions surnageantes à travers trois répétitions indépendantes.La précipitation protéique à base de cartouche démontre une récupération supérieure d’un échantillon de plasma bovin digéré par la pepsine par rapport à la précipitation en flacon. Des différences plus significatives dans le rendement sont notées dans la cartouche lorsque l’utilisation de chlorure de sodium tandis que l’utilisation de solvant de zinc a entraîné le rendement le plus élevé. Cette figure quantifie l’intensité maximale peptidique de chaque échantillon de peptide avec un rapport supérieur à un reflétant une abondance peptidique plus élevée pour les échantillons traités dans les cartouches filtrantes jetables.La figure compare le nombre de peptides identifiés par protéine dans les trois préparations d’échantillons répliquées. Les coefficients de corrélation de 0,94 à 0,95 dans ces graphiques démontrent la grande cohérence de l’approche de préparation des échantillons pour l’analyse par spectrométrie de masse ascendante. Donc, une fois que cette pastille est formée, vous voulez vraiment éviter de la déranger.Si vous le conservez comme une pastille intacte, vous obtiendrez un rendement plus élevé. Assurez-vous donc de ne pas oublier de laver cette pastille avec de l’acétone supplémentaire. Cela nous permet de nous débarrasser de la FDS en gardant notre échantillon aussi propre que possible et cela nous donne la meilleure analyse de spectrométrie de masse.Nous avons donc constaté que l’élimination de l’excès de solvant en inversant le est beaucoup plus simple que d’essayer de pipeter l’échantillon. Vous obtiendrez des rendements plus constants de cette façon. La précipitation de l’acétone à température ambiante a permis une récupération plus constante et plus rapide que la précipitation traditionnelle au congélateur.

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