Name: organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00
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Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada finanziert. Die Autoren danken Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Kanada) und SPARC BioCentre (Molecular Analysis) am Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada) für ihre Beiträge zur Erfassung von MS-Daten.

1. Wesentliche Überlegungen und Probenvorbereitung
<ol><li>Verwenden Sie nur hochreine Lösungsmittel (Aceton, Chloroform, Methanol) (>99,5%) und Chemikalien, frei von überschüssiger Feuchtigkeit.</li>
	<li>Natriumchlorid- und Zinksulfatlösungen (1 M) in Wasser herstellen. HINWEIS: Salzlösungen können unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden, solange sie frei von Verunreinigungen oder mikrobiellem Wachstum sind.</li>
	<li>Verwenden Sie die kleinste Mikrozentrifugendurchstechflasche aus Po...

Eine optimale MS-Charakterisierung wird erreicht, wenn das verbleibende SDS unter 10 ppm erschöpft ist. Während alternative Ansätze wie FASP und Auf-Perlen-Verdauung eine quantitative SDS-Erschöpfung mit variabler Rückgewinnung31,32,33 bieten, besteht das Hauptziel des Niederschlags darin, Reinheit und Ertrag gleichzeitig zu maximieren. Dies hängt davon ab, den Überstand (der das SDS enthält) effektiv zu isolieren, ohne ...

Die Proteomanalyse durch Massenspektrometrie ist aufgrund der verbesserten Empfindlichkeit, Auflösung, Scangeschwindigkeit und Vielseitigkeit moderner MS-Instrumente immer strenger geworden. MS-Fortschritte tragen zu einer höheren Proteinidentifizierungseffizienz und einer präziseren Quantifizierungbei 1,2,3,4,5. Mit verbesserter MS-Instrumentierung fordern die Forscher eine entsprechend konsistente Front-End-Probenvorbereitungsstrategie, die in der Lage ist, hochreine Proteine in kürzester Zeit über alle Phasen des Workflows hinweg quantitativ zurückzugewinnen 6,7,8,9,10,11 . Um den Proteomstatus eines biologischen Systems genau widerzuspiegeln, müssen Proteine effizient und unvoreingenommen aus der nativen Probenmatrix isoliert werden. Zu diesem Zweck gewährleistet die Einbeziehung eines denaturierenden Tensids wie Natriumdodecylsulfat (SDS) eine effiziente Proteinextraktion und -solubilisierung12. SDS stört jedoch stark die Elektrospray-Ionisation, was zu einer starken MS-Signalunterdrückung führt, wenn es nicht ordnungsgemäß eliminiertwird 13.
Für die anschließende Proteomanalyse stehen verschiedene SDS-Depletionsstrategien zur Verfügung, wie z.B. die Retention von Proteinen über einem Molekulargewichts-Cutoff-Filter, der in Einweg-Spinkartuschen14,15,16 enthalten ist. Die filtergestützte Probenvorbereitungsmethode (FASP) wird bevorzugt, da sie SDS unter 10 ppm effektiv erschöpft und eine optimale MS ermöglicht. Die Proteinrückgewinnung mit FASP ist jedoch variabel, was die Erforschung anderer Techniken veranlasste. Chromatographische Ansätze, die selektiv Protein (oder Tensid) einfangen, haben sich zu verschiedenen praktischen Kartuschen oder perlenbasierten Formaten entwickelt 17,18,19,20,21. Angesichts dieser einfachen und (idealerweise) konsistenten Strategien zur Proteinreinigung wird der klassische Ansatz der Proteinfällung mit organischen Lösungsmitteln oft als vielversprechender Ansatz zur Proteinisolierung übersehen. Während gezeigt wird, dass die Ausfällung von Lösungsmitteln SDS erfolgreich unter kritische Werte abbaut, ist die Proteinrückgewinnung seit langem ein Problem dieses Ansatzes. Mehrere Gruppen haben eine Proteinrückgewinnungsverzerrung beobachtet, mit inakzeptabel niedrigen Niederschlagsausbeuten als Funktion der Proteinkonzentration, des Molekulargewichts und der Hydrophobie22,23. Aufgrund der Vielfalt der in der Literatur berichteten Niederschlagsprotokolle wurden standardisierte Niederschlagsbedingungen entwickelt. Im Jahr 2013 berichteten Crowell et al. erstmals über die Abhängigkeit der Ionenstärke von der Ausfällungseffizienz von Proteinen in 80% Aceton24. Für alle untersuchten Proteine erwies sich die Zugabe von bis zu 30 mM Natriumchlorid als unerlässlich, um die Ausbeute zu maximieren (bis zu 100% Rückgewinnung). In jüngerer Zeit zeigten Nickerson et al., dass die Kombination von noch höherer Ionenstärke (bis zu 100 mM) mit erhöhter Temperatur (20 °C) während der Acetonfällung zu einer nahezu quantitativen Erholung in 2-5 min25 führte. Es wurde ein leichter Rückgang der Rückgewinnung von niedermolekularen (LMW) Proteinen beobachtet. Daher zeigte ein nachfolgender Bericht von Baghalabadi et al. die erfolgreiche Rückgewinnung von LMW-Proteinen und Peptiden (≤5 kDa) durch Kombination spezifischer Salze, insbesondere Zinksulfat, mit einem höheren Gehalt an organischem Lösungsmittel (97% Aceton)26.
Während die Verfeinerung des Fällungsprotokolls eine zuverlässigere Proteinreinigungsstrategie für MS-basierte Proteomik verleiht, hängt der Erfolg der konventionellen Niederschlagung stark von der Benutzertechnik ab. Ein primäres Ziel dieser Arbeit ist es, eine robuste Fällungsstrategie zu präsentieren, die die Isolierung des Proteinpellets vom kontaminierenden Überstand erleichtert. Eine Einwegfiltrationskartusche wurde entwickelt, um das Pipettieren zu eliminieren, indem aggregiertes Protein über einem porösen PTFE-Membranfilterisoliert wird 27. MS-störende Bauteile im Überstand werden in einem kurzen, langsamen Zentrifugationsschritt effektiv entfernt. Die Einweg-Filterpatrone bietet auch eine austauschbare SPE-Kartusche, die eine anschließende Probenreinigung nach der Resobilisierung und dem optionalen Proteinaufschluss vor der Massenspektrometrie ermöglicht.
Eine Reihe von empfohlenen Proteom-Fällungs-Workflows werden hier vorgestellt, einschließlich modifizierter Aceton- und Chloroform/Methanol/Wasser-28-Protokolle , in einem konventionellen (auf Durchstechflaschen basierenden) und einem halbautomatischen Format in einer Einweg-Zwei-Zustands-Filtrations- und Extraktionskartusche. Die daraus resultierenden Proteinrückgewinnungsraten und SDS-Abbaueffizienzen werden zusammen mit der Bottom-up-LC-MS/MS-Proteomabdeckung hervorgehoben, um das erwartete Ergebnis jedes Protokolls zu demonstrieren. Die praktischen Vor- und Nachteile, die mit jedem Ansatz verbunden sind, werden diskutiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >AC177170010</td>
			<td >&#8804;0.002 % aldehyde</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetonitrile</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A998-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ammonium Bicarbonate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>A6141-1KG</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta mercaptoethanol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bromophenol blue</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td >Bromophenol blue sodium salt</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >C298-400</td>
			<td >Chloroform</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formic Acid</td>
			<td >Honeywell</td>
			<td >56302</td>
			<td >Eluent additive for LC-MS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of standard protein mixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycerol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >356352-1L-M</td>
			<td >For molecular biology, &#62; 99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A4641</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A452SK-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >75-400-102</td>
			<td >up to 21,000 xg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >05-408-130</td>
			<td >tapered bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (2 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >02-681-321</td>
			<td >rounded bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (0.1-10 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >21-197-28</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (1-200 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-302</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (200-1000 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-303</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >13-710-903</td>
			<td >Micropipet Trio pack</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pepsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>P0525000</td>
			<td >Lyophilized powder,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#62;3200 units/ mg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProTrap XG</td>
			<td >Proteoform Scientific</td>
			<td >PXG-0002</td>
			<td >50 complete units per box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >S9888-1KG</td>
			<td >ACS reagent, &#62;99 %</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >28312</td>
			<td >powdered solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >timsTOF Pro Mass Spectrometer</td>
			<td >Bruker</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of liver proteome extract</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trifluoroacetic Acid</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >L06374.AP</td>
			<td >99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP152-500</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >9002-07-7</td>
			<td >From bovine pancreas, TPCK-treated</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Urea</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1610731</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water (deionized)</td>
			<td>Sartorius Arium Mini Water Purification System</td>
			<td>76307-662</td>
			<td >Type 1 ultrapure (18.2 M&#937; cm)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zinc Sulfate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>307491-100G</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry

Während mehrere Fortschritte in der Massenspektrometrie (MS) die qualitative und quantitative Proteomanalyse verbessert haben, sind zuverlässigere Front-End-Ansätze zur Isolierung, Anreicherung und Verarbeitung von Proteinen vor MS entscheidend für eine erfolgreiche Proteomcharakterisierung. Geringe, inkonsistente Proteinrückgewinnung und Restverunreinigungen wie Tenside sind schädlich für die MS-Analyse. Die Proteinfällung wird im Vergleich zu anderen Probenvorbereitungsstrategien oft als unzuverlässig, zeitaufwendig und technisch anspruchsvoll angesehen. Diese Bedenken werden durch den Einsatz optimaler Proteinausscheidungsprotokolle überwunden. Für die Acetonfällung ist die Kombination von spezifischen Salzen, Temperaturregelung, Lösungsmittelzusammensetzung und Fällungszeit von entscheidender Bedeutung, während die Effizienz der Chloroform-/Methanol-/Wasserfällung von der richtigen Pipettierung und der Manipulation der Durchstechflasche abhängt. Alternativ werden diese Fällungsprotokolle in einer Einweg-Spinkartusche optimiert und halbautomatisch. Die erwarteten Ergebnisse der lösungsmittelbasierten Proteinfällung im konventionellen Format und unter Verwendung einer zweistufigen Einweg-Filtrations- und Extraktionskartusche werden in dieser Arbeit veranschaulicht. Dazu gehört die detaillierte Charakterisierung proteomischer Gemische durch Bottom-up-LC-MS/MS-Analyse. Die überlegene Leistung von SDS-basierten Arbeitsabläufen wird auch im Vergleich zu nicht kontaminiertem Protein demonstriert.

Abbildung 4 fasst die erwartete SDS-Erschöpfung nach einer Fläschchen- oder kartuschengestützten Ausfällung von Proteinen in einer Einweg-Filterpatrone unter Verwendung von Aceton zusammen. Die konventionelle Inkubation über Nacht (-20 °C) in Aceton wird mit dem schnellen Acetonfällungsprotokoll bei Raumtemperatur (Schritt 2) sowie der CMW-Niederschlagsmenge (Schritt 4) verglichen. Das Rest-SDS wurde mit dem Methylenblau-Wirkstoff-Assay (MBAS)29 quantifiziert. ...

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Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

Das vorliegende Protokoll beschreibt die lösungsmittelbasierte Proteinfällung unter kontrollierten Bedingungen für eine robuste und schnelle Gewinnung und Reinigung von Proteomproben vor der Massenspektrometrie.

Proteinfällung auf organischer Lösungsmittelbasis für eine robuste Proteomreinigung vor der Massenspektrometrie

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Diese Protokolle wurden entwickelt, um die Rückgewinnung sowie die Reinheit von Proteinen durch lösungsmittelbasierte Fällung zu maximieren. Wir zeigen Ihnen ein paar Tricks zur Durchführung von Fällungen in Fläschchen sowie einen halbautomatischen Ansatz im Spin-Cartridge-Format. Wir haben auch das Niederschlagsprotokoll optimiert, um konsistent und schnell zu sein.Das gesamte Protokoll dauert nur wenige Minuten. Diese Protokolle zeigen, dass die Lösungsmittelfällung von Proteinen ideal für die Probenvorbereitung vor der Massenspektrometrie ist. Die Protokolle fügen sich nahtlos in Bottom-Up- und Top-Down-Pro-Workflows ein.Ziheng Dang und Victoria Miller, leitende Wissenschaftlerin bei Proteoform Scientific in Halifax, Nova Scotia, werden heute 90 Mikroliter partikelfreie Proteinlösung in ein Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Dann fügen Sie 10 Mikroliter eines Mols wässriges Natriumchlorid und 400 Mikroliter Aceton in die Probenlösung hinzu, verschließen und klopfen Sie vorsichtig auf die Durchstechflasche, um die Lösungsmittel zu kombinieren. Lassen Sie die Durchstechflasche brüten.Raumtemperatur ungestört für mindestens zwei Minuten nach der Inkubation, zentrifugieren Sie die Proben unter Berücksichtigung der Ausrichtung der Durchstechflasche und drehen Sie mindestens zwei Minuten bei 10.000 RCF oder höher bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation wird ein sichtbares weißes Pellet am Boden des Röhrchens beobachtet. Lösen Sie an dieser Stelle das Rohr und dekantieren Sie das Supernat in einen Abfallbehälter, indem Sie das Rohr umdrehen.Verwenden Sie ein Papiertuch, um das restliche Lösungsmittel aus der Durchstechflasche zu ziehen. Für SDB, die Proben enthalten. Dosieren Sie vorsichtig 400 Mikroliter frisches Aceton, ohne das Pellet zu stören.Die Probe wird sofort eine Minute lang bei 10.000 mal G oder höher bei Raumtemperatur zentriert, indem Sie die Durchstechflasche in der gleichen Ausrichtung wie beim ersten Spin in den Rotor legen. Zählen Sie das Waschlösungsmittel wie zuvor beschrieben. Trocknen Sie die Probe bei geöffneter Kappe etwa eine Minute lang.In einem Abzug vor einer Pelletsolubilisierung. Geben Sie 100 Mikroliter der Proteinlösung in eine Durchstechflasche aus Polypropylen. Fügen Sie im Abzug 400 Mikroliter Methanol hinzu, gefolgt von 100 Mikrolitern Chloroform.Verschließen Sie die Durchstechflasche und den Wirbel kurz, um zu mischen. Geben Sie schnell 300 Mikroliter Wasser direkt in die Mitte der Durchstechflasche. Verschließen Sie die Durchstechflasche und lassen Sie sie eine Minute lang ungestört auf dem Tisch, nachdem Sie die Durchstechflasche aus Polypropylen in eine Zentrifuge gelegt und fünf Minuten lang bei 10.000 Mal G oder höher bei Raumtemperatur gedreht haben.Es wird beobachtet, dass die Durchstechflasche zwei Lösungsmittelschichten und ein sichtbares weißes Pellet bis zur Durchstechflasche bei etwa 45 Grad aufweist. Etwa 700 Mikroliter des Lösungsmittels werden mit einer großen Mikropipettenspitze von einem Milliliter und später mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze gleichmäßig aus der oberen Schicht entfernt, bis sie in der Durchstechflasche eine Perle bildet. Fügen Sie 400 Mikroliter frisches Methanol in das Probenfläschchen hinzu, ohne das Pellet zu stören, indem Sie das Lösungsmittel an der Seite des Fläschchens abgeben.Verschließen Sie die Durchstechflasche und kombinieren Sie die Lösungsmittelschichten, indem Sie die Durchstechflasche vorsichtig schaukeln, um die Lösungsmittel miteinander zu verwirbeln. Zur Beobachtung des weißen Proteinpellets ist die Ausrichtung der Durchstechflasche in der Rotorzentrifuge für mindestens 10 Minuten bei 10.000 mal G oder höher bei Raumtemperatur zu beachten. Winkeln Sie die Durchstechflasche mit dem Pellet nach unten.Platzieren Sie eine Pipettenspitze am oberen Rand der Durchstechflasche und entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipettenspitze von einem Milliliter langsam, aber gleichmäßig. Beibehaltung von ca. 20 Mikrolitern Lösungsmittel. Lassen Sie das restliche Lösungsmittel im Abzug trocknen.Um das Protein auszufällen. Befestigen Sie den Stecker mit einer Einweg-Filterpatrone an der oberen Filterpatrone. Kombinieren Sie 90 Mikroliter Proteinlösung 10 Mikroliter eines Mol-Aquas, Natriumchlorid und 400 Mikroliter Aceton.Inkubieren Sie für mindestens zwei Minuten auf dem Tisch, zentrifugieren Sie die vorbereitete Proteinprobe mit dem noch an der Filterpatrone befestigten Stopfen für zwei Minuten bei 2.500 Mal G.At Raumtemperatur, drehen Sie die Patrone um und schrauben Sie den Stopfen von der Kartuschenbasis ab. Legen Sie die Filtrationskartusche in eine saubere Durchstechflasche, zentrifugieren Sie die Proteinprobe für drei Minuten bei 500 mal G bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie das durchströmende Lösungsmittel aus der unteren Durchstechflasche.Waschen Sie das Proteinpellet, indem Sie 400 Mikroliter Aceton in die Filterpatrone geben, zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 500 mal G bei Raumtemperatur oder bis kein Lösungsmittel mehr in der oberen Patrone verbleibt. Nach den zuvor demonstrierten Proteinfällungsprotokollen. Re solubilisieren Sie das Protein, indem Sie die Membran an der Basis der Filtrationskartusche benetzen, indem zwei bis fünf Mikroliter ISO-Propanol direkt auf die Membran gegeben werden, unmittelbar bevor mit dem Re-Solubilisierungsprotokoll zur Resolbilisierung des Proteinpellets fortgefahren wird, und stellen Sie 80% Volumenlösung Ameisensäure in Wasser her.Diese Säurelösung bei minus 20 Grad Celsius und die Filterkartusche mit gefälltem Protein vorkühlen. Geben Sie 50 Mikroliter kalt verdünnte Ameisensäure in die gekühlte Kartuschenkappe und den Wirbel für 30 Sekunden. Bringen Sie die Filterpatrone für 10 Minuten bei minus 20 Grad Celsius in den Gefrierschrank.Wiederholen Sie die vorherigen Wirbel- und Inkubationsschritte. Fügen Sie 450 Mikroliter Wasser zu einem Endvolumen von 500 Mikrolitern hinzu. Ameisensäure auf 8 % verdünnenKehren Sie die Patrone ab, entfernen Sie den Stopfen vom Kartuschenboden, und befestigen Sie die SPE-Patrone an der Durchstechflasche.Schleudern Sie das Protein durch die SPE-Patrone in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur für fünf Minuten bei 800 mal G.Wenn Lösungsmittel in der oberen Patrone verbleibt, bringen Sie die Patrone zur Zentrifuge zurück und wiederholen Sie den Spin. Spülen Sie, indem Sie 300 Mikroliter 5% Acetonitril mit 0,1% TFA in Wasser in die SPE-Kartusche geben, zwei Minuten lang mit 2000 mal G durch die SPE-Patrone fließen.Für niedermolekulare Proteine oder verdaute Peptide eluieren Sie die Probe, indem Sie 300 Mikroliter fließen. Ein 50%Acetonitril mit 0,1% TFA für fünf Minuten bei 2.500 mal G.Für intakte Proteine.Anschließend folgt ein zusätzlicher Elusionsschritt mit 300 Mikrolitern 75% Acetonitril mit 0,1% Trifluorasketsäure. Kombinieren Sie die beiden resultierenden Extrakte. Die Abbildung vergleicht die SDS-Erschöpfung nach Fläschchenbasis oder Fällung von Proteinen in einer Einwegfilterkartusche.Verwendung von Aceton mit den herkömmlichen Schnell- und CMW-Protokollen. Alle Ansätze reduzieren SDS, um eine optimale massenspektrometrische Analyse zu ermöglichen. Diese Abbildung zeigt die quantitative Proteingewinnung nach schneller Acetonfällung und CMW-Fällung durch SDS-Seitenanalyse eines verarbeiteten Hefe-Gesamtzelllysats.Eine konsistente Erholung wurde mit allen Niederschlagsprotokollen erreicht. Durch die Fällung in einer Einweg-Filterkartusche entfällt die Notwendigkeit, SDS-haltigen Überstand sorgfältig zu pipettieren, während die aggregierten Proteine über einem Membranfilter gehalten werden. Somit wurden keine sichtbaren Banden in den überstehenden Fraktionen über drei unabhängige Replikate nachgewiesen.Die kartuschenbasierte Proteinfällung zeigt eine überlegene Ausbeute einer Pepsin-verdauten Probe von Rinderplasma im Vergleich zur Fällung auf Fläschchenbasis. Signifikantere Unterschiede in der Ausbeute werden in der Kartusche festgestellt, wenn Natriumchlorid verwendet wird, während die Verwendung von Zinklösungsmittel zu der höchsten Ausbeute führte. Diese Abbildung quantifiziert die Peptidspitzenintensität jeder Peptidprobe mit einem Verhältnis über eins, das eine höhere Peptidhäufigkeit für Proben widerspiegelt, die in den Einwegfilterpatronen verarbeitet werden.Die Abbildung vergleicht die Anzahl der identifizierten Peptide pro Protein über die drei replizierten Probenvorbereitungen. Die Korrelationskoeffizienten von 0,94 bis 0,95 in diesen Grafiken zeigen die hohe Konsistenz des Probenvorbereitungsansatzes für die Bottom-up-Massenspektrometrie-Analyse. Sobald dieses Pellet gebildet ist, möchten Sie es wirklich vermeiden, es zu stören.Wenn Sie es als intaktes Pellet behalten, erhalten Sie einen höheren Ertrag. Vergessen Sie also nicht, das Pellet mit zusätzlichem Aceton zu waschen. Dies stellt sicher, dass wir das SDS loswerden, um unsere Probe so sauber wie möglich zu halten, und das gibt uns die beste massenspektrometrische Analyse.Wir haben also festgestellt, dass das Entfernen des überschüssigen Lösungsmittels durch Invertieren der Probe viel einfacher ist als der Versuch, die Probe zu pipettieren. Auf diese Weise erhalten Sie konstantere Erträge. Die Durchführung der Acetonfällung bei Raumtemperatur führte zu einer gleichmäßigeren und schnelleren Erholung als die herkömmliche Fällung im Gefrierschrank.

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