Name: organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה. המחברים מודים לביואינפורמטיקה סולושנס בע"מ (ווטרלו, קנדה) ול-SPARC BioCentre (אנליזה מולקולרית) בבית החולים לילדים חולים (טורונטו, קנדה) על תרומתם לרכישת נתוני טרשת נפוצה.

1. שיקולים חומריים והכנה לדוגמה מראש
<ol><li>השתמש רק בממסים בטוהר גבוה (אצטון, כלורופורם, מתנול) (>99.5%) ובכימיקלים, ללא לחות עודפת.</li>
	<li>מכינים תמיסות נתרן כלורי ואבץ גופרתי (1 M) במים. הערה: ניתן לאחסן תמיסות מלח ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר, כל עוד הן נקיות מזיהומים או מצמיחה מיקרוביא...

אפיון מיטבי של טרשת נפוצה מושג כאשר SDS שיורי מתרוקן מתחת ל-10 עמודים לדקה. בעוד שגישות חלופיות, כגון FASP ועיכול על חרוזים, מציעות דלדול כמותי של SDS עם התאוששות משתנה 31,32,33, המטרה העיקרית של משקעים היא למקסם את הטוהר והתפוקה בו זמנית. זה תלוי בבי...

ניתוח פרוטאומים על ידי ספקטרומטריית מסות הפך לקפדני יותר ויותר, בשל הרגישות, הרזולוציה, מהירות הסריקה והרב-תכליתיות המשופרות של מכשירי MS מודרניים. התקדמות הטרשת הנפוצה תורמת ליעילות גדולה יותר של זיהוי חלבונים ולכמות מדויקת יותרשל 1,2,3,4,5. עם מכשור משופר לטרשת נפוצה, החוקרים דורשים אסטרטגיית הכנת דגימות חזיתית עקבית המתאימה, המסוגלת לשחזר כמותית של חלבונים בעלי טוהר גבוה בזמן מינימלי בכל שלבי זרימת העבודה 6,7,8,8,9,10,11 . כדי לשקף במדויק את מצב הפרוטאום של מערכת ביולוגית, יש לבודד חלבונים ממטריצת הדגימה המקומית בצורה יעילה ובלתי משוחדת. לשם כך, כולל חומר פעילי שטח דנטורינג, כגון נתרן דודציל סולפט (SDS), מבטיח מיצוי חלבונים יעיל וסולוביליזציה12. עם זאת, SDS מפריע מאוד ליינון אלקטרוספריי, וגורם לדיכוי אות חמור של טרשת נפוצה אם לא בוטל כראוי13.
אסטרטגיות שונות של דלדול SDS זמינות לניתוח פרוטאומים לאחר מכן, כגון שימור חלבונים מעל מסנן ניתוק משקל מולקולרי הכלול בתוך מחסניות ספין חד פעמיות 14,15,16. שיטת הכנת הדגימה בסיוע מסנן (FASP) מועדפת מכיוון שהיא מדלדלת ביעילות SDS מתחת ל-10 עמודים לדקה, ומאפשרת טרשת נפוצה אופטימלית. עם זאת, התאוששות חלבונים עם FASP היא משתנה, מה שהניע את חקר הטכניקות האחרות. גישות כרומטוגרפיות הלוכדות באופן סלקטיבי חלבון (או פעילי שטח) התפתחו למחסניות נוחות שונות או לפורמטים מבוססי חרוזים 17,18,19,20,21. בהתחשב באסטרטגיות הפשוטות והעקביות (האידיאליות) הללו לטיהור חלבונים, לעתים קרובות מתעלמים מהגישה הקלאסית של משקעי חלבונים עם ממסים אורגניים כגישה מבטיחה לבידוד חלבונים. בעוד שמשקעים ממסים הוכחו כמדלדלים SDS מתחת לרמות קריטיות בהצלחה, התאוששות חלבונים היא דאגה ארוכת שנים של גישה זו. קבוצות רבות הבחינו בהטיית התאוששות חלבונים, עם תפוקת משקעים נמוכה באופן בלתי מתקבל על הדעת כפונקציה של ריכוז חלבונים, משקל מולקולרי והידרופוביות22,23. בשל מגוון פרוטוקולי המשקעים המדווחים בספרות, פותחו תנאי משקעים סטנדרטיים. בשנת 2013, Crowell et al. דיווחו לראשונה על התלות של חוזק יוני ביעילות המשקעים של חלבונים ב-80% אצטון24. עבור כל החלבונים שנבדקו, תוספת של עד 30 mM נתרן כלורי הוכחה כחיונית כדי למקסם את היבולים (עד 100% התאוששות). לאחרונה, ניקרסון ואחרים הראו כי השילוב של חוזק יוני גבוה עוד יותר (עד 100 מ"מ) עם טמפרטורה גבוהה (20 מעלות צלזיוס) במהלך משקעי אצטון נתן כמעט התאוששות כמותית תוך 2-5 דקות25. נצפתה ירידה קלה בהתאוששות של חלבוני משקל מולקולרי נמוך (LMW). לכן, דו"ח מאוחר יותר של Baghalabadi et al. הדגים את ההתאוששות המוצלחת של חלבוני LMW ופפטידים (≤5 kDa) על ידי שילוב של מלחים ספציפיים, במיוחד אבץ גופרתי, עם רמה גבוהה יותר של ממס אורגני (97% אצטון)26.
בעוד שעידון פרוטוקול המשקעים מעניק אסטרטגיה אמינה יותר לטיהור חלבונים עבור פרוטאומיקה מבוססת טרשת נפוצה, ההצלחה של משקעים קונבנציונליים מסתמכת במידה רבה על טכניקת המשתמש. אחת המטרות העיקריות של עבודה זו היא להציג אסטרטגיית משקעים חזקה המאפשרת את הבידוד של גלולת החלבון מהסופרנטנט המזהם. מחסנית סינון חד פעמית פותחה כדי למנוע צנרת על ידי בידוד חלבון מצטבר מעל מסנן קרום PTFE נקבובי27. רכיבים המפריעים ל-MS בסופרנטנט מוסרים ביעילות בשלב צנטריפוגה קצר במהירות נמוכה. מחסנית המסנן החד פעמית מציעה גם מחסנית SPE הניתנת להחלפה, המאפשרת ניקוי דגימות לאחר מכן לאחר רה-lubilization ועיכול חלבונים אופציונלי, לפני ספקטרומטריית מסה.
סדרה של תהליכי עבודה מומלצים של משקעי פרוטאום מוצגים כאן, כולל פרוטוקולים מותאמים של אצטון וכלורופורם/מתנול/מים28 , בפורמט קונבנציונלי (מבוסס בקבוקון) ובפורמט חצי אוטומטי במחסנית סינון ומיצוי חד-פעמית של שני מצבים. התאוששות החלבון המתקבלת ויעילות דלדול ה-SDS מודגשים, יחד עם כיסוי פרוטאום LC-MS/MS מלמטה למעלה, כדי להדגים את התוצאה הצפויה מכל פרוטוקול. היתרונות המעשיים והחסרונות הקשורים לכל גישה נדונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >AC177170010</td>
			<td >&#8804;0.002 % aldehyde</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetonitrile</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A998-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ammonium Bicarbonate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>A6141-1KG</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta mercaptoethanol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bromophenol blue</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td >Bromophenol blue sodium salt</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >C298-400</td>
			<td >Chloroform</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formic Acid</td>
			<td >Honeywell</td>
			<td >56302</td>
			<td >Eluent additive for LC-MS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of standard protein mixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycerol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >356352-1L-M</td>
			<td >For molecular biology, &#62; 99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A4641</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A452SK-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >75-400-102</td>
			<td >up to 21,000 xg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >05-408-130</td>
			<td >tapered bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (2 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >02-681-321</td>
			<td >rounded bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (0.1-10 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >21-197-28</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (1-200 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-302</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (200-1000 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-303</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >13-710-903</td>
			<td >Micropipet Trio pack</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pepsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>P0525000</td>
			<td >Lyophilized powder,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#62;3200 units/ mg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProTrap XG</td>
			<td >Proteoform Scientific</td>
			<td >PXG-0002</td>
			<td >50 complete units per box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >S9888-1KG</td>
			<td >ACS reagent, &#62;99 %</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >28312</td>
			<td >powdered solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >timsTOF Pro Mass Spectrometer</td>
			<td >Bruker</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of liver proteome extract</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trifluoroacetic Acid</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >L06374.AP</td>
			<td >99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP152-500</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >9002-07-7</td>
			<td >From bovine pancreas, TPCK-treated</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Urea</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1610731</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water (deionized)</td>
			<td>Sartorius Arium Mini Water Purification System</td>
			<td>76307-662</td>
			<td >Type 1 ultrapure (18.2 M&#937; cm)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zinc Sulfate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>307491-100G</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry

בעוד שהתקדמות מרובה במכשירי ספקטרומטריית מסות (MS) שיפרה את ניתוח הפרוטאומים האיכותי והכמותי, גישות חזיתיות אמינות יותר לבודד, להעשיר ולעבד חלבונים לפני טרשת נפוצה הן קריטיות לאפיון מוצלח של פרוטאומים. התאוששות חלבון נמוכה ולא עקבית וזיהומים שיוריים כגון חומרים פעילי שטח מזיקים לניתוח טרשת נפוצה. משקעים בחלבון נחשבים לעתים קרובות כלא אמינים, גוזלים זמן ומאתגרים מבחינה טכנית לביצוע בהשוואה לאסטרטגיות אחרות להכנת דגימות. על חששות אלה מתגברים על ידי שימוש בפרוטוקולים אופטימליים של משקעי חלבונים. עבור משקעי אצטון, השילוב של מלחים ספציפיים, בקרת טמפרטורה, הרכב ממסים וזמן משקעים הוא קריטי, בעוד שהיעילות של משקעי כלורופורם/מתנול/מים תלויה בצנרת נכונה ובמניפולציה של בקבוקון. לחלופין, פרוטוקולי משקעים אלה יעילים ואוטומטיים למחצה בתוך מחסנית ספין חד פעמית. התוצאות הצפויות של משקעי חלבון מבוססי ממס בפורמט הקונבנציונלי ושימוש במחסנית סינון ומיצוי חד-שלבית דו-שלבית מודגמות בעבודה זו. זה כולל את האפיון המפורט של תערובות פרוטאומיות על ידי ניתוח LC-MS/MS מלמטה למעלה. הביצועים המעולים של זרימות עבודה מבוססות SDS מודגמים גם ביחס לחלבון שאינו מזוהם.

איור 4 מסכם את הידלדלות ה-SDS הצפויה בעקבות משקעים מבוססי בקבוקון או מקלים על מחסנית של חלבונים במחסנית מסנן חד פעמית באמצעות אצטון. דגירה קונבנציונלית בלילה (-20 מעלות צלזיוס) באצטון מושווית לפרוטוקול משקעי האצטון המהיר בטמפרטורת החדר (שלב 2), כמו גם למשקעי CMW (שלב 4). שאריות SDS כ...

Watch this Scientific Journal Video about Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry at JoVE.com

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

הפרוטוקול הנוכחי מתאר משקעי חלבונים מבוססי ממסים בתנאים מבוקרים להתאוששות וטיהור חזקים ומהירים של דגימות פרוטאום לפני ספקטרומטריית מסות.

משקעי חלבון אורגניים מבוססי ממסים לטיהור פרוטאום חזק לפני ספקטרומטריית מסה

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

פרוטוקולים אלה נועדו למקסם את ההתאוששות, כמו גם את טוהר החלבונים באמצעות משקעים מבוססי ממסים. אנחנו הולכים להראות לך כמה טריקים כדי לבצע משקעים בקבוקונים, כמו גם גישה חצי אוטומטית בפורמט מחסנית ספין. כמו כן, ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול המשקעים כך שיהיה עקבי ומהיר.הפרוטוקול כולו לוקח רק כמה דקות. פרוטוקולים אלה מראים כי משקעים ממסים של חלבונים הם אידיאליים להכנת דגימות לפני ספקטרומטריית מסות. הפרוטוקולים יתאימו בצורה חלקה לתזרימי עבודה מקצועיים מלמטה למעלה, כמו גם מלמעלה למטה.מדגימים עבורנו היום יהיו זיהנג דנג וויקטוריה מילר, מדענית בכירה ב- Proteoform Scientific בהליפקס, נובה סקוטיה פיפטה 90 מיקרוליטר של תמיסת חלבון ללא חלקיקים לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו פוליפרופילן. לאחר מכן הוסיפו 10 מיקרוליטרים של נתרן כלורי מימי אחד ו-400 מיקרוליטרים של אצטון לתמיסת הדגימה, כבשו והקישו על הבקבוקון בעדינות כדי לשלב את הממסים. אפשרו לבקבוקון לדגור אותו.טמפרטורת החדר ללא הפרעה במשך מינימום של שתי דקות לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הדגימות לציין את הכיוון של הבקבוקון להסתובב במשך מינימום של שתי דקות ב 10, 000 RCF או גבוה יותר בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, כדור לבן גלוי נצפה בתחתית הצינור. בשלב זה, פתח את הצינור ושקע את הסופרנט למיכל פסולת על ידי היפוך הצינור.השתמש במגבת נייר כדי לשאוב כל ממס שיורי מהבקבוקון. עבור SDS המכיל דוגמאות. בזהירות לחלק 400 microliters של אצטון טרי מבלי להפריע את הכדור.מיד centrafuse את הדגימה במשך דקה אחת ב 10, 000 פעמים G ומעלה בטמפרטורת החדר על ידי הצבת הבקבוקון לתוך הרוטור באותו כיוון כמו הספין הראשוני. ציין את ממס הכביסה כפי שתואר קודם לכן. יבשו את הדגימה כשהפקק פתוח למשך כדקה.במכסה אדים, לפני סולובילזציה של גלולה. יש לחלק 100 מיקרוליטר מתמיסת החלבון לתוך בקבוקון פוליפרופילן. במכסה האדים מוסיפים 400 מיקרוליטרים של מתנול ואחריהם 100 מיקרוליטרים של כלורופורם.מכסים את הבקבוקון והמערבולת לזמן קצר כדי לערבב. יש לטפטף במהירות 300 מיקרוליטרים של מים ישירות למרכז הבקבוקון. מכסים את הבקבוקון ומאפשרים לו לשבת על הספסל ללא הפרעה למשך דקה אחת, לאחר מניחים את בקבוקון הפוליפרופילן בצנטריפוגה ומסובבים אותו במשך חמש דקות ב 10, 000 פעמים G ומעלה בטמפרטורת החדר.הבקבוקון הוא ציין שיש שתי שכבות ממס וכדור לבן גלוי עד הבקבוקון בערך 45 מעלות. הסר כ -700 מיקרוליטר של הממס מהשכבה העליונה בקצב אחיד באמצעות קצה מיקרו פיפטה גדול של מיליליטר אחד בתחילה ומאוחר יותר עם קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר עד שהוא יוצר חרוז בבקבוקון. הוסיפו 400 מיקרוליטרים של מתנול טרי לבקבוקון הדגימה מבלי להפריע לכדור על ידי חלוקת הממס במורד דופן הבקבוקון.מכסים את הבקבוקון ומשלבים את שכבות הממס על ידי נדנדה עדינה של הבקבוקון כדי לסובב את הממסים יחד. כדי לבחון את כדור החלבון הלבן המציין את הכיוון של הבקבוקון בצנטריפוגת הרוטור במשך מינימום של 10 דקות ב 10, 000 פעמים G ומעלה בטמפרטורת החדר. זווית את הבקבוקון כאשר הכדור פונה כלפי מטה.מניחים קצה פיפטה לאורך הקצה העליון של הבקבוקון ומסירים את הסופרנטנט עם קצה מיקרו פיפטה של מיליליטר אחד בקצב איטי אך אחיד. שמירה על כ 20 מיקרוליטר של ממס. אפשרו לשאריות הממס להתייבש במכסה האדים.כדי לזרז את החלבון. באמצעות מחסנית סינון חד פעמית חבר את התקע למחסנית הסינון העליונה. שלב 90 מיקרוליטר של תמיסת חלבון 10 מיקרוליטר של שומה אחת אקווה, נתרן כלורי ו 400 מיקרוליטר של אצטון.דגירה במשך שתי דקות לפחות על הספסל, צנטריפוגה של דגימת חלבון מוכן עם התקע עדיין מחובר למחסנית הסינון במשך שתי דקות ב 2, 500 פעמים G.At טמפרטורת החדר, להפוך את המחסנית ולפתוח ולהסיר את התקע מבסיס המחסנית. הניחו את מחסנית הסינון בצנטריפוגה נקייה של דגימת החלבון למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 500 פעמים G בטמפרטורת החדר. השליכו את הזרימה דרך הממס מהבקבוקון התחתון.לשטוף את גלולת החלבון על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של אצטון למחסנית הסינון, צנטריפוגה במשך שלוש דקות ב 500 פעמים G בטמפרטורת החדר או עד שלא נשאר ממס במחסנית העליונה. בעקבות פרוטוקולי משקעי החלבון שהודגמו בעבר. ניתן לבודד מחדש את החלבון על ידי הרטבת הממברנה בבסיס מחסנית הסינון על ידי חלוקת שניים עד חמישה מיקרוליטרים של ISO פרופנול ישירות לממברנה מיד לפני שממשיכים לפרוטוקול ה-re solubilization ל-re solubilization של גלולת החלבון להכין 80% נפח לפי נפח תמיסה של חומצה פורמית במים.מצננים מראש את תמיסת החומצה הזו בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס ואת מחסנית הסינון המכילה חלבון משופע. יש לפזר 50 מיקרוליטר של חומצה פורמית מדוללת קרה לתוך מכסה המחסנית המצונן והמערבולת למשך 30 שניות. החזירו את מחסנית הסינון למקפיא בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.חזור על שלבי המערבולת והדגירה הקודמים. הוסיפו 450 מיקרוליטרים של מים לנפח סופי של 500 מיקרוליטרים. דילול החומצה הפורמית ל-8% הפוך את ביטול ההברגה של המחסנית, הסר את התקע מבסיס המחסנית וחבר את מחסנית ה-SPE לבקבוקון.סובב את החלבון דרך מחסנית SPE בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות ב 800 פעמים G.אם הממס נשאר במחסנית העליונה להחזיר את המחסנית לצנטריפוגה ולחזור על הסחיטה. יש לשטוף על ידי הוספת 300 מיקרוליטרים של 5% אצטוניטריל עם 0.1% TFA במים למחסנית SPE, לזרום דרך מחסנית SPE במשך שתי דקות במחיר של 2000 פעמים G.עבור חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך או פפטידים מעוכלים יש לחמוק מהדגימה על ידי הזרמת 300 מיקרוליטר. אצטוניטריל 50% עם 0.1% TFA למשך חמש דקות ב-2, 500 פעמים G.לחלבונים שלמים.המשך עם שלב חמקמקות נוסף באמצעות 300 מיקרוליטרים של 75% אצטוניטריל עם 0.1% חומצה סגפנית Trifluoro. שלבו את שתי התמציות המתקבלות. האיור משווה את דלדול ה-SDS בעקבות בקבוקון מבוסס או משקעים של חלבונים במחסנית מסנן חד פעמית.שימוש באצטון עם פרוטוקולי המהירות וה-CMW הקונבנציונליים. כל הגישות מפחיתות את ה-SDS כדי לאפשר ניתוח אופטימלי של ספקטרומטריית מסות. איור זה מראה התאוששות כמותית של חלבונים על-ידי מעקב אחר משקעי אצטון מהירים ומשקעי CMW באמצעות ניתוח דף SDS של ליזאט תאי כולל של שמרים מעובדים.התאוששות עקבית הושגה עם כל פרוטוקולי המשקעים. משקעים במחסנית סינון חד פעמית מבטלים את הצורך בפיפטציה זהירה של SDS המכילה סופרנטנט תוך שמירה על החלבונים המצטברים מעל מסנן ממברנה. לפיכך לא זוהו פסים נראים לעין בשברים העל-טבעיים על פני שלושה שכפולים עצמאיים.משקעי החלבון המבוססים על מחסנית מדגימים התאוששות מעולה של דגימה מעוכלת של פפסין של פלזמת בקר ביחס למשקעים על בסיס בקבוקונים. הבדלים משמעותיים יותר בתפוקה מצוינים במחסנית כאשר שימוש בנתרן כלורי תוך שימוש בממס אבץ הביא לתפוקה הגבוהה ביותר. נתון זה מכמת את עוצמת שיא הפפטידים מכל דגימת פפטיד עם יחס מעל אחד המשקף שפע פפטידי גבוה יותר עבור דגימות המעובדות במחסניות המסנן החד פעמיות.האיור משווה את מספר הפפטידים שזוהו לכל חלבון בשלושת תכשירי הדגימה המשוכפלים. מקדמי המתאם של 0.94 עד 0.95 בגרפים אלה מדגימים את העקביות הגבוהה של גישת הכנת הדגימה לניתוח ספקטרומטריית מסות מלמטה למעלה. אז ברגע שהכדור הזה נוצר אתה באמת רוצה להימנע מלהפריע לו.אם תשמור אותו ככדור שלם תקבל תשואה גבוהה יותר. אז הקפידו לא לשכוח לשטוף את הכדור הזה עם תוספת אצטון. זה מוודא שאנחנו נפטרים מה-SDS ששומר על הדגימה שלנו נקייה ככל האפשר וזה נותן לנו את ניתוח ספקטרומטריית המסות הטוב ביותר.אז מצאנו שהסרת הממס העודף על ידי היפוך היא הרבה יותר פשוטה מאשר לנסות לקטר את הדגימה. בדרך זו תקבלו תשואות עקביות יותר. ביצוע משקעי אצטון בטמפרטורת החדר הביא להתאוששות עקבית ומהירה יותר מאשר משקעים מסורתיים במקפיא.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Complexometric Titration, Precipitation Titration, and Gravimetry

SCIENTISTS IN ACTION

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

ניתוח של תרכובות נדיפות רגישות וחמצון באמצעות מערכת קרה מפרצון ואלקטרוני השפעה המוני ספקטרומטריית

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

ויזואליזציה של ספקטרומטריית אמביינט המוני עם השימוש של צילומי שליארן

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

וזמינותו HS-MRM עבור כימות של התא המארח חלבונים בחלבון ביופרמצבטיקה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית יון ניידות QTOF ספקטרומטר מסה

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Fizzy Extraction of Volatile Organic Compounds Combined with Atmospheric Pressure Chemical Ionization Quadrupole Mass Spectrometry

פיצי הפקה של תרכובות אורגניות נדיפות בשילוב עם לחץ אטמוספרי כימי יוניזציה Quadropole מסה ספקטרומטריית

Chemical analysis of volatile and semivolatile compounds dissolved in liquid samples can be challenging. The dissolved components need to be brought to ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

אנליזת נשימה בזמן אמת באמצעות Nanoelectrospray משני יינון מצמידים ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

סינתזה וניתוח ספקטרומטר מסה של Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

ניתוח ארכיטקטורות חלבון חלבון-ליגנד מתחמי באמצעות ספקטרומטר מסה מבניים אינטגרטיבית

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining as a Tool to Uncover Novel Natural Products

המסה ספקטרומטר מודרמטריה מונחה הגנום ככלי לחשוף מוצרים טבעיים הרומן

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

ספקטרומטריית מסה אלקטרופורזיס נימית גישות לאפיון החלבון וקורונה מטבולית שנרכשו על ידי ננו-חומרים

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...