Name: organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00
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この研究は、カナダの自然科学・工学研究評議会から資金提供を受けました。著者らは、MSデータの取得に貢献してくれたBioinformatics Solutions Inc.(カナダ、ウォータールー)とHospital for Sick Children(トロント、カナダ)のSPARC BioCenter(Molecular Analysis)に感謝する。

1. 材料に関する考慮事項とサンプルの事前準備
<ol><li>高純度の溶媒(アセトン、クロロホルム、メタノール)(>99.5%)と化学薬品のみを使用し、余分な水分を含まない。</li>
	<li>水に塩化ナトリウムと硫酸亜鉛の溶液(1 M)を調製する。 注:塩溶液は、汚染物質または微生物の増殖がない限り、室温で無期限に保存することができます。</li>
	<li>沈殿を誘導するために必要な量のサンプ...

最適なMS特性評価は、残留SDSが10ppm未満で枯渇すると達成されます。FASPやビーズ上消化などの代替アプローチは、可変回収率31、32、33で定量的なSDS枯渇を提供しますが、沈殿の主な目的は純度と収率を同時に最大化することです。これは、タンパク質ペレットを乱すことなく上清(SDSを含む)を効果的に単離することに依存?...

質量分析によるプロテオーム分析は、最新のMS機器の感度、分解能、スキャン速度、汎用性の向上により、ますます厳格になっています。MSの進歩は、より高いタンパク質同定効率およびより正確な定量1,2,3,4,5に寄与する。改善されたMS機器により、研究者は、ワークフローのすべての段階で最小限の時間で高純度タンパク質を定量回収できる、それに対応して一貫したフロントエンドサンプル調製戦略を求めています6,7,8,9,10,11 .生物学的系のプロテオーム状態を正確に反映するには、タンパク質を効率的かつ偏りのない方法で天然のサンプルマトリックスから単離する必要があります。この目的のために、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの変性界面活性剤を含む、効率的なタンパク質抽出および可溶化12を保証する。しかし、SDSはエレクトロスプレーイオン化を強く妨害し、適切に排除しないと厳しいMS信号抑制を引き起こす13。
使い捨てスピンカートリッジ14、15、16内に含まれる分子量カットオフフィルターを超えるタンパク質の保持など、その後のプロテオーム分析のために様々なSDS枯渇戦略が利用可能である。フィルター支援サンプル調製法(FASP)は、10ppm未満のSDSを効果的に枯渇させ、最適なMSを容易にするため、好まれています。しかし、FASPによるタンパク質回収は可変であり、これが他の技術の探求を促した。タンパク質(または界面活性剤)を選択的に捕捉するクロマトグラフィーアプローチは、様々な便利なカートリッジまたはビーズベースのフォーマットに進化してきた17、18、19、20、21。タンパク質精製に対するこれらの単純で(理想的には)一貫した戦略を考えると、有機溶媒によるタンパク質沈殿の古典的なアプローチは、タンパク質単離への有望なアプローチとして見過ごされがちです。溶媒沈殿はSDSを臨界レベル以下に正常に枯渇させることが示されていますが、タンパク質回収はこのアプローチの長年の懸念事項でした。複数のグループがタンパク質回収バイアスを観察しており、タンパク質濃度、分子量、疎水性の関数として許容できないほど低い沈殿収率で22,23。文献で報告された沈殿プロトコルの多様性のために、標準化された沈殿条件が開発された。2013年、Crowellらは、80%アセトン24中のタンパク質の沈殿効率に対するイオン強度の依存性を最初に報告した。調べたすべてのタンパク質について、最大30mM塩化ナトリウムの添加は、収量を最大化する(最大100%回収)ために不可欠であることが示された。より最近では、Nickersonらは、アセトン沈殿中のさらに高いイオン強度(最大100mM)と高温(20°C)の組み合わせが、2〜5分25分でほぼ定量的な回復をもたらすことを示した。低分子量(LMW)タンパク質の回収率のわずかな低下が観察された。したがって、Baghalabadiらによるその後の報告では、特定の塩、特に硫酸亜鉛をより高いレベルの有機溶媒(97%アセトン)と組み合わせることによって、LMWタンパク質およびペプチド(≤5kDa)の回収に成功したことが実証されました26。
沈殿プロトコルを精製することで、MSベースのプロテオミクスのタンパク質精製戦略がより信頼性の高いものになりますが、従来の沈殿の成功はユーザーの技術に大きく依存しています。この研究の主な目的は、汚染上清からのタンパク質ペレットの単離を容易にする堅牢な沈殿戦略を提示することです。使い捨てろ過カートリッジは、多孔質PTFEメンブレンフィルター27の上に凝集タンパク質を単離することによってピペッティングを排除するために開発された。上清中のMS干渉成分は、短時間の低速遠心分離工程で効果的に除去されます。使い捨てフィルターカートリッジは、交換可能なSPEカートリッジも提供しており、質量分析に先立って、再可溶化とオプションのタンパク質消化後の後続のサンプルクリーンアップを容易にします。
ここでは、修正アセトンおよびクロロホルム/メタノール/水28 プロトコルを含む一連の推奨プロテオーム沈殿ワークフローを、従来の(バイアルベース)および使い捨ての2状態ろ過および抽出カートリッジの半自動形式で紹介します。得られたタンパク質回収率とSDS枯渇効率をボトムアップのLC-MS/MSプロテオームカバレッジとともに強調し、各プロトコルから期待される結果を実証します。各アプローチに関連する実用的な利点と欠点について説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >AC177170010</td>
			<td >&#8804;0.002 % aldehyde</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetonitrile</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A998-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ammonium Bicarbonate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>A6141-1KG</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta mercaptoethanol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bromophenol blue</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td >Bromophenol blue sodium salt</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >C298-400</td>
			<td >Chloroform</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formic Acid</td>
			<td >Honeywell</td>
			<td >56302</td>
			<td >Eluent additive for LC-MS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of standard protein mixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycerol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >356352-1L-M</td>
			<td >For molecular biology, &#62; 99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A4641</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A452SK-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >75-400-102</td>
			<td >up to 21,000 xg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >05-408-130</td>
			<td >tapered bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (2 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >02-681-321</td>
			<td >rounded bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (0.1-10 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >21-197-28</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (1-200 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-302</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (200-1000 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-303</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >13-710-903</td>
			<td >Micropipet Trio pack</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pepsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>P0525000</td>
			<td >Lyophilized powder,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#62;3200 units/ mg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProTrap XG</td>
			<td >Proteoform Scientific</td>
			<td >PXG-0002</td>
			<td >50 complete units per box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >S9888-1KG</td>
			<td >ACS reagent, &#62;99 %</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >28312</td>
			<td >powdered solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >timsTOF Pro Mass Spectrometer</td>
			<td >Bruker</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of liver proteome extract</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trifluoroacetic Acid</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >L06374.AP</td>
			<td >99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP152-500</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >9002-07-7</td>
			<td >From bovine pancreas, TPCK-treated</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Urea</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1610731</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water (deionized)</td>
			<td>Sartorius Arium Mini Water Purification System</td>
			<td>76307-662</td>
			<td >Type 1 ultrapure (18.2 M&#937; cm)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zinc Sulfate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>307491-100G</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry

質量分析(MS)機器の複数の進歩により、定性的および定量的プロテオーム分析が改善されましたが、MSに先んじてタンパク質を単離、濃縮、および処理するためのより信頼性の高いフロントエンドアプローチは、プロテオーム特性評価を成功させるために不可欠です。低く、一貫性のないタンパク質回収率および界面活性剤などの残留不純物は、MS分析に有害である。タンパク質沈殿は、他のサンプル調製戦略と比較して、信頼性が低く、時間がかかり、技術的に実行が難しいと考えられがちです。これらの懸念は、最適なタンパク質沈殿プロトコルを採用することによって克服されます。アセトン沈殿の場合、特定の塩、温度制御、溶媒組成、および沈殿時間の組み合わせが重要ですが、クロロホルム/メタノール/水沈殿の効率は適切なピペッティングとバイアル操作に依存します。あるいは、これらの沈殿プロトコルは、使い捨てスピンカートリッジ内で合理化され、半自動化されています。従来の形式で、使い捨ての2段階ろ過および抽出カートリッジを使用した溶媒ベースのタンパク質沈殿の予想される結果を、この研究で示します。これには、ボトムアップのLC-MS/MS 分析によるプロテオーム混合物の詳細な特性評価が含まれます。SDSベースのワークフローの優れた性能は、非汚染タンパク質と比較しても実証されています。

図4 は、アセトンを用いた使い捨てフィルターカートリッジ中のタンパク質のバイアルベースまたはカートリッジ促進沈殿に続く予想されるSDS枯渇を要約する。アセトン中での従来の一晩インキュベーション(−20°C)は、室温での迅速なアセトン沈殿プロトコル(ステップ2)、ならびにCMW沈殿(ステップ4)と比較される。残留SDSは、メチレンブルー活性物質(MBAS)アッセイ<sup cl...

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Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

本プロトコールは、質量分析前のプロテオームサンプルの堅牢かつ迅速な回収および精製のための制御された条件下での溶媒ベースのタンパク質沈殿を記載する。

質量分析に先立つ堅牢なプロテオーム精製のための有機溶媒ベースのタンパク質沈殿

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

これらのプロトコルは、溶媒ベースの沈殿によりタンパク質の回収率と純度を最大化するように設計されています。バイアルで沈殿を実行するためのいくつかのトリックと、スピンカートリッジ形式での半自動アプローチを紹介します。また、沈殿プロトコルを最適化して、一貫性と迅速性を実現しました。プロトコル全体は数分しかかかりません。これらのプロトコルは、タンパク質の溶媒沈殿が質量分析に先立つサンプル調製に理想的であることを示しています。プロトコルは、ボトムアップおよびトップダウンのプロワークフローにシームレスに適合します。今日私たちのためにデモンストレーションするのは、ノバスコシア州ハリファックスのプロテオフォームサイエンティフィックのシニアサイエンティストであるZiheng DangとVictoria Millerです。 ピペット 90マイクロリットルの粒子状遊離タンパク質溶液をポリプロピレンマイクロ遠心チューブに入れます。次に、10マイクロリットルの1モル塩化ナトリウム水溶液と400マイクロリットルのアセトンをサンプル溶液に加え、キャップをしてバイアルを軽くたたき、溶媒を混ぜ合わせます。バイアルがそれをインキュベートするのを待ちます。インキュベーション後最低2分間室温で乱されず、バイアルの向きに注意してサンプルを遠心分離し、室温で10, 000 RCF以上で最低2分間スピンします。遠心分離後、チューブの底部に目に見える白いペレットが観察されます。この時点で、チューブのキャップを外し、チューブを反転させて上層を廃棄物容器にデカントします。ペーパータオルを使用して、バイアルから残留溶媒を引き出します。サンプルを含むSDSの場合。ペレットを乱すことなく、400マイクロリットルの新鮮なアセトンを慎重に分注します。バイアルを最初のスピンと同じ向きでローターに入れることにより、室温で10, 000倍G以上で1分間サンプルを直ちに遠心分離します。前述のように洗浄溶剤を数えます。キャップを開けた状態でサンプルを約1分間乾燥させます。ドラフト内で、ペレット可溶化の前。100マイクロリットルのタンパク質溶液をポリプロピレンバイアルに分注します。ドラフトに、400マイクロリットルのメタノールを追加し、続いて100マイクロリットルのクロロホルムを追加します。バイアルとボルテックスを短時間キャップして混合します。300マイクロリットルの水をバイアルの中央に直接すばやく分注します。バイアルにキャップをし、ポリプロピレンバイアルを遠心分離機に入れ、室温で10, 000倍G以上で5分間回転させた後、1分間邪魔されずにベンチトップに座らせます。バイアルは、2つの溶媒層および約45度でバイアルまで目に見える白いペレットを有することが観察される。バイアル内にビーズが形成されるまで、最初に1ミリリットルの大きなマイクロピペットチップを使用して、後で200マイクロリットルのピペットチップを使用して、上層から約700マイクロリットルの溶媒を均一な速度で除去します。バイアルの側面に溶媒を分注することにより、ペレットを乱すことなく400マイクロリットルの新鮮なメタノールをサンプルバイアルに追加します。バイアルにキャップをし、バイアルを静かに揺らして溶媒を一緒に渦巻かせて溶媒層を結合します。室温で10, 000倍G以上で最低10分間ローター遠心分離機でバイアルの配向に注目して白色タンパク質ペレットを観察する。ペレットを下に向けてバイアルを傾けます。バイアルの上端に沿ってピペットチップを置き、1ミリリットルのマイクロピペットチップで上清をゆっくりと均一な速度で除去します。約20マイクロリットルの溶剤を保持します。残留溶剤をヒュームフード内で乾燥させます。タンパク質を沈殿させる。使い捨てのろ過カートリッジを使用して、プラグを上部のろ過カートリッジに取り付けます。90マイクロリットルのタンパク質溶液10マイクロリットルの1モルアクア、塩化ナトリウム、400マイクロリットルのアセトンを混ぜ合わせます。ベンチトップで最低2分間インキュベートし、室温 G.At 2, 500倍で2分間ろ過カートリッジに取り付けられたプラグで調製したタンパク質サンプルを遠心分離し、カートリッジを裏返し、ネジを外してカートリッジベースからプラグを取り外します。ろ過カートリッジを清潔なバイアル遠心分離機に入れ、タンパク質サンプルを室温で500倍Gで3分間行います。下部バイアルから溶媒の流れを捨てます。ろ過カートリッジに400マイクロリットルのアセトンを加えてタンパク質ペレットを洗浄し、室温で500倍Gで3分間遠心分離するか、上部カートリッジに溶媒がなくなるまで遠心分離します。以前に実証されたタンパク質沈殿プロトコルに従います。タンパク質ペレットの再可溶化のための再可溶化プロトコルに進む直前に、2〜5マイクロリットルのISOプロパノールを膜に直接分注することにより、ろ過カートリッジの基部で膜を濡らしてタンパク質を再可溶化し、水中のギ酸の80体積体積溶液を調製する。この酸性溶液を摂氏マイナス20度で事前に冷却し、沈殿したタンパク質を含むろ過カートリッジを冷却します。50マイクロリットルの冷希釈ギ酸を冷やしたカートリッジキャップとボルテックスに30秒間分注します。ろ過カートリッジを摂氏マイナス20度で10分間冷凍庫に戻します。前の渦とインキュベーションのステップを繰り返します。最終容量500マイクロリットルに450マイクロリットルの水を加えます。ギ酸を8%に希釈カートリッジを裏返し、ネジを外してカートリッジベースからプラグを取り外し、SPEカートリッジをバイアルに取り付けます。室温の遠心分離機でSPEカートリッジを通してタンパク質を800倍Gで5分間回転させます。 上部カートリッジに溶媒が残っている場合は、カートリッジを遠心分離機に戻し、スピンを繰り返します。300マイクロリットルの5%アセトニトリルと0.1%のTFAを水中でSPEカートリッジに加えてすすぎ、SPEカートリッジを2000倍Gで2分間流し、低分子量タンパク質または消化ペプチドを300マイクロリットル流してサンプルを溶出します。50%アセトニトリルと0.1%のTFAを2、500倍のG.Forで5分間インタクトタンパク質。300マイクロリットルの75%アセトニトリルと0.1%トリフルオロ禁欲酸を使用した追加の溶出ステップでフォローアップします。得られた2つの抽出物を結合します。この図は、使い捨てフィルターカートリッジ内のバイアルベースまたはタンパク質の沈殿後のSDS枯渇を比較しています。従来の迅速およびCMWプロトコルでアセトンを使用する。すべてのアプローチは、最適な質量分析を可能にするためにSDSを低減します。この図は、処理された酵母全細胞溶解物のSDSページ分析による急速なアセトン沈殿およびCMW沈殿による定量的タンパク質回収を示しています。すべての沈殿プロトコルで一貫した回収率が得られました。使い捨てろ過カートリッジでの沈殿により、メンブレンフィルターの上に凝集タンパク質を保持しながら、上清を含むSDSを注意深くピペットでピペットで固定する必要がなくなります。したがって、3つの独立した反復にわたる上清画分に目に見えるバンドは検出されませんでした。カートリッジベースのタンパク質沈殿は、バイアルベースの沈殿と比較して、ウシ血漿のペプシン消化サンプルの優れた回収率を示します。塩化ナトリウムを使用し、亜鉛溶媒を使用した場合、カートリッジには収率のより有意な違いが認められ、最高の収率が得られました。この図は、使い捨てフィルターカートリッジで処理されたサンプルのより高いペプチド存在量を反映する1を超える比率で、各ペプチドサンプルからのペプチドピーク強度を定量化します。この図は、3つの反復サンプル調製物間でタンパク質あたりの同定されたペプチドの数を比較しています。これらのグラフの0.94〜0.95の相関係数は、ボトムアップ質量分析のためのサンプル調製アプローチの高い一貫性を示しています。したがって、そのペレットが形成されたら、それを邪魔することを避けたいのです。無傷のペレットとして保管すると、歩留まりが向上します。したがって、そのペレットを余分なアセトンで洗うことを忘れないでください。これにより、サンプルを可能な限りクリーンに保つSDSを取り除き、最高の質量分析が可能になります。そのため、サンプルをピペットで固定するよりも、反転させて余分な溶媒を除去する方がはるかに簡単であることがわかりました。このようにして、より一貫した歩留まりが得られます。室温でアセトン沈殿を行うと、冷凍庫での従来の沈殿よりも一貫性があり、迅速な回収が得られました。

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