Name: organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00
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Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá. Los autores agradecen a Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canadá) y SPARC BioCentre (Análisis Molecular) en el Hospital para Niños Enfermos (Toronto, Canadá) por sus contribuciones a la adquisición de datos de EM.

1. Consideraciones materiales y preparación previa de la muestra
<ol><li>Use solo solventes de alta pureza (acetona, cloroformo, metanol) (>99.5%) y productos químicos, libres de exceso de humedad.</li>
	<li>Preparar soluciones de cloruro de sodio y sulfato de zinc (1 M) en agua. NOTA: Las soluciones salinas se pueden almacenar indefinidamente a temperatura ambiente, siempre y cuando estén libres de contaminantes o crecimiento microbiano.</li>
	<li>Utilice el vial de microcentrífuga de polipropi...

La caracterización óptima de la EM se logra cuando la SDS residual se agota por debajo de 10 ppm. Mientras que los enfoques alternativos, como el FASP y la digestión en perlas, ofrecen un agotamiento cuantitativo de SDS con recuperación variable 31,32,33, el objetivo principal de la precipitación es maximizar la pureza y el rendimiento simultáneamente. Esto depende de aislar efectivamente el sobrenadante (que contiene el S...

El análisis del proteoma por espectrometría de masas se ha vuelto cada vez más riguroso, debido a la mayor sensibilidad, resolución, velocidad de escaneo y versatilidad de los instrumentos modernos de MS. Los avances de la EM contribuyen a una mayor eficiencia de identificación de proteínas y a una cuantificación más precisa 1,2,3,4,5. Con una instrumentación mejorada de em, los investigadores exigen una estrategia de preparación de muestras front-end correspondientemente consistente capaz de recuperar cuantitativamente proteínas de alta pureza en un tiempo mínimo en todas las etapas del flujo de trabajo 6,7,8,9,10,11 . Para reflejar con precisión el estado del proteoma de un sistema biológico, las proteínas deben aislarse de la matriz de muestra nativa de manera eficiente e imparcial. Con este fin, la inclusión de un surfactante desnaturalizante, como el dodecil sulfato de sodio (SDS), garantiza una extracción y solubilización eficientes de proteínas12. Sin embargo, SDS interfiere fuertemente con la ionización por electropulverización, causando una severa supresión de la señal de EM si no se elimina adecuadamente13.
Existen varias estrategias de agotamiento de SDS para el posterior análisis del proteoma, como la retención de proteínas por encima de un filtro de corte de peso molecular contenido en cartuchos de espín desechables 14,15,16. El método de preparación de muestras asistido por filtro (FASP) se ve favorecido ya que agota efectivamente el SDS por debajo de 10 ppm, lo que facilita una EM óptima. Sin embargo, la recuperación de proteínas con FASP es variable, lo que impulsó la exploración de otras técnicas. Los enfoques cromatográficos que capturan selectivamente proteínas (o surfactantes) han evolucionado en varios cartuchos convenientes o formatos basados en cuentas 17,18,19,20,21. Dadas estas estrategias simples y (idealmente) consistentes para la purificación de proteínas, el enfoque clásico de la precipitación de proteínas con solventes orgánicos a menudo se pasa por alto como un enfoque prometedor para el aislamiento de proteínas. Si bien se ha demostrado que la precipitación con disolvente agota la SDS por debajo de los niveles críticos con éxito, la recuperación de proteínas ha sido una preocupación de larga data de este enfoque. Múltiples grupos han observado un sesgo de recuperación de proteínas, con rendimientos de precipitación inaceptablemente bajos en función de la concentración de proteínas, el peso molecular y la hidrofobicidad22,23. Debido a la diversidad de protocolos de precipitación reportados en la literatura, se desarrollaron condiciones de precipitación estandarizadas. En 2013, Crowell et al. informaron por primera vez la dependencia de la fuerza iónica en la eficiencia de precipitación de las proteínas en el 80% de acetona24. Para todas las proteínas examinadas, se demostró que la adición de cloruro de sodio de hasta 30 mM era esencial para maximizar los rendimientos (hasta un 100% de recuperación). Más recientemente, Nickerson et al. demostraron que la combinación de una fuerza iónica aún mayor (hasta 100 mM) con una temperatura elevada (20 ° C) durante la precipitación de acetona dio una recuperación casi cuantitativa en 2-5 min25. Se observó una ligera caída en la recuperación de proteínas de bajo peso molecular (LMW). Por lo tanto, un informe posterior de Baghalabadi et al. demostró la recuperación exitosa de proteínas y péptidos LMW (≤5 kDa) mediante la combinación de sales específicas, particularmente sulfato de zinc, con un mayor nivel de disolvente orgánico (97% acetona)26.
Si bien refinar el protocolo de precipitación brinda una estrategia de purificación de proteínas más confiable para la proteómica basada en la EM, el éxito de la precipitación convencional depende en gran medida de la técnica del usuario. Un objetivo principal de este trabajo es presentar una estrategia de precipitación robusta que facilite el aislamiento del pellet de proteína del sobrenadante contaminante. Se desarrolló un cartucho de filtración desechable para eliminar el pipeteo aislando la proteína agregada sobre un filtro de membrana de PTFE poroso27. Los componentes que interfieren con la EM en el sobrenadante se eliminan eficazmente en un paso de centrifugación corto y de baja velocidad. El cartucho de filtro desechable también ofrece un cartucho SPE intercambiable, que facilita la limpieza posterior de la muestra después de la resolubilización y la digestión opcional de proteínas, antes de la espectrometría de masas.
Aquí se presentan una serie de flujos de trabajo de precipitación de proteoma recomendados, incluidos los protocolos modificados de acetona y cloroformo / metanol / agua28 , en un formato convencional (basado en viales) y semiautomatizado en un cartucho desechable de filtración y extracción de dos estados. Se destacan las recuperaciones de proteínas resultantes y las eficiencias de agotamiento de SDS, junto con la cobertura de proteoma LC-MS/MS de abajo hacia arriba, para demostrar el resultado esperado de cada protocolo. Se discuten los beneficios prácticos y los inconvenientes asociados con cada enfoque.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >AC177170010</td>
			<td >&#8804;0.002 % aldehyde</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetonitrile</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A998-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ammonium Bicarbonate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>A6141-1KG</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta mercaptoethanol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bromophenol blue</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td >Bromophenol blue sodium salt</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >C298-400</td>
			<td >Chloroform</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formic Acid</td>
			<td >Honeywell</td>
			<td >56302</td>
			<td >Eluent additive for LC-MS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of standard protein mixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycerol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >356352-1L-M</td>
			<td >For molecular biology, &#62; 99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A4641</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A452SK-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >75-400-102</td>
			<td >up to 21,000 xg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >05-408-130</td>
			<td >tapered bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (2 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >02-681-321</td>
			<td >rounded bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (0.1-10 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >21-197-28</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (1-200 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-302</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (200-1000 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-303</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >13-710-903</td>
			<td >Micropipet Trio pack</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pepsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>P0525000</td>
			<td >Lyophilized powder,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#62;3200 units/ mg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProTrap XG</td>
			<td >Proteoform Scientific</td>
			<td >PXG-0002</td>
			<td >50 complete units per box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >S9888-1KG</td>
			<td >ACS reagent, &#62;99 %</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >28312</td>
			<td >powdered solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >timsTOF Pro Mass Spectrometer</td>
			<td >Bruker</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of liver proteome extract</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trifluoroacetic Acid</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >L06374.AP</td>
			<td >99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP152-500</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >9002-07-7</td>
			<td >From bovine pancreas, TPCK-treated</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Urea</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1610731</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water (deionized)</td>
			<td>Sartorius Arium Mini Water Purification System</td>
			<td>76307-662</td>
			<td >Type 1 ultrapure (18.2 M&#937; cm)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zinc Sulfate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>307491-100G</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry

Si bien los múltiples avances en los instrumentos de espectrometría de masas (EM) han mejorado el análisis cualitativo y cuantitativo del proteoma, los enfoques frontales más confiables para aislar, enriquecer y procesar proteínas antes de la EM son críticos para una caracterización exitosa del proteoma. La recuperación de proteínas baja e inconsistente y las impurezas residuales como los surfactantes son perjudiciales para el análisis de la EM. La precipitación de proteínas a menudo se considera poco confiable, requiere mucho tiempo y técnicamente es difícil de realizar en comparación con otras estrategias de preparación de muestras. Estas preocupaciones se superan mediante el empleo de protocolos óptimos de precipitación de proteínas. Para la precipitación de acetona, la combinación de sales específicas, el control de la temperatura, la composición del disolvente y el tiempo de precipitación es crítica, mientras que la eficiencia de la precipitación de cloroformo / metanol / agua depende del pipeteo adecuado y la manipulación del vial. Alternativamente, estos protocolos de precipitación están optimizados y semiautomatizados dentro de un cartucho de centrifugado desechable. Los resultados esperados de la precipitación de proteínas a base de solvente en el formato convencional y el uso de un cartucho desechable de filtración y extracción de dos etapas se ilustran en este trabajo. Esto incluye la caracterización detallada de mezclas proteómicas mediante análisis LC-MS/MS de abajo hacia arriba. El rendimiento superior de los flujos de trabajo basados en SDS también se demuestra en relación con las proteínas no contaminadas.

La Figura 4 resume el agotamiento esperado de SDS después de la precipitación de proteínas a base de vial o facilitada por cartucho en un cartucho de filtro desechable utilizando acetona. La incubación nocturna convencional (-20 °C) en acetona se compara con el protocolo de precipitación rápida de acetona a temperatura ambiente (paso 2), así como con la precipitación CMW (paso 4). La SDS residual se cuantificó mediante el ensayo de sustancias activas de azul de metileno (MBAS)<sup ...

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Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

El presente protocolo describe la precipitación de proteínas a base de disolventes en condiciones controladas para una recuperación y purificación robustas y rápidas de muestras de proteoma antes de la espectrometría de masas.

Precipitación de proteínas a base de disolventes orgánicos para una purificación robusta del proteoma antes de la espectrometría de masas

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Estos protocolos están diseñados para maximizar la recuperación y la pureza de las proteínas a través de la precipitación a base de solventes. Vamos a mostrarte un par de trucos para realizar la precipitación en viales, así como un enfoque semiautomático en formato de cartucho de centrifugado. También hemos optimizado el protocolo de precipitación para que sea consistente y rápido.Todo el protocolo solo toma unos minutos. Estos protocolos demuestran que la precipitación con disolventes de proteínas es ideal para la preparación de muestras antes de la espectrometría de masas. Los protocolos encajarán perfectamente en los flujos de trabajo profesionales de abajo hacia arriba y de arriba hacia abajo.Demostrando para nosotros hoy estarán Ziheng Dang y Victoria Miller, científica principal de Proteoform Scientific en Halifax, Nueva Escocia Pipetear 90 microlitros de solución de proteína libre de partículas en un tubo de microcentrífuga de polipropileno. Luego agregue 10 microlitros de un mol de cloruro de sodio acuoso y 400 microlitros de acetona en la solución de muestra, tapa y golpee suavemente el vial para combinar los solventes. Deje que el vial lo incube.Temperatura ambiente inalterada durante un mínimo de dos minutos después de la incubación, centrifugar las muestras observando la orientación del vial y girar durante un mínimo de dos minutos a 10, 000 RCF o más a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, se observa una bolita blanca visible en el fondo del tubo. En este punto, destapa el tubo y decanta el sobrenado en un contenedor de residuos invirtiendo el tubo.Use una toalla de papel para extraer cualquier solvente residual del vial. Para SDS que contienen muestras. Dispense cuidadosamente 400 microlitros de acetona fresca sin alterar el pellet.Inmediatamente centrar la muestra durante un minuto a 10, 000 veces G o más a temperatura ambiente colocando el vial en el rotor en la misma orientación que el giro inicial. Calcule el disolvente de lavado como se describió anteriormente. Seque la muestra con la tapa abierta durante aproximadamente un minuto.En una campana extractora, antes de una solubilización de pellets. Dispense 100 microlitros de la solución de proteína en un vial de polipropileno. En la campana extractora, agregue 400 microlitros de metanol seguido de 100 microlitros de cloroformo.Tapa el vial y el vórtice brevemente para mezclar. Dispense rápidamente 300 microlitros de agua directamente en el centro del vial. Tapar el vial y dejarlo reposar en la mesa de trabajo sin ser molestado durante un minuto, después de colocar el vial de polipropileno en una centrífuga y girarlo durante cinco minutos a 10, 000 veces G o más a temperatura ambiente.Se observa que el vial tiene dos capas de disolvente y un pellet blanco visible hasta que el vial esté a aproximadamente 45 grados. Retire aproximadamente 700 microlitros del disolvente de la capa superior a una velocidad uniforme utilizando una punta de micropipeta grande de un mililitro inicialmente y más tarde con una punta de pipeta de 200 microlitros hasta que forme una perla en el vial. Agregue 400 microlitros de metanol fresco al vial de muestra sin alterar el pellet dispensando el disolvente por el costado del vial.Tapa el vial y combina las capas de disolvente balanceando suavemente el vial para agitar los disolventes juntos. Para observar el pellet de proteína blanca observando la orientación del vial en la centrífuga del rotor durante un mínimo de 10 minutos a 10, 000 veces G o más a temperatura ambiente. Incline el vial con el pellet hacia abajo.Coloque una punta de pipeta a lo largo del borde superior del vial y retire el sobrenadante con una punta de micropipeta de un mililitro a una velocidad lenta pero uniforme. Reteniendo aproximadamente 20 microlitros de disolvente. Deje que el disolvente residual se seque en la campana extractora.Para precipitar la proteína. Con un cartucho de filtración desechable, fije el tapón al cartucho de filtración superior. Combine 90 microlitros de solución de proteína 10 microlitros de un mol aquas, cloruro de sodio y 400 microlitros de acetona.Incubar durante un mínimo de dos minutos en la mesa de sobremesa, centrifugar la muestra de proteína preparada con el tapón todavía conectado al cartucho de filtración durante dos minutos a 2, 500 veces G.At temperatura ambiente, invertir el cartucho y desenroscar y retirar el tapón de la base del cartucho. Coloque el cartucho de filtración en un vial limpio centrifugar la muestra de proteína durante tres minutos a 500 veces G a temperatura ambiente. Deseche el flujo a través del disolvente del vial inferior.Lave el pellet de proteína agregando 400 microlitros de acetona al cartucho de filtración, centrifugar durante tres minutos a 500 veces G a temperatura ambiente o hasta que no quede disolvente en el cartucho superior. Siguiendo los protocolos de precipitación de proteínas previamente demostrados. Resolubilizar la proteína humedeciendo la membrana en la base del cartucho de filtración dispensando de dos a cinco microlitros de ISO propanol directamente a la membrana inmediatamente antes de proceder al protocolo de resolubilización para la resolubilización del pellet de proteína preparar 80% volumen por volumen solución de ácido fórmico en agua.Pre enfríe esta solución ácida a menos 20 grados centígrados y el cartucho de filtración que contiene proteína precipitada. Dispense 50 microlitros de ácido fórmico diluido en frío en la tapa del cartucho refrigerado y el vórtice durante 30 segundos. Devuelva el cartucho de filtración al congelador a menos 20 grados centígrados durante 10 minutos.Repita los pasos anteriores de vórtice e incubación. Agregue 450 microlitros de agua a un volumen final de 500 microlitros. Diluir el ácido fórmico al 8%Invierta el cartucho, desenrosque y retire el tapón de la base del cartucho y conecte el cartucho SPE al vial.Girar la proteína a través del cartucho SPE en una centrífuga a temperatura ambiente durante cinco minutos a 800 veces G.Si queda disolvente en el cartucho superior, devuelva el cartucho a la centrífuga y repita el centrifugado. Enjuague agregando 300 microlitros de 5% de acetonitrilo con 0.1% de TFA en agua al cartucho SPE, fluya a través del cartucho SPE durante dos minutos a 2000 veces G. Para proteínas de bajo peso molecular o péptidos digeridos eluya la muestra fluyendo 300 microlitros. Un 50% de acetonitrilo con 0,1% de TFA durante cinco minutos a 2, 500 veces G. Para proteínas intactas.Siga con un paso de elusion adicional utilizando 300 microlitros de acetonitrilo al 75% con ácido ascético trifluoro al 0,1%. Combine los dos extractos resultantes. La figura compara el agotamiento de SDS después de la precipitación de proteínas en un cartucho de filtro desechable.Uso de acetona con los protocolos convencionales rápidos y CMW. Todos los enfoques reducen la SDS para permitir un análisis óptimo de espectrometría de masas. Esta figura muestra la recuperación cuantitativa de proteínas siguiendo la precipitación rápida de acetona y la precipitación de CMW a través del análisis de la página SDS de un lisado celular total de levadura procesada.Se obtuvo una recuperación consistente con todos los protocolos de precipitación. La precipitación en un cartucho de filtración desechable elimina la necesidad de pipetear cuidadosamente SDS que contiene sobrenadante mientras se retienen las proteínas agregadas por encima de un filtro de membrana. Por lo tanto, no se detectaron bandas visibles en las fracciones sobrenadantes en tres réplicas independientes.La precipitación de proteínas basada en cartuchos demuestra una recuperación superior de una muestra digerida de pepsina de plasma bovino en relación con la precipitación basada en viales. Se observan diferencias más significativas en el rendimiento en el cartucho cuando se emplea cloruro de sodio, mientras que el empleo de disolvente de zinc da como resultado el mayor rendimiento. Esta figura cuantifica la intensidad máxima del péptido de cada muestra de péptido con una proporción superior a uno que refleja una mayor abundancia de péptidos para las muestras procesadas en los cartuchos de filtro desechables.La figura compara el número de péptidos identificados por proteína en las tres preparaciones de muestra replicadas. Los coeficientes de correlación de 0,94 a 0,95 en estos gráficos demuestran la alta consistencia del enfoque de preparación de muestras para el análisis de espectrometría de masas ascendente. Entonces, una vez que se forma ese pellet, realmente quieres evitar molestarlo.Si lo mantienes como un pellet intacto, obtendrás un mayor rendimiento. Así que asegúrate de no olvidar lavar ese pellet con acetona extra. Esto es asegurarnos de que nos estamos deshaciendo de la SDS manteniendo nuestra muestra lo más limpia posible y eso nos da el mejor análisis de espectrometría de masas.Así que descubrimos que eliminar el exceso de disolvente invirtiendo el es mucho más simple que tratar de pipetear la muestra. Obtendrá rendimientos más consistentes de esta manera. La realización de la precipitación de acetona a temperatura ambiente resultó en una recuperación más consistente y rápida que la precipitación tradicional en el congelador.

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