Name: organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry at JoVE.com

Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, MS verilerinin elde edilmesine katkılarından dolayı Hasta Çocuklar Hastanesi'ndeki (Toronto, Kanada) Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Kanada) ve SPARC BioCentre'a (Moleküler Analiz) teşekkür eder.

1. Malzeme hususları ve numune ön hazırlığı
<ol><li>Sadece yüksek saflıkta çözücüler (aseton, kloroform, metanol) (>% 99,5) ve aşırı nem içermeyen kimyasallar kullanın.</li>
	<li>Suda sodyum klorür ve çinko sülfat çözeltileri (1 M) hazırlayın. NOT: Tuz çözeltileri, kirletici madde veya mikrobiyal büyüme içermedikleri sürece oda sıcaklığında süresiz olarak saklanabilir.</li>
	<li>Yağışı indüklemek için gerekli numune hacmini ve çözücüleri korumak için yet...

Optimal MS karakterizasyonu, artık SDS 10 ppm'nin altında tükendiğinde elde edilir. FASP ve boncuk üzerinde sindirim gibi alternatif yaklaşımlar, değişken geri kazanım31,32,33 ile kantitatif SDS tükenmesi sunarken, yağışın birincil amacı saflığı ve verimi aynı anda en üst düzeye çıkarmaktır. Bu, protein peletini rahatsız etmeden süpernatantın (SDS içeren) etkili bir şekilde izole edilmesine bağlıd...

Kütle spektrometresi ile proteom analizi, modern MS cihazlarının gelişmiş hassasiyeti, çözünürlüğü, tarama hızı ve çok yönlülüğü nedeniyle giderek daha titiz hale gelmiştir. MS ilerlemeleri, daha fazla protein tanımlama verimliliğine ve daha hassas kantitasyona katkıda bulunur 1,2,3,4,5. Geliştirilmiş MS enstrümantasyonu ile araştırmacılar, iş akışının tüm aşamalarında minimum sürede yüksek saflıkta proteinlerin kantitatif geri kazanımını sağlayabilen, buna karşılık gelen tutarlı bir ön uç numune hazırlama stratejisi talep etmektedirler 6,7,8,9,10,11 . Biyolojik bir sistemin proteom durumunu doğru bir şekilde yansıtmak için, proteinler doğal numune matrisinden verimli ve tarafsız bir şekilde izole edilmelidir. Bu amaçla, sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi denatüre edici bir yüzey aktif madde de dahil olmak üzere, etkili protein ekstraksiyonu ve çözündürme sağlar12. Bununla birlikte, SDS, elektrosprey iyonizasyonuna güçlü bir şekilde müdahale eder ve uygun şekilde elimine edilmezse ciddi MS sinyal bastırmasına neden olur13.
Sonraki proteom analizi için, proteinlerin tek kullanımlık spin kartuşları14,15,16'da bulunan moleküler ağırlık kesme filtresinin üzerinde tutulması gibi çeşitli SDS tükenme stratejileri mevcuttur. Filtre destekli numune hazırlama yöntemi (FASP), SDS'yi 10 ppm'nin altında etkili bir şekilde tükettiği ve optimal MS'yi kolaylaştırdığı için tercih edilir. Bununla birlikte, FASP ile protein geri kazanımı değişkendir ve bu da diğer tekniklerin araştırılmasına neden olmuştur. Proteini (veya yüzey aktif maddeyi) seçici olarak yakalayan kromatografik yaklaşımlar, çeşitli uygun kartuşlara veya boncuk bazlı formatlara dönüşmüştür 17,18,19,20,21. Protein saflaştırmaya yönelik bu basit ve (ideal olarak) tutarlı stratejiler göz önüne alındığında, organik çözücülerle protein çökeltmesinin klasik yaklaşımı genellikle protein izolasyonuna umut verici bir yaklaşım olarak göz ardı edilir. Solvent çökeltmesinin SDS'yi kritik seviyelerin altına başarıyla tükettiği gösterilmiş olsa da, protein geri kazanımı bu yaklaşımın uzun süredir devam eden bir endişesi olmuştur. Birden fazla grup, protein konsantrasyonunun, moleküler ağırlığın ve hidrofobikliğin bir fonksiyonu olarak kabul edilemez derecede düşük yağış verimi ile bir protein geri kazanım önyargısı gözlemlemiştir22,23. Literatürde bildirilen yağış protokollerinin çeşitliliği nedeniyle standartlaştırılmış yağış koşulları geliştirilmiştir. 2013 yılında, Crowell ve ark. ilk olarak% 80 aseton24'teki proteinlerin çökeltme verimliliğine iyonik mukavemetin bağımlılığını bildirmiştir. İncelenen tüm proteinler için, 30 mM'ye kadar sodyum klorür ilavesinin, verimi en üst düzeye çıkarmak için gerekli olduğu gösterilmiştir (% 100'e kadar geri kazanım). Daha yakın zamanlarda, Nickerson ve ark., aseton yağışı sırasında daha yüksek iyonik mukavemetin (100 mM'ye kadar) yüksek sıcaklık (20 ° C) ile kombinasyonunun 2-5 dakika25'te neredeyse kantitatif iyileşme sağladığını göstermiştir. Düşük moleküler ağırlıklı (LMW) proteinlerin geri kazanımında hafif bir düşüş gözlendi. Bu nedenle, Baghalabadi ve ark. tarafından hazırlanan bir sonraki rapor, spesifik tuzları, özellikle çinko sülfatı, daha yüksek bir organik çözücü (% 97 aseton) ile birleştirerek LMW proteinlerinin ve peptitlerinin (≤5 kDa) başarılı bir şekilde geri kazanıldığını göstermiştir26.
Yağış protokolünün rafine edilmesi, MS bazlı proteomikler için daha güvenilir bir protein saflaştırma stratejisi sunarken, geleneksel çökeltmenin başarısı büyük ölçüde kullanıcı tekniğine dayanmaktadır. Bu çalışmanın birincil amacı, protein peletinin kirletici süpernatandan izolasyonunu kolaylaştıran sağlam bir çökeltme stratejisi sunmaktır. Gözenekli PTFE membran filtresi27 üzerinde agrega proteini izole ederek pipetlemeyi ortadan kaldırmak için tek kullanımlık bir filtreleme kartuşu geliştirilmiştir. Süpernatanttaki MS müdahale eden bileşenler, kısa, düşük hızlı bir santrifüjleme adımında etkili bir şekilde çıkarılır. Tek kullanımlık filtre kartuşu ayrıca, kütle spektrometrisinden önce, çözündürme ve isteğe bağlı protein sindiriminin ardından numunenin temizlenmesini kolaylaştıran değiştirilebilir bir SPE kartuşu sunar.
Modifiye aseton ve kloroform/metanol/su28 protokolleri de dahil olmak üzere bir dizi önerilen proteom çökeltme iş akışı, geleneksel (şişe bazlı) ve tek kullanımlık iki durumlu filtreleme ve ekstraksiyon kartuşunda yarı otomatik bir formatta sunulmaktadır. Elde edilen protein geri kazanımları ve SDS tükenme verimlilikleri, her protokolden beklenen sonucu göstermek için aşağıdan yukarıya LC-MS / MS proteom kapsamı ile birlikte vurgulanır. Her yaklaşımla ilişkili pratik faydalar ve dezavantajlar tartışılmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >AC177170010</td>
			<td >&#8804;0.002 % aldehyde</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetonitrile</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A998-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ammonium Bicarbonate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>A6141-1KG</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta mercaptoethanol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bromophenol blue</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td >Bromophenol blue sodium salt</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >C298-400</td>
			<td >Chloroform</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formic Acid</td>
			<td >Honeywell</td>
			<td >56302</td>
			<td >Eluent additive for LC-MS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of standard protein mixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycerol</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >356352-1L-M</td>
			<td >For molecular biology, &#62; 99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A4641</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A452SK-4</td>
			<td >HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >75-400-102</td>
			<td >up to 21,000 xg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >05-408-130</td>
			<td >tapered bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge Tube&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (2 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >02-681-321</td>
			<td >rounded bottom</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (0.1-10 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >21-197-28</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (1-200 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-302</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Tips&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (200-1000 &#956;L)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >07-200-303</td>
			<td >Universal pipet tip, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >13-710-903</td>
			<td >Micropipet Trio pack</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pepsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>P0525000</td>
			<td >Lyophilized powder,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#62;3200 units/ mg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ProTrap XG</td>
			<td >Proteoform Scientific</td>
			<td >PXG-0002</td>
			<td >50 complete units per box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >S9888-1KG</td>
			<td >ACS reagent, &#62;99 %</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >28312</td>
			<td >powdered solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >timsTOF Pro Mass Spectrometer</td>
			<td >Bruker</td>
			<td ></td>
			<td >for analysis of liver proteome extract</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trifluoroacetic Acid</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >L06374.AP</td>
			<td >99%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP152-500</td>
			<td >Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td >9002-07-7</td>
			<td >From bovine pancreas, TPCK-treated</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Urea</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1610731</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water (deionized)</td>
			<td>Sartorius Arium Mini Water Purification System</td>
			<td>76307-662</td>
			<td >Type 1 ultrapure (18.2 M&#937; cm)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zinc Sulfate</td>
			<td >Millipore Sigma</td>
			<td>307491-100G</td>
			<td >solid</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry

Kütle spektrometresi (MS) cihazlarındaki çoklu ilerlemeler kalitatif ve kantitatif proteom analizini geliştirmiş olsa da, MS'ten önce proteinleri izole etmek, zenginleştirmek ve işlemek için daha güvenilir ön uç yaklaşımları başarılı proteom karakterizasyonu için kritik öneme sahiptir. Düşük, tutarsız protein geri kazanımı ve yüzey aktif maddeler gibi artık safsızlıklar MS analizine zararlıdır. Protein çökeltmesi genellikle diğer numune hazırlama stratejilerine kıyasla güvenilmez, zaman alıcı ve teknik olarak gerçekleştirilmesi zor olarak kabul edilir. Bu endişeler, optimal protein çökeltme protokolleri kullanılarak aşılır. Aseton çökeltmesi için, spesifik tuzların, sıcaklık kontrolünün, çözücü bileşiminin ve çökeltme süresinin kombinasyonu kritik öneme sahipken, kloroform/metanolün/su çökeltmesinin verimliliği uygun pipetleme ve şişe manipülasyonuna bağlıdır. Alternatif olarak, bu çökeltme protokolleri tek kullanımlık bir spin kartuşu içinde kolaylaştırılmış ve yarı otomatiktir. Geleneksel formatta ve tek kullanımlık, iki aşamalı bir filtreleme ve ekstraksiyon kartuşu kullanılarak solvent bazlı protein çökeltmesinin beklenen sonuçları bu çalışmada gösterilmiştir. Bu, proteomik karışımların aşağıdan yukarıya LC-MS / MS analizi ile ayrıntılı karakterizasyonunu içerir. SDS tabanlı iş akışlarının üstün performansı, kontamine olmayan proteinlere göre de gösterilmiştir.

Şekil 4 , proteinlerin aseton kullanılarak tek kullanımlık bir filtre kartuşunda şişe bazlı veya kartuş tarafından kolaylaştırılmış çökeltilmesini takiben beklenen SDS tükenmesini özetlemektedir. Aseton cinsinden geleneksel gece inkübasyonu (-20 ° C), oda sıcaklığında (adım 2) hızlı aseton çökeltme protokolü ve CMW çökeltmesi (adım 4) ile karşılaştırılır. Kalıntı SDS, metilen mavisi aktif maddeler (MBAS) testi29 ile ölçülm?...

Watch this Scientific Journal Video about Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry at JoVE.com

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

Mevcut protokol, kütle spektrometrisinden önce proteom numunelerinin sağlam ve hızlı geri kazanımı ve saflaştırılması için kontrollü koşullar altında çözücü bazlı protein çökeltmesini açıklamaktadır.

Kütle Spektrometrisinden Önce Sağlam Proteom Saflaştırması için Organik Solvent Bazlı Protein Yağışı

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Bu protokoller, solvent bazlı çökeltme yoluyla proteinlerin geri kazanımını ve saflığını en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır. Size şişelerde yağış yapmak için birkaç püf noktası ve ayrıca bir spin kartuşu formatında yarı otomatik bir yaklaşım göstereceğiz. Ayrıca yağış protokolünü tutarlı ve hızlı olacak şekilde optimize ettik.Tüm protokol sadece birkaç dakika sürer. Bu protokoller, proteinlerin çözücü çökeltilmesinin, kütle spektrometrisinden önce numune hazırlığı için ideal olduğunu göstermektedir. Protokoller, yukarıdan yukarıya ve yukarıdan aşağıya profesyonel iş akışlarına sorunsuz bir şekilde uyacaktır.Bugün bizim için gösterecek olan Ziheng Dang ve Victoria Miller, Halifax'taki Proteoform Scientific'te Kıdemli Bilim Adamı, Nova Scotia Pipet 90 mikrolitre partikülsüz protein çözeltisini bir polipropilen mikro santrifüj tüpüne dönüştürecek. Daha sonra numune çözeltisine 10 mikrolitre bir mol sulu sodyum klorür ve 400 mikrolitre aseton ekleyin, çözücüleri birleştirmek için şişeyi yavaşça kapatın ve dokunun. Şişenin kuluçkaya yatmasına izin verin.Kuluçkadan sonra oda sıcaklığı en az iki dakika boyunca bozulmadan, şişenin yönünü belirten numuneleri santrifüj edin ve oda sıcaklığında 10.000 RCF veya daha yüksek bir sıcaklıkta en az iki dakika boyunca döndürün. Santrifüjlemeden sonra, tüpün dibinde görünür beyaz bir pelet gözlenir. Bu noktada, tüpün kapağını açın ve tüpü ters çevirerek süpernatı bir atık kabına boşaltın.Şişeden kalan çözücüyü çekmek için bir kağıt havlu kullanın. SDS içeren numuneler için. Peleti rahatsız etmeden 400 mikrolitre taze aseton dağıtın.Numuneyi oda sıcaklığında 10.000 kez G veya daha yüksek bir sıcaklıkta bir dakika boyunca derhal merkezleyin ve şişeyi rotora ilk spinle aynı yönde yerleştirin. Yıkama çözücüsünü daha önce açıklandığı gibi sayın. Numuneyi kapak açıkken yaklaşık bir dakika kurulayın.Bir duman davlumbazında, bir pelet çözünürlüğünden önce. Protein çözeltisinin 100 mikrolitresini bir polipropilen şişeye dağıtın. Duman davlumbazında, 400 mikrolitre metanol ve ardından 100 mikrolitre kloroform ekleyin.Şişeyi ve girdabı karıştırmak için kısaca kapatın. 300 mikrolitre suyu doğrudan şişenin merkezine hızlı bir şekilde dağıtın. Şişeyi kapatın ve polipropilen şişeyi bir santrifüje yerleştirdikten sonra bir dakika boyunca rahatsız edilmeden tezgahın üstüne oturmasına izin verin ve oda sıcaklığında 10.000 kat G veya daha yüksek bir sıcaklıkta beş dakika boyunca döndürün.Flakonun, şişeye kadar yaklaşık 45 derecede iki çözücü tabakasına ve görünür beyaz bir pelet olduğu gözlenmiştir. Başlangıçta ve daha sonra şişede bir boncuk oluşturana kadar 200 mikrolitrelik bir pipet ucu ile bir mililitrelik büyük bir mikro pipet ucu kullanarak çözücüyü üst tabakadan eşit bir oranda çıkarın. Çözücüyü şişenin kenarından aşağı dağıtarak peleti rahatsız etmeden numune şişesine 400 mikrolitre taze metanol ekleyin.Şişeyi kapatın ve çözücüleri bir araya getirmek için şişeyi hafifçe sallayarak çözücü katmanlarını birleştirin. Rotor santrifüjündeki şişenin yönünü not eden beyaz protein peletini oda sıcaklığında 10.000 kez G veya daha yüksek bir sıcaklıkta en az 10 dakika boyunca gözlemlemek. Şişeyi pelet aşağı bakacak şekilde açın.Şişenin üst kenarı boyunca bir pipet ucu yerleştirin ve süpernatantı bir mililitrelik mikro pipet ucuyla yavaş ama eşit bir hızda çıkarın. Yaklaşık 20 mikrolitre çözücü tutar. Artık çözücünün duman davlumbazında kurumasına izin verin.Proteini çökeltmek için. Tek kullanımlık bir filtreleme kartuşu kullanarak fişi üst filtreleme kartuşuna takın. 90 mikrolitre protein çözeltisini 10 mikrolitre bir mol aquas, sodyum klorür ve 400 mikrolitre aseton birleştirin.Tezgah üstünde en az iki dakika inkübe edin, hazırlanan protein numunesini, oda sıcaklığının 2.500 katında iki dakika boyunca filtrasyon kartuşuna hala bağlı olan G.At santrifüj edin, kartuşu ters çevirin ve fişi kartuş tabanından sökün ve çıkarın. Filtrasyon kartuşunu temiz bir şişeye yerleştirin, protein numunesini oda sıcaklığında 500 kat G'de üç dakika boyunca santrifüj yapın. Çözücü yoluyla akışı alt şişeden atın.Protein peletini filtrasyon kartuşuna 400 mikrolitre aseton ekleyerek yıkayın, oda sıcaklığında 500 kat G'de veya üst kartuşta çözücü kalmayana kadar üç dakika boyunca santrifüj yapın. Daha önce gösterilen protein çökeltme protokollerini takiben. Protein peletinin yeniden çözündürülmesi için yeniden çözündürme protokolüne geçmeden hemen önce iki ila beş mikrolitre ISO propanolü, filtrasyon kartuşunun tabanındaki membranı ıslatarak proteini yeniden çözündürün, suda formik asidin hacimce çözeltisi olarak% 80 hacim hazırlayın.Bu asit çözeltisini eksi 20 santigrat derecede ve çökeltilmiş protein içeren filtrasyon kartuşunu önceden soğutun. 50 mikrolitre soğuk seyreltilmiş formik asidi soğutulmuş kartuş kapağına ve girdabına 30 saniye boyunca dağıtın. Filtreleme kartuşunu 10 dakika boyunca eksi 20 santigrat derecede dondurucuya geri koyun.Önceki vorteks ve inkübasyon adımlarını tekrarlayın. 500 mikrolitrelik son hacme 450 mikrolitre su ekleyin. Formik asidi %8'e kadar seyreltmek Kartuşun vidasını ters çevirin ve fişi kartuş tabanından çıkarın ve SPE kartuşunu şişeye takın.Proteini SPE kartuşundan oda sıcaklığında bir santrifüjde beş dakika boyunca 800 kez döndürün G.Üst kartuşta çözücü kalırsa, kartuşu santrifüje geri döndürün ve dönüşü tekrarlayın. SPE kartuşuna su içinde% 0.1 TFA ile% 300 mikrolitre% 5 asetonitril ekleyerek durulayın, SPE kartuşundan 2000 kez iki dakika boyunca akın G.Düşük moleküler ağırlıklı proteinler veya sindirilmiş peptitler için 300 mikrolitre akarak numuneyi süzün. Sağlam proteinler için 2.500 kez G.For beş dakika boyunca TFA'nın% 0.1'i ile% 50 asetonitril.% 0.1 Trifloro münzevi asit ile 300 mikrolitre% 75 asetonitril kullanarak ek bir elusion adımı ile takip edin. Elde edilen iki özü birleştirin. Şekil, tek kullanımlık bir filtre kartuşundaki proteinlerin şişe bazlı veya çökeltilmesini takiben SDS tükenmesini karşılaştırmaktadır.Geleneksel hızlı ve CMW protokolleri ile aseton kullanımı. Tüm yaklaşımlar, optimum kütle spektrometresi analizine izin vermek için SDS'yi azaltır. Bu şekil, işlenmiş bir maya toplam hücre lizatının SDS sayfa analizi yoluyla hızlı aseton çökeltmesini ve CMW çökelmesini izleyerek kantitatif protein geri kazanımını göstermektedir.Tüm yağış protokolleri ile tutarlı iyileşme sağlanmıştır. Tek kullanımlık bir filtrasyon kartuşundaki çöküntü, biriken proteinleri bir membran filtresinin üzerinde tutarken süpernatant içeren SDS'yi dikkatlice pipet etme ihtiyacını ortadan kaldırır. Böylece, üç bağımsız replikasyon boyunca süpernatant fraksiyonlarda görünür bantlar tespit edilmedi.Kartuş bazlı protein çökeltisi, Pepsin sindirilmiş sığır plazması örneğinin flakon bazlı çökelmeye göre üstün geri kazanımını gösterir. Kartuşta sodyum klorür kullanılırken verimdeki daha önemli farklılıklar görülürken, çinko çözücü kullanıldığında en yüksek verimle sonuçlanır. Bu şekil, her bir peptid örneğinden peptid tepe yoğunluğunu, tek kullanımlık filtre kartuşlarında işlenen numuneler için daha yüksek bir peptid bolluğunu yansıtan birin üzerinde bir oranla ölçer.Şekil, üç replikasyon numune preparatı boyunca protein başına tanımlanmış peptitlerin sayısını karşılaştırmaktadır. Bu grafiklerdeki 0,94 ila 0,95 arasındaki korelasyon katsayıları, aşağıdan yukarıya kütle spektrometresi analizi için numune hazırlama yaklaşımının yüksek tutarlılığını göstermektedir. Yani bu pelet bir kez oluştuğunda, onu rahatsız etmekten gerçekten kaçınmak istersiniz.Sağlam bir pelet olarak tutarsanız, daha yüksek bir verim elde edersiniz. Bu yüzden bu peleti ekstra asetonla yıkamayı unutmadığınızdan emin olun. Bu, numunemizi mümkün olduğunca temiz tutan SDS'den kurtulduğumuzdan emin olmamızı sağlıyor ve bu da bize en iyi kütle spektrometresi analizini veriyor.Bu nedenle, fazla çözücüyü ters çevirerek çıkarmanın, numuneyi pipetlemeye çalışmaktan çok daha basit olduğunu bulduk. Bu şekilde daha tutarlı verimler elde edersiniz. Oda sıcaklığında aseton çökeltme gerçekleştirmek, dondurucudaki geleneksel yağıştan daha tutarlı ve daha hızlı iyileşme ile sonuçlandı.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Complexometric Titration, Precipitation Titration, and Gravimetry

SCIENTISTS IN ACTION

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

Soğuk Giriş Sistemi ve Electron Impact Kütle Spektrometresi kullanarak Uçucu ve Oksidasyon Hassas Bileşiklerin Analizi

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Schlieren Fotoğraf Kullanımına Ortam kütle spektrometresi görselleştirme

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

Bir HS-MRM tahlil için Protein Biyofarmasötikler sıvı Kromatografi iyon hareketlilik QTOF kütle spektrometresi tarafından Host-hücre proteinleri miktar

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Fizzy Extraction of Volatile Organic Compounds Combined with Atmospheric Pressure Chemical Ionization Quadrupole Mass Spectrometry

Atmosferik Basınçlı Kimyasal İyonlaşma Kuvveti Kütle Spektrometresi ile Birleştirilen Uçucu Organik Bileşiklerin Özsu Çıkarma

Chemical analysis of volatile and semivolatile compounds dissolved in liquid samples can be challenging. The dissolved components need to be brought to ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

İkincil Nanoelectrospray iyonlaşma kullanarak gerçek zamanlı nefes analiz için yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Sentez ve kütle spektrometresi analizleri Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Protein mimarileri ve Protein-Ligand komplekslerinin bütünleştirici yapısal kütle spektrometresi tarafından analiz

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining as a Tool to Uncover Novel Natural Products

Yeni Doğal Ürünleri Ortaya Çıkarmak İçin Bir Araç Olarak Kütle Spektrometresi Güdümlü Genom Madenciliği

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Nanomalzemeler Tarafından Elde Edilen Protein ve Metabolit Koronanın Karakterizasyonu için Kılcal Elektroforez Kütle Spektrometresi Yaklaşımları

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...