La degenerazione maculare legata all'età è considerata una delle principali cause di perdita della vista centrale. La progressiva degenerazione e disfunzione dello strato RPE è un segno distintivo della prima forma di AMD. Nonostante i progressi nella terapia per le malattie della retina, lo sviluppo di una modalità di trattamento efficace rimane impegnativo.
Uno dei concetti di trattamento più promettenti è la sostituzione dell'RPE con cellule RPE in coltura in vitro di diversa origine. Gli RPE sono stati solitamente consegnati nello spazio sottoretinico sotto forma di sospensione cellulare, foglio cellulare autoportante o monostrato cellulare supportato da un vettore artificiale. Il principale vantaggio dei due metodi tardivi è che dopo l'impianto, le cellule si trovano in uno stato monostrato differenziato nello spazio sottoretinico.
Gli studi preclinici su animali condotti in vivo mirano a stabilire una procedura chirurgica riproducibile e sicura su un modello animale a occhio grande al fine di ottenere dati che potrebbero essere utili e potenzialmente applicabili nell'uomo. Con questo protocollo, ci proponiamo di riportare i principi della tecnica chirurgica sottoretinica utilizzata per l'impianto sottoretinico in vivo di un carrier cellulare in un modello animale di grandi dimensioni che potrebbe essere utilizzato per studi sperimentali in vivo con impianto di diversi tipi di cellule e carrier cellulari. Con questo video, vorremmo presentare un protocollo passo-passo della procedura chirurgica di impianto sottoretinico del vettore cellulare negli occhi del minipig Libehov.
Inserire lo speculum del coperchio. Aprire la congiuntiva sul lato nasale a due o tre millimetri dal limbus per esporre la sclera per le sclerotomie. Inserire i tre trocar calibro 25 a tre millimetri dal limbus nella zona della pars plana.
Mantenere la cornea bagnata o rivestirla con metilcellulosa durante l'intero intervento chirurgico per prevenire l'edema corneale osmotico. Rimuovere la porzione centrale del corpo vitreo con l'approccio vitrectomia pars plana standard a tre porte. Rimuovere con cura il vitreo dietro la lente nell'area della futura sclerotomia di grandi dimensioni.
Utilizzare l'iniezione intravitreale di triamcinolone acetonide per colorare il vitreo posteriore, che rimane solitamente aderente alla retina per eseguire un distacco controllato del vitreo posteriore. Successivamente, eseguire lentamente un'iniezione sottoretinica di BSS con una cannula di gauge 41 più centralmente, evitando la formazione del bleb verso la periferia. Ridurre l'impostazione della pressione intraoculare del sistema di irrigazione fino a 15 millimetri di mercurio durante l'iniezione sottoretinica al fine di prevenire l'occlusione vascolare retinica transitoria.
Eseguire una grande endodiatermia lineare della retina con la sonda endodiatermia di gauge 27 vicino alla base del bleb nasale. Successivamente, eseguire una retinotomia di tre millimetri utilizzando una lama MVR da 25 gauge o forbici verticali con elevata impostazione della pressione intraoculare del sistema di irrigazione fino a 60 millimetri di mercurio per tre-cinque minuti. Quindi eseguire una sclerotomia di tre millimetri a tre millimetri dal limbus usando un coltello phaco da 2,75 millimetri.
Prestare attenzione all'esodiatermia di possibili sanguinamenti dei vasi sclerali e del corpo ciliare all'interno della grande sclerotomia. Rimuovere il corpo vitreo prolasso sul lato della grande sclerotomia con il vitrettore. Quindi inserire delicatamente l'iniettore con una mano dominante nella cavità vitreale attraverso la grande sclerotomia.
Impiantare il vettore cellulare attraverso la retinotomia nello spazio sottoretinico. Ritirare l'iniettore dall'occhio e chiudere la grande sclerotomia con un 8-0 Sutura di Vicryl per evitare complicazioni associate all'ipotonia intraoculare. Eseguire uno scambio completo fluido-aria con la cannula con punta in silicone.
Successivamente, iniettare l'olio di silicone nella cavità vitreale fino a quando la pressione intraoculare sarà normale. Alla fine dell'intervento, rimuovere i trocar, e chiudere le tre sclerotomie e la congiuntiva con 8-0 Suture di Vicryl. Per ulteriori dettagli, consultare la sezione Procedura chirurgica.
Pulire l'area perioculare. Utilizzare la pinza e le forbici per rimuovere la palpebra superiore e inferiore. Rimuovere la terza palpebra.
Tagliare la congiuntiva. Taglia i muscoli oculari con le forbici. Procedere al taglio circolarmente dalla superficie alla profondità.
Taglia il nervo ottico. Rimuovere l'occhio dall'orbita. La chiarezza della cavità vitreale riempita con olio di silicone consente di visualizzare le condizioni della retina con vettore cellulare sottoretinico in qualsiasi momento del periodo post-operatorio.
Le immagini prive di rosso mostrano che la riflettività delle cellule RPE umane coltivate all'interno del telaio del vettore cellulare non differisce dalla riflettività dello strato RPE suino indigeno. L'imaging OCT in vivo rivela che il vettore cellulare impiantato nello spazio sottoretinico non aumenta significativamente l'intero spessore della retina. Anche la membrana di Bruch sembra rimanere intatta.
Il frame del vettore cellulare causa solo una piccola ombreggiatura del segnale OCT. Lo studio istologico delle sezioni criogeniche post-mortem della retina dimostra la formazione dello strato cellulare pigmentato continuo e irregolare nell'area dell'RPE umano primario impiantato, che dimostra la sopravvivenza del coltivato sulle cellule portatrici di cellule. L'analisi immunoistochimica della sezione tissutale mostra le cellule RPE umane, che sono presenti nell'area dell'impianto, ed esprimono il tipico marcatore RPE simile alle cellule RPE indigene minipig.
Nonostante ciò, le cellule RPE impiantate non appaiono come un monostrato cellulare. Tuttavia, queste cellule si trovano all'interno dello spazio sottoretinico definito. Un modello animale di minipigs a occhio grande, in questo caso, i maialini Libehov, consideriamo uno dei modelli più appropriati per la futura applicazione di nuovi concetti per il trattamento delle malattie degenerative della retina, a causa della loro somiglianza con l'anatomia e la fisiologia dell'occhio umano.
Queste somiglianze consentono di sviluppare le tecniche chirurgiche e la strumentazione per l'impianto sottoretinico del vettore cellulare, e questa tecnica potrebbe essere facilmente trasferita al trattamento dei disturbi dell'occhio umano. È importante assicurare che gli interventi chirurgici sui maialini siano eseguiti con la stessa strumentazione, compresi gli strumenti di consegna dell'impianto, che verrebbero utilizzati anche negli interventi chirurgici umani, rendendo così l'applicazione dell'esperienza acquisita e del know-how agli esseri umani senza difficoltà. La descrizione dettagliata delle procedure chirurgiche e post-operatorie potrebbe essere utile per studi futuri aumentando la generazione di dati efficienti e standardizzati.
