Name: analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

نشكر المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي ، ومختبر علم الأنسجة المرضي ، ومركز فرالين للتصوير في معهد فرجينيا للفنون التطبيقية ، وجامعة الولاية على الدعم الفني. يتم دعم هذا العمل من خلال العديد من المعاهد الوطنية للصحة والمنح الداخلية.

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في Virginia Tech. نظرا لأن مرض الذئبة لديه معدل حدوث أعلى في الإناث ، فقد تم استخدام الفئران MRL / lpr الإناث فقط. بدأ جمع العينات في عمر 4 أسابيع وانتهى في 15 أسبوعا. تم الحصول على الفئران من مصادر تجارية (انظر جد...

<ol>
	<li>Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Lupus+Erythematosus.">Systemic Lupus Erythematosus.</a> New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).</li><li>Davidson, A., Aranow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupus+nephritis:+lessons+from+murine+models.">Lupus nephritis: lessons from murine models.</a> Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).</li><li>Maldonado, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+environmental+antigens+in+the+spontaneous+development+of+autoimmunity+in+MRL-lpr+mice.">The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice.</a> Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).</li><li>Lech, M., Anders, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+lupus+nephritis.">The pathogenesis of lupus nephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).</li><li>Bagavant, H., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+kidney+disease+in+systemic+lupus+erythematosus.">Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus.</a> Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).</li><li>Li, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+autoantibody+clusters+that+best+predict+lupus+disease+activity+using+glomerular+proteome+arrays.">Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).</li><li>Arag&#243;n, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+biomarkers+in+lupus+nephritis.">Urinary biomarkers in lupus nephritis.</a> Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).</li><li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota.">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73 (2017).</li><li>Lu, T. -. S., Yiao, S. -. Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+biological+and+mechanical+variations+between+the+Lowry+versus+Bradford+method+for+protein+quantification.">Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).</li><li>Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+should+proteinuria+be+detected+and+measured.">How should proteinuria be detected and measured.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 46, 205-217 (2009).</li><li>Viswanathan, G., Upadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+proteinuria.">Assessment of proteinuria.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).</li><li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+outcomes+of+lupus+nephritis+with+tubulointerstitial+inflammation+and+scarring.">Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring.</a> Arthritis Care &amp; Research. 63 (6), 865-874 (2011).</li><li>Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bari&#233;ty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinuria+and+tubulointerstitial+lesions+in+lupus+nephritis.">Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis.</a> Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+B+cell-mediated+immune+responses+and+tubulointerstitial+inflammation+in+human+lupus+nephritis.">In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).</li><li>Schrezenmeier, E., Jayne, D., D&#246;rner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+B+Cells+and+plasma+cells+in+glomerular+diseases:+translational+perspectives.">Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).</li><li>Fitzgibbons, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+analytic+validation+of+immunohistochemical+assays:+Guideline+from+the+college+of+American+pathologists+pathology+and+laboratory+quality+center.">Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).</li><li>Lewis, M. J., Botto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+deficiencies+in+humans+and+animals:+links+to+autoimmunity.">Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity.</a> Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+renal+disease+in+MRL/lpr+mice+genetically+deficient+in+the+alternative+complement+pathway+factor+B.">Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B.</a> Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10+regulates+murine+lupus.">IL-10 regulates murine lupus.</a> Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).</li><li>Singh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+IL-4+and+STAT6+vs+STAT4+to+the+development+of+lupus+nephritis.">Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).</li><li>van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+targets+of+nephritogenic+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus.">Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).</li><li>Zuniga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+IgG+subclasses+and+C-reactive+protein+in+lupus+nephritis:+the+relationship+between+the+composition+of+immune+deposits+and+FCgamma+receptor+type+IIA+alleles.">Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).</li><li>Cabana-Puig, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+drift+in+lupus-prone+MRL/lpr+Mice:+potential+roles+of+micrornas+and+gut+microbiota.">Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota.</a> Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNaseI+treatment+is+a+prerequisite+for+the+amplification+of+cDNA+from+episomal-based+genes.">DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes.</a> Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).</li><li>Park, J. G. -., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+composition+in+normal+human+kidneys.">Immune cell composition in normal human kidneys.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining.">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li><li>Okutucu, B., D&#305;n&#231;er, A., Habib, &. #. 2. 1. 4. ;., Z&#305;hn&#305;oglu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+methods+for+determination+of+total+plasma+protein+concentration.">Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).</li></ol>

LN هو السبب الرئيسي للوفيات في مرضى الذئبة الحمراء ، ولا تزال العوامل التي تؤدي إلى تفاقم المرض غير واضحة. تطبيق هذا البروتوكول هو توصيف وظائف الكلى باستخدام طرق متعددة ، بما في ذلك قياس البيلة البروتينية ، وتحليل FACS لكريات الدم البيضاء المعزولة في الكلى ، وتلطيخ التألق المناعي لأقسام الكل...

الوظيفة الأساسية للكلية هي القضاء على المواد السامة عن طريق البول مع الحفاظ على توازن الماء والأملاح1. هذه الوظيفة مهددة في المرضى الذين يعانون من الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) ، مما يؤدي إلى ما يسمى التهاب الكلية الذئبة (LN). LN هو نتيجة لمهاجمة الجهاز المناعي للكلى ، مما يؤدي إلى التهاب الكلى المستمر ، وبالتالي فقدان قدرته على تنظيف النفايات من الدم وتنظيم تركيزات الملح والسوائل. هذا سيؤدي في النهاية إلى الفشل الكلوي ، والذي يمكن أن يكون قاتلا. أثناء العملية الكلوية ، يتم تجنيد الخلايا البائية المتداولة والخلايا التائية والخلايا الوحيدة في الكلى ، وإفراز الكيموكينات والسيتوكينات والأجسام المضادة الذاتية المكونة للمجمع المناعي. هذا يؤدي في نهاية المطاف إلى تلف الخلايا البطانية ، والإصابات الغشائية ، وضمور أنبوبي كلوي ، وتليف2.
MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) الفئران المعرضة للذئبة هي نموذج فأر كلاسيكي يظهر علامات سريرية تشبه الذئبة تشبه SLE3 البشري. كان لهذا النموذج دور فعال في فهم أحد الأسباب الرئيسية للوفيات لدى مرضى الذئبة الحمراء ، التهاب الكلية الذئبي (LN)4. في كل من الذئبة الحمراء البشرية والفأرية ، يتميز LN بالتهاب تدريجي ناتج عن ترسب كلوي للمجمعات المناعية ، يليه تنشيط مكمل ، وتجنيد الخلايا الالتهابية ، وفقدان وظائف الكلى5. ترسب المركب المناعي هو الخطوة الأولى للحث على إنتاج الكيموكين والسيتوكين بواسطة الخلايا الكلوية الجوهرية ، مما يوسع الاستجابة الالتهابية عن طريق تجنيد الخلايا المناعية6. يقدم البروتوكول الحالي العديد من التقنيات لمتابعة تطور أمراض الكلى التي تحلل تسلل الخلايا والترسب المعقد المناعي.
يسمح البول الذي يتم جمعه كل أسبوع بالكشف عن الدورة الزمنية للبيلة البروتينية وتصورها قبل وأثناء وبعد ظهور مرض الذئبة. يمكن للبيلة البروتينية كعلامة حيوية تحديد التقدم البيولوجي ل LN. المزايا الأخرى لهذه التقنية هي أنها غير غازية وفعالة من حيث التكلفة وسهلة التنفيذ7. عندما تعمل الكلى بشكل مثالي ، يكون مستوى البيلة البروتينية منخفضا باستمرار. ومع ذلك ، في الفئران MRL / lpr ، بعد 8-9 أسابيع من العمر ، لوحظ زيادة تدريجية في مستوى البيلة البروتينية ، والتي هي في نهاية المطاف عالية بما يكفي للتسبب في الفشل الكلوي8. تتوفر شرائط كاشف متعددة وكواشف قياس الألوان تجاريا لمراقبة المشكلة. ومع ذلك ، فإن فحص برادفورد رخيص ودقيق للغاية في تحديد بداية البيلة البروتينية ومسار التهاب الكلية الذئبي. هذا الفحص سريع ، ولا يتأثر الكاشف بوجود المذيبات والمخازن المؤقتة وعوامل الاختزال وعوامل تخلب المعادن التي قد تكون في عينتك9،10،11.
أحد الجوانب المهمة التي يجب مراعاتها هو تسلل الخلايا في الكلى. هذه التسلل تعزز التسبب في المرض عن طريق تحفيز إفراز العوامل القابلة للذوبان مثل السيتوكينات لتفاقم الالتهاب12. لفهم أفضل لمجموعات الخلايا الموجودة في التسلل ، فإن الطريقة المفيدة هي عزل الكريات البيض13. هنا ، يتم استخدام الكشف عن التسلل الكلوي للخلايا البائية كمثال. يبدأ الإجراء بعملية هضم مع ديوكسي ريبونوكلياز (DNase) والكولاجيناز ، يليه فصل تدرج الكثافة الذي يزيل الحطام وخلايا الدم الحمراء والخلايا المحببة الكثيفة. سبب عزل الخلايا البائية (CD19+) وخلايا البلازما (CD138+) هو أن الكلى الذئبية يمكن أن تركز هذه الخلايا14. يقترح أن وجود الخلايا البائية في مجاميع صغيرة في الكلى يمكن أن يشير إلى التوسع النسيلي ، وبالتالي إنتاج الغلوبولين المناعي (Ig). من المعروف أن خلايا البلازما موجودة في هذه المجاميع بالإضافة إلى15. بمجرد عزل الكريات البيض ، يمكن استخدام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) لتحليل الخلايا ذات الأهمية عند تلطيخ الأجسام المضادة المختلفة المترافقة مع التألق.
التألق المناعي هو أحد طرق الكشف عن الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) التي تسمح بالتصور الفلوري للبروتينات في عينات أنسجة الكلى السميكة 4 ميكرومتر. تعتمد طرق الكشف الأخرى عن المدينة العالمية للخدمات الإنسانية على طبيعة التحليلات وكيمياء الربط وعوامل أخرى16. التألق المناعي هو طريقة تحديد سريعة تعرض المستضد لنظيره من الأجسام المضادة الموسومة بفلوروكروم معين (أو صبغة فلورسنت). عندما يكون متحمسا ، فإنه ينتج ضوءا يمكن أن يكتشفه المجهر الفلوري. يمكن استخدام هذه التقنية لمراقبة ترسب المكمل C3 و IgG2a17. يمكن أن يرتبط التنشيط المفرط للتسلسل التكميلي باستجابة مناعية غير منضبطة وفقدان الوظيفة18. يعد الترسب المناعي للأجسام المضادة للحمض النووي المزدوج (anti-dsDNA) في الكلى مصدر قلق كبير19 ، حيث ارتبط أولئك الذين لديهم النمط المتماثل IgG2a ب LN20. على وجه التحديد ، تظهر الأجسام المضادة المضادة ل dsDNA المزيد من الإمراض والتقارب مع المواد النووية ، وتشكل مجمعات مناعية21. عندما يكون IgG2a موجودا ، يتم تنشيط سلسلة المكمل ، بما في ذلك C3 ، لإزالة المجمعات المناعية22. يمكن تحديد علامات C3 و IgG2a كميا بشكل فردي أو تراكبها لإنشاء ارتباطها.
والجدير بالذكر أن قياس الكرياتينين في الدم هو تقنية أخرى موثوقة يمكن استخدامها مع بيلة دموية مجهرية وخزعات الكلى لتشخيص LN23. ومع ذلك ، فإن وجود البيلة البروتينية هو مؤشر قوي على تلف الكبيبات. وبهذا المعنى ، فإن مراقبة مستوى البيلة البروتينية أثناء مرض الذئبة يمكن أن تكشف عن بداية المرض وتكمل الطرق الأخرى لتشخيص مرض الذئبة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمجمعات المناعية المودعة في الكبيبات أن تحفز استجابة التهابية ، وتنشط نظام التكملة ، وتجند المزيد من الخلايا الالتهابية. نقطة أخرى جديرة بالملاحظة في هذا البروتوكول هي تسلل الخلايا البائية في الكلى. هذا ، جنبا إلى جنب مع الخلايا التائية المخترقة ، يضخم الاستجابات المناعية المحلية التي تؤدي إلى تلف الأعضاء. الأهم من ذلك ، أن تصنيف LN لا يعتمد فقط على التغيرات المورفولوجية الكبيبية التي شوهدت في الفحص المجهري ولكن أيضا على الرواسب المناعية التي لوحظت مع التألق المناعي. لذلك ، في هذا البروتوكول ، يتم تقديم طرق دقيقة وفعالة من حيث التكلفة لتحليل وظائف الكلى في إعدادات المختبر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J60764.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse C3</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL7632F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD138 BV711</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-212-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9511236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA-EC</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-ecdna</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 Microscope imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fusion Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>23272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail enamel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any conventional store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T compound</td>
			<td>Tisse-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>R-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 20x TBS Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Albumin standard included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLon Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>FcR block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.1 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell Strainers 100 &#181;M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin Hydrochloride</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>V-200-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>fluorescent dye for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice

الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) هي اضطراب مناعي ذاتي بدون علاج معروف ويتميز بالتهاب مستمر في العديد من الأعضاء ، بما في ذلك الكلى. في ظل هذه الظروف ، تفقد الكلى قدرتها على تنظيف النفايات من الدم وتنظيم تركيزات الملح والسوائل ، مما يؤدي في النهاية إلى الفشل الكلوي. يتم تشخيص النساء ، وخاصة النساء في سن الإنجاب ، تسع مرات أكثر من الرجال. أمراض الكلى هي السبب الرئيسي للوفيات في مرضى الذئبة الحمراء. يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وبسيطة لقياس مستويات البروتين المفرزة في البول الذي تم جمعه ، وتتبع تطور مرض الذئبة بمرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير نهج لعزل خلايا الكلى أحادية النواة بناء على اختيار الحجم والكثافة للتحقيق في التسلل الكلوي للكريات البيضاء. علاوة على ذلك ، تم تطوير طريقة كيميائية نسيجية مناعية لتوصيف ترسب البروتين في الكبيبات وتسلل الكريات البيض في الفضاء الأنبوبي الخلالي. معا ، يمكن أن تساعد هذه الطرق في التحقيق في تطور الالتهاب المزمن المرتبط بكلى الفئران المعرضة للذئبة MRL / lpr.

يستخدم البروتوكول طرقا متعددة لتقييم الفئران MRL / lpr لالتهاب الكلية الذئبة. أولا ، يتم وصف إجراء لدراسة زيادة مستويات البيلة البروتينية بسبب اختلال وظائف الكلى بمرور الوقت. وكما هو مبين في الشكل 1، عولجت إناث الفئران بجرعة فموية تبلغ 200 ميكرولتر من المياه المالحة العازلة با?...

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

يصف هذا البروتوكول طريقة لتتبع تطور مرض الذئبة في الفئران. يتم تقديم إجراءين إضافيين لتوصيف التهاب الكلية الذئبي بناء على تسلل الخلايا وترسب البروتين في الكلى.

تحليل البيلة البروتينية ، والتسلل الكلوي للكريات البيضاء ، والترسب الكلوي للبروتينات في الفئران المعرضة للذئبة MRL / lpr

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

يمكن أن تساعد هذه الطرق في التحقيق في تطور الالتهاب المزمن المرتبط بالكلى لدى مرضى الذئبة. نحن نقدم بديلا موثوقا وفعالا من حيث التكلفة يمكن استخدامه لمراقبة مسار المرض في مرض الذئبة. ابدأ في تعقيم الغطاء عن طريق رش 70٪ من الإيثانول ووضع ورقة بلاستيكية معقمة على السطح.ثم قم بإعداد نصائح وأنابيب 1.5 ملليلتر وماصة لجمع حوالي 20 ميكرولتر من البول. خذ القفص ورش 70٪ من الإيثانول قبل وضعه داخل الغطاء. بعد ذلك ، أمسك الماوس بيد واحدة واستخدم اليد الأخرى لتدليك المنطقة البطنية بلطف من الأعلى إلى الأسفل.باستخدام أنبوب أو ماصة 1.5 ملليلتر ، اجمع البول مباشرة. أو إذا كانت قطرات العينة تجمعها من الغطاء البلاستيكي. ثم ضع الماوس مرة أخرى في القفص.قطع الكلى تشريح إلى حجم الحبوب وهضمها في خمسة ملليلتر من الهضم العازلة التي تحتوي على الكولاجيناز و DNase 1 في RPMI 1640 المتوسطة التي تحتوي على HEPES لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز لطيف مستمر عند 37 درجة مئوية. أضف 10 ملليلتر من PBS البارد المثلج الذي يحتوي على 10 ملليمولار من EDTA واحتضنه لمدة 10 دقائق على الثلج. ثم دوامة التعليق مرتين.في وقت لاحق ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة 100 ميكرومتر واغسلها ب 10 ملليلتر من HBSS ممتلئة. بعد ذلك ، جهاز طرد مركزي في 350 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد محلول Percoll متساوي التوتر بنسبة 30 و 37 و 70٪ وأضف طبقة من محلول Percoll بنسبة 37٪ فوق محلول 70٪.إعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من 30٪ مخزون متساوي التوتر Percoll. باستخدام ماصة باستور ، قم بتحميل 37٪ من خمسة ملليلتر في الأعلى و 70٪ من خمسة ملليلتر في الأسفل ، مما يجعل تدرج Percoll متساوي التوتر في المخزون. ثم ، جهاز طرد مركزي مع رقم أعلى تسعة ورقم صفر لأسفل عند 1000 مرة G لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك ، قم بجمع الكريات البيض من الواجهة 37 إلى 70٪ وأعد تعليقها في خمسة ملليلتر من C 10. مرة أخرى ، جهاز طرد مركزي في 350 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم أعد تعليق حبيبات الخلايا في ثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت للفاكس وأجهزة الطرد المركزي عند 350 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.ثم تخلص من supernatant تاركا حوالي 50 ميكرولتر من الحجم الكلي. أضف 50 ميكرولتر من كتلة مستقبلات FC لكل أنبوب. بعد هذا المزيج واحتضن على الثلج في الظلام لمدة 10 دقائق.في وقت لاحق ، أضف ملليلتر من المخزن المؤقت للفاكس للغسيل. ثم ، جهاز الطرد المركزي في 350 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية والتخلص من supernatent ترك حوالي 50 ميكرولتر من الحجم الكلي. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت المناسبة واتركها تقف لمدة 15 إلى 30 دقيقة على الجليد.أضف 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة لكل أنبوب يحتوي على CD 138 البنفسجي اللامع سبعة 11 و CD 45 Alexa Fluor 700 واحتضنه على الثلج في الظلام لمدة 15 إلى 30 دقيقة. بعد ذلك، أضف ثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت للفاكس. جهاز طرد مركزي بسرعة 350 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.قم بإزالة supernatant عن طريق الفراغ تاركا حوالي 50 ميكرولتر من الحجم الكلي. في وقت لاحق ، أعد تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من PBS. لجمع العينة ، قم بتضمين نصف الكلى في cryomold البلاستيكي الصغير مع مركب درجة حرارة القطع الأمثل.ثم أضف الثلج الجاف إلى صندوق رغوة البوليسترين وضع المبرد بعناية فوق الثلج الجاف. بعد ذلك ، قم بإزالة قالب التبريد ، ولفه بورق الألومنيوم وتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام مرة أخرى. ثم قم بإصلاح الأقسام الجافة إلى أربعة ميكرومتر باستخدام الأسيتون البارد لمدة 10 دقائق.بعد تثبيت الشرائح ، تجف في الهواء لمدة 0.5 إلى ساعة واحدة وتخزنها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لفترة قصيرة أو ناقص 80 درجة مئوية لفترة طويلة. لتلطيخ العينات، أعد إصلاح الشرائح في الأسيتون البارد لمدة خمس إلى 10 دقائق واسمح للأقسام بالإحماء إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، باستخدام قلم بات ، ارسم دائرة مسعورة حول القسم واتركه يجف.ثم ضع الشرائح في TBS في جرة كوبلاند لمدة 20 دقيقة ورجها بلطف عن طريق وضع الجرة على الخلاط. في وقت لاحق ، صب TBS وملء الجرة مع TBS 5 ٪ BSA و 0.1 ٪ TW 20. في وقت لاحق ، احتضن الجرة لمدة 20 دقيقة عن طريق الاهتزاز بلطف على الخلاط.ثم أخرج الشرائح وامسح الجزء السفلي من الشرائح. أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المترافقة C3 تناسب C و IgG2 APE إلى القسم واحتضن درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة. اغسل القسم ثلاث مرات في PBS 5٪ BSA و 0.1٪ TW 20 لمدة 10 دقائق على الخلاط ثم رج الشرائح جافة.قم بتركيب القسم باستخدام كاشف مضاد للتلاشي ثم باستخدام قسيمة غطاء. ثم قم بتخزين الشرائح عند أربع درجات مئوية حتى يتم عرضها تحت المجهر. لتحليل الصور باستخدام برنامج الصورة J ، حدد المنطقة المطلوبة.بعد ذلك ، قم بتعيين المعلمات القياسية بالنقر فوق تحليل ثم تعيين القياسات وقياس المنطقة للحصول على النتائج. بعد ذلك ، انقل البيانات التي تم الحصول عليها من نوافذ القياس إلى جدول بيانات. بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقر فوق تحليل لقياس المنطقة ونقل البيانات مرة أخرى إلى جدول البيانات السابق.تم الكشف عن مستويات البروتين في بول الفئران MRL LPR مع مرور الوقت حيث عولجوا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات كمجموعة تحكم و lactobacillus reuteri كمجموعة علاجية. عالجت مجموعة الفئران مع L.reuteri في تطور بروتينية أكثر عدوانية من المجموعة الضابطة. تم إجراء تحليل الفاكس لكريات الدم البيضاء المعزولة لتحليل خلايا البلازما.علاوة على ذلك ، عولجت الفئران بالفانكومايسين أو الفانكومايسين جنبا إلى جنب مع الحمض النووي المزدوج للإشريكية القولونية. على الرغم من أنه كان من المتوقع أن يؤدي الحمض النووي الإشريكية القولونية المزدوجة إلى التسلل الكلوي ، إلا أنه لم يتم العثور على فرق كبير في النسبة المئوية لخلايا البلازما. تم الكشف عن المكمل C3 و IgG2a من خلال تلطيخ التألق المناعي على أقسام الكلى MRL IPR للإناث.تمت مقارنة العوامل البيئية الفعالة على الترسيب الكلوي ل C3 و IgG2a لخبز الفئران الداخلي في منشأة الحيوانات وتلك التي تم شراؤها من بائع. لم يظهر التحليل الكيميائي النسيجي المناعي أي فرق بين المجموعتين. يمكن أن تكون إضافة كل طبقة من النسبة المئوية للمخزون ISO 20 Percoll الحل تحديا ، وإذا اختلطت ، فعليك البدء من جديد.يساعد هذا الإجراء في قياس التدفق الخلوي وتجارب فيتر ، لذلك لا يمكنك دراسة نوع خلايا الكلى المختلفة للسكان. يسمح لنا هذا الإجراء بدراسة الخلايا البائية التي تتسلل إلى الكلى وليس هناك الكثير من المعلومات في الأدبيات.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

عزل الكريات البيضاء في الدماغ التسلل

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء<em&gt; المتصورة berghei</em&gt; ANKA الفئران المصابة

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

الأعور ربط والبزل التي يسببها تعفن الدم نموذجا لدراسة الالتهام الذاتي في الفئران

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

تحليل آثار خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض من التدفق

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

عزل الكريات البيضاء من واجهة الإنسان الأم والجنين

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

حصاد الانتقائي للMarginating-الرئوية الكريات البيضاء

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

حصاد الانتقائي للMarginating-الكبدية الكريات البيضاء

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

التوصيف المظهري لالضامة من الكلى الجرذ بواسطة التدفق الخلوي

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

القصبات الغسل من الفئران الرئتين لتحليل التهاب تسلل خلية

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

زرع تحت القبعات الكلوية من الغدة الصعترية الجنينية Murine المعالجة 2'-ديوكسيغوانوسين في الفئران عارية

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...