Name: analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Vi takker Flow Cytometry Core Facility, Histopathology Laboratory, Fralin Imaging Center ved Virginia Polytechnic Institute og State University for teknisk support. Dette arbejde understøttes af forskellige NIH og interne tilskud.

Den nuværende protokol er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Virginia Tech. Da lupus sygdom har en højere forekomst hos kvinder, kun kvindelige MRL / lpr mus blev brugt. Prøveindsamlingen blev påbegyndt ved 4 ugers alderen og afsluttet ved 15 uger. Musene blev fremstillet fra kommercielle kilder (se Materialetabel) og blev opdrættet og vedligeholdt i et specifikt patogenfrit miljø efter de institutionelle retningslinjer.
1. Test af ...

<ol>
	<li>Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Lupus+Erythematosus.">Systemic Lupus Erythematosus.</a> New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).</li><li>Davidson, A., Aranow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupus+nephritis:+lessons+from+murine+models.">Lupus nephritis: lessons from murine models.</a> Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).</li><li>Maldonado, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+environmental+antigens+in+the+spontaneous+development+of+autoimmunity+in+MRL-lpr+mice.">The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice.</a> Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).</li><li>Lech, M., Anders, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+lupus+nephritis.">The pathogenesis of lupus nephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).</li><li>Bagavant, H., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+kidney+disease+in+systemic+lupus+erythematosus.">Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus.</a> Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).</li><li>Li, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+autoantibody+clusters+that+best+predict+lupus+disease+activity+using+glomerular+proteome+arrays.">Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).</li><li>Arag&#243;n, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+biomarkers+in+lupus+nephritis.">Urinary biomarkers in lupus nephritis.</a> Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).</li><li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota.">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73 (2017).</li><li>Lu, T. -. S., Yiao, S. -. Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+biological+and+mechanical+variations+between+the+Lowry+versus+Bradford+method+for+protein+quantification.">Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).</li><li>Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+should+proteinuria+be+detected+and+measured.">How should proteinuria be detected and measured.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 46, 205-217 (2009).</li><li>Viswanathan, G., Upadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+proteinuria.">Assessment of proteinuria.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).</li><li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+outcomes+of+lupus+nephritis+with+tubulointerstitial+inflammation+and+scarring.">Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring.</a> Arthritis Care &amp; Research. 63 (6), 865-874 (2011).</li><li>Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bari&#233;ty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinuria+and+tubulointerstitial+lesions+in+lupus+nephritis.">Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis.</a> Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+B+cell-mediated+immune+responses+and+tubulointerstitial+inflammation+in+human+lupus+nephritis.">In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).</li><li>Schrezenmeier, E., Jayne, D., D&#246;rner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+B+Cells+and+plasma+cells+in+glomerular+diseases:+translational+perspectives.">Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).</li><li>Fitzgibbons, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+analytic+validation+of+immunohistochemical+assays:+Guideline+from+the+college+of+American+pathologists+pathology+and+laboratory+quality+center.">Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).</li><li>Lewis, M. J., Botto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+deficiencies+in+humans+and+animals:+links+to+autoimmunity.">Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity.</a> Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+renal+disease+in+MRL/lpr+mice+genetically+deficient+in+the+alternative+complement+pathway+factor+B.">Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B.</a> Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10+regulates+murine+lupus.">IL-10 regulates murine lupus.</a> Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).</li><li>Singh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+IL-4+and+STAT6+vs+STAT4+to+the+development+of+lupus+nephritis.">Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).</li><li>van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+targets+of+nephritogenic+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus.">Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).</li><li>Zuniga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+IgG+subclasses+and+C-reactive+protein+in+lupus+nephritis:+the+relationship+between+the+composition+of+immune+deposits+and+FCgamma+receptor+type+IIA+alleles.">Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).</li><li>Cabana-Puig, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+drift+in+lupus-prone+MRL/lpr+Mice:+potential+roles+of+micrornas+and+gut+microbiota.">Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota.</a> Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNaseI+treatment+is+a+prerequisite+for+the+amplification+of+cDNA+from+episomal-based+genes.">DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes.</a> Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).</li><li>Park, J. G. -., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+composition+in+normal+human+kidneys.">Immune cell composition in normal human kidneys.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining.">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li><li>Okutucu, B., D&#305;n&#231;er, A., Habib, &. #. 2. 1. 4. ;., Z&#305;hn&#305;oglu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+methods+for+determination+of+total+plasma+protein+concentration.">Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).</li></ol>

LN er en førende årsag til dødelighed hos SLE-patienter, og faktorer, der forværrer sygdommen, forbliver uklare. Anvendelsen af denne protokol er at karakterisere nyrefunktionen ved anvendelse af flere metoder, herunder måling af proteinuri, FACS-analyse af isolerede nyreleukocytter og immunfluorescensfarvning af frosne nyresektioner.
Et vigtigt punkt at overveje, mens man samler urin, er, at man skal være i overensstemmelse med tidspunktet på dagen og placeringen af urinopsamling. Mus ...

Nyrens primære funktion er eliminering af giftige stoffer gennem urin, samtidig med at homeostase af vand og salte opretholdes1. Denne funktion er truet hos patienter med systemisk lupus erythematosus (SLE), hvilket fører til såkaldt lupus nefritis (LN). LN er en konsekvens af, at immunsystemet angriber nyrerne, hvilket fører til vedvarende nyrebetændelse og derfor mister sin evne til at rense affald fra blodet og regulere salt- og væskekoncentrationer. Dette vil i sidste ende føre til nyresvigt, hvilket kan være dødeligt. Under den nefritiske proces rekrutteres cirkulerende B-celler, T-celler og monocytter til nyrerne og udskiller kemokiner, cytokiner og immunkompleksdannende autoantistoffer. Dette resulterer i sidste ende i endotelcelleskader, membranøse skader, renal tubulær atrofi og fibrose2.
MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) lupus-udsatte mus er en klassisk musemodel, der udviser lupus-lignende kliniske tegn, der ligner human SLE3. Denne model har været medvirkende til at forstå en af de førende årsager til dødelighed hos SLE-patienter, lupus nefritis (LN)4. I både human og mus SLE er LN karakteriseret ved gradvis inflammation udløst af renal aflejring af immunkomplekser efterfulgt af komplementaktivering, rekruttering af inflammatoriske celler og tab af nyrefunktion5. Immunkompleksaflejringen er det første skridt til at inducere kemokin- og cytokinproduktion af iboende nyreceller, hvilket udvider det inflammatoriske respons ved at rekruttere immunceller6. Den nuværende protokol præsenterer flere teknikker til at følge nyresygdomsprogression, der analyserer celleinfiltration og immunkompleksaflejring.
Urin indsamlet hver uge giver mulighed for påvisning og visualisering af tidsforløbet af proteinuri før, under og efter lupus debut. Proteinuri som biomarkør kan bestemme den biologiske progression af LN. Andre fordele ved denne teknik er, at den er ikke-invasiv, omkostningseffektiv og nem at implementere7. Når nyrerne fungerer perfekt, er proteinuriniveauet konsekvent lavt; hos MRL/lpr-mus observeres dog efter 8-9 ugers alderen en gradvis stigning i proteinuriniveauet, der til sidst er højt nok til at forårsage nyresvigt8. Flere reagensstrimler og kolorimetriske reagenser er kommercielt tilgængelige for at overvåge problemet. Bradford-analysen er imidlertid billig og meget præcis til bestemmelse af begyndelsen af proteinuri og forløbet af lupus nefritis. Dette assay er hurtigt, og reagenset påvirkes ikke af tilstedeværelsen af opløsningsmidler, buffere, reduktionsmidler og metalcheleringsmidler, der kan være i din prøve 9,10,11.
Et vigtigt aspekt at overveje er celleinfiltration i nyrerne. Disse infiltrater fremmer patogenese ved at udløse udskillelsen af opløselige faktorer såsom cytokiner for at forværre inflammation12. For bedre at forstå, hvilke cellepopulationer der er til stede i infiltraterne, er en nyttig metode at isolere leukocytter13. Her anvendes påvisning af renal infiltration af B-celler som et eksempel. Proceduren begynder med en fordøjelsesproces med deoxyribonuklease (DNase) og collagenase efterfulgt af densitetsgradientseparation, der fjerner snavs, røde blodlegemer og tætte granulocytter. Årsagen til at isolere B-celler (CD19+) og plasmaceller (CD138+) er, at lupus nyrer kan koncentrere disse celler14. Det foreslås, at tilstedeværelsen af B-celler i små aggregater i nyrerne kan indikere klonal ekspansion og følgelig immunoglobulin (Ig) produktion. Plasmaceller er velkendte for at være til stede i disse aggregater såvel15. Når leukocytter er blevet isoleret, kan fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) bruges til at analysere cellerne af interesse ved farvning med forskellige fluorescenskonjugerede antistoffer.
Immunofluorescens er en af de immunohistokemiske (IHC) detektionsmetoder, der muliggør fluorescerende visualisering af proteiner i 4 μm tykke nyrevævsprøver. Andre IHC-detektionsmetoder afhænger af analytters art, bindingskemi og andre faktorer16. Immunofluorescens er en hurtig identifikationsmetode, der udsætter antigenet for dets modstykke antistof mærket med et specifikt fluorokrom (eller et fluorescerende farvestof). Når det er ophidset, producerer det lys, som et fluorescensmikroskop kan detektere. Denne teknik kan bruges til at observere aflejringen af komplement C3 og IgG2a17. Overdreven komplementkaskadeaktivering kan være forbundet med et ukontrolleret immunrespons og funktionstab18. Immunaflejring af anti-dobbeltstrenget DNA (anti-dsDNA) autoantistoffer i nyrerne er et stort problem19, hvor de med IgG2a isotype har været forbundet med LN20. Specifikt udviser anti-dsDNA-antistoffer mere patogenicitet og affinitet til nukleare materialer, der danner immunkomplekser21. Når IgG2a er til stede, aktiveres komplementkaskaden, inklusive C3, for at rydde immunkomplekserne22. C3- og IgG2a-markørerne kan kvantificeres individuelt eller overlejres for at fastslå deres korrelation.
Især serumkreatininmåling er en anden pålidelig teknik, der kan bruges sammen med mikroskopisk hæmaturi og nyrebiopsier til diagnosticering af LN23. Tilstedeværelsen af proteinuri er imidlertid en stærk indikator for glomerulær skade. I den forstand kan overvågning af proteinuriniveauet under lupus detektere sygdomsdebut og supplere andre metoder til diagnosticering af lupus. Derudover kan immunkomplekser deponeret i glomeruli inducere et inflammatorisk respons, aktivere komplementsystemet og rekruttere flere inflammatoriske celler. Et andet bemærkelsesværdigt punkt i denne protokol er B-celleinfiltration i nyrerne. Dette, sammen med de infiltrerede T-celler, forstærker lokale immunresponser, der udløser organskader. Det er vigtigt, at klassificeringen af LN ikke kun er baseret på glomerulære morfologiske ændringer set i mikroskopi, men også immunaflejringer observeret med immunfluorescens. Derfor tilbydes i denne protokol nøjagtige og omkostningseffektive metoder til analyse af nyrefunktion i laboratorieindstillinger.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J60764.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse C3</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL7632F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD138 BV711</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-212-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9511236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA-EC</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-ecdna</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 Microscope imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fusion Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>23272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail enamel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any conventional store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T compound</td>
			<td>Tisse-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>R-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 20x TBS Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Albumin standard included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLon Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>FcR block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.1 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell Strainers 100 &#181;M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin Hydrochloride</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>V-200-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>fluorescent dye for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice

Systemisk lupus erythematosus (SLE) er en autoimmun lidelse uden kendt kur og er karakteriseret ved vedvarende betændelse i mange organer, herunder nyrerne. Under sådanne omstændigheder mister nyrerne sin evne til at rense affald fra blodet og regulere salt- og væskekoncentrationer, hvilket i sidste ende fører til nyresvigt. Kvinder, især kvinder i den fødedygtige alder, diagnosticeres ni gange oftere end mænd. Nyresygdom er den hyppigste årsag til dødelighed hos SLE-patienter. Den nuværende protokol beskriver en hurtig og enkel metode til at måle udskilte proteinniveauer i opsamlet urin, sporing af lupus progression over tid. Derudover tilvejebringes en tilgang til isolering af nyremononukleære celler baseret på størrelse og densitetsvalg for at undersøge renal infiltration af leukocytter. Desuden er der udviklet en immunohistokemisk metode til at karakterisere proteinaflejring i glomeruli og leukocytinfiltration i tubulointerstitielt rum. Sammen kan disse metoder hjælpe med at undersøge udviklingen af kronisk inflammation forbundet med nyrerne hos lupus-udsatte MRL / lpr-mus.

Protokollen bruger flere metoder til at vurdere MRL / lpr mus for lupus nefritis. For det første beskrives en procedure for at studere øgede proteinuriniveauer på grund af nyredysfunktion over tid. Som vist i figur 1 blev hunmus behandlet med oral sonde på 200 μL phosphatbufferet saltvand (1x PBS) som kontrolgruppe og probiotisk Lactobacillus reuteri som behandlingsgruppe i en koncentration på 109 cfu/ml to gange om ugen. Behandlingen startede ved 3 uger gammel og s...

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

Den nuværende protokol beskriver en metode til at spore lupus progression i mus. To yderligere procedurer præsenteres for at karakterisere lupus nefritis baseret på celleinfiltration og proteinaflejring i nyrerne.

Analyser af proteinuri, renal infiltration af leukocytter og renal aflejring af proteiner i lupus-udsatte MRL/lpr-mus

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Disse metoder kan hjælpe med at undersøge udviklingen af kronisk inflammation forbundet med nyrer hos lupuspatienter. Vi tilbyder et pålideligt og omkostningseffektivt alternativ, der kan bruges til at overvåge sygdomsforløbet i lupus. Begynd at sterilisere emhætten ved at sprøjte 70% ethanol og læg et sterilt plastark på overfladen.Forbered derefter tip, 1,5 milliliter rør og en pipette til at samle ca. 20 mikroliter af urinen. Tag buret og sprøjt 70% ethanol, før du placerer det inde i emhætten. Hold derefter musen med den ene hånd og brug den anden hånd til forsigtigt at massere det ventrale område fra top til bund.Brug et 1,5 ml rør eller pipette til at samle urinen direkte. Eller hvis prøvedråberne samler den fra plastpladen. Sæt derefter musen tilbage i buret.Skær de dissekerede nyrer i kornstørrelse og fordøjes i fem milliliter fordøjelsesbuffer indeholdende kollagenase og DNase 1 i RPMI 1640-medium indeholdende HEPES i en time med kontinuerlig blid omrystning ved 37 grader Celsius. Tilsæt 10 ml iskold PBS indeholdende 10 millimolar EDTA og inkuberes i 10 minutter på is. Derefter hvirvles suspensionen to gange.Senere filtreres cellesuspensionen gennem en 100 mikrometer sil og vaskes med 10 ml HBSS fuld. Derefter centrifugeres ved 350 gange G i 10 minutter ved stuetemperatur. Der fremstilles en 30, 37 og 70 % stockisotonisk Percoll-opløsning, og der tilsættes et lag 37 % Percoll-opløsning oven på 70 %-opløsningen.Re suspendere cellerne i fem milliliter 30% lager isotonisk Percoll. Ved hjælp af en Pasteur-pipette indlæses langsomt 37% af fem milliliter top og 70% af fem milliliter på bunden, hvilket gør lagerisotonisk Percoll-gradient. Derefter centrifuge med op nummer ni og ned nummer nul ved 1000 gange G i 30 minutter ved stuetemperatur.Derefter samles leukocytter fra 37 til 70% grænsefladen og suspenderes igen i fem milliliter C 10. Igen centrifuge ved 350 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Derefter suspenderes cellepelleten i tre milliliter faxbuffer og centrifuge ved 350 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius.Kassér derefter supernatanten og efterlader ca. 50 mikroliter af det samlede volumen. Tilsæt 50 mikroliter FC-receptorblok pr. Rør. Efter denne blanding og inkubere på is i mørket i 10 minutter.Senere tilsættes to milliliter faxbuffer til vask. Derefter centrifugeres ved 350 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius, og supernatenten kasseres og efterlader ca. 50 mikroliter af det samlede volumen. Tilsæt derefter 20 mikroliter af det passende fluorescerende farvestof og lad det stå i 15 til 30 minutter på is.Tilsæt 50 mikroliter antistofblanding pr. rør indeholdende CD 138 brilliant violet seven 11 og CD 45 Alexa Fluor 700 og inkuberes på is i mørke i 15 til 30 minutter. Derefter tilsættes tre milliliter faxbuffer. Centrifuge ved 350 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius.Fjern supernatanten ved at vakuum og efterlade ca. 50 mikroliter af det samlede volumen. Senere suspenderes cellepelleten i 200 mikroliter PBS. For at indsamle prøven indlejres halvnyren i den lille plastkryomid med den optimale skæretemperaturforbindelse.Tilsæt derefter tøris i en polystyrenskumkasse og læg forsigtigt cryomolden oven på tørisen. Fjern derefter cryomold, pakk det ind i aluminiumsfolie og opbevar det ved minus 80 grader Celsius indtil yderligere brug. Fastgør derefter de tørre til fire mikrometer sektioner med kold acetone i 10 minutter.Efter fastgørelse af diasene lufttørres i 0,5 til en time og opbevares ved minus 20 grader Celsius i kort tid eller minus 80 grader Celsius i lang tid. For at plette prøverne skal du rette diasene i kold acetone i fem til 10 minutter og lade sektionerne varme op til stuetemperatur. Tegn derefter en hydrofob cirkel rundt om sektionen ved hjælp af en klappepen og lad den tørre.Placer derefter dias i TBS i Copeland-krukken i 20 minutter og ryst forsigtigt ved at sætte krukken på rysteren. Hæld derefter TBS af og fyld krukken med TBS 5% BSA og 0,1% TW 20. Senere inkuberes krukken i 20 minutter ved at ryste forsigtigt på rysteren.Tag derefter diasene ud og tør bunden af diasene. Tilsæt 100 mikroliter konjugerede antistoffer C3 fit C og IgG2 APE til sektionen og inkuber stuetemperatur i et befugtet kammer i en time. Vask sektionen tre gange i PBS 5% BSA og 0,1% TW 20 i 10 minutter på rysteren, og ryst derefter tørre diasene.Monter sektionen med et anti-fade reagens og derefter med en dækslip. Opbevar derefter diasene ved fire grader Celsius, indtil de vises under mikroskopet. Til billedanalyse ved hjælp af billede J-softwaren skal du skitsere det ønskede område.Indstil derefter standardparametre ved at klikke på analyser, indstil derefter målinger og måleområde for at få resultaterne. Overfør derefter de data, der er opnået fra målevinduerne, til et regneark. Når du er færdig, skal du klikke på analyser for at måle regionen og overføre dataene igen til det forrige regneark.Proteinniveauerne i urinen hos MRL LPR-mus blev påvist over tid, hvor de blev behandlet med fosfatbufferet saltvand som kontrolgruppe og lactobacillus reuteri som behandlingsgruppe. Musgruppen blev behandlet med L.reuteri ved en mere aggressiv proteinuriprogression end kontrolgruppen. Faxanalysen blev udført for de isolerede nyreleukocytter for at analysere plasmacellerne.Endvidere blev musene behandlet med vancomycin eller vancomycin sammen med Escherichia coli dobbeltstrenget DNA. Selvom Escherichia coli dobbeltstrenget DNA forventedes at udløse nyreinfiltrationen, blev der ikke fundet nogen signifikant forskel i procentdelen af plasmaceller. Komplementet C3 og IgG2a blev påvist ved immunfluorescensfarvning på kvindelige MRL IPR-nyreafsnit.De effektive miljøfaktorer på nyreaflejringen af C3 og IgG2a blev sammenlignet for det interne musebrød i dyreanlægget og dem, der blev købt hos en leverandør. Den immunohistokemiske analyse viste ingen forskel mellem de to grupper. Det kan være en udfordring at tilføje hvert lag af ISO 20 Percoll-opløsningen med procentbestand, og hvis de blandes, skal du starte forfra.Denne procedure hjælper med flowcytometeret og i vittereksperimenter, så du kan ikke studere de forskellige nyrecelletyper af populationer. Denne procedure giver os mulighed for at studere B-cellerne infiltrerer i nyrerne, og der er ikke meget information i litteraturen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolering og analyse af Brain-sekvestrerede Leukocytter fra<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-inficerede mus

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Cecal ligatur og Punktering-induceret sepsis som en model til at studere Autophagy i mus

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

At analysere virkningen af ​​stromacellers om ansættelse af Leukocytter fra Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolering af leukocytter fra Human Maternal-føtal grænseflade

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Selektiv Høst af Marginating-pulmonale Leukocytter

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Selektiv Høst af Marginating-hepatiske Leukocytter

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fænotypisk karakterisering af makrofager fra rottenyre ved flowcytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolær Lavage af murine Lunger at analysere inflammatorisk celleinfiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

Renal subkapsulær transplantation af 2 '-Deoxyguanosin-behandlede murine embryonale thymus i Nude mus

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...