Name: analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

We bedanken de Flow Cytometry Core Facility, het Histopathology Laboratory, het Fralin Imaging Center aan het Virginia Polytechnic Institute en de State University voor technische ondersteuning. Dit werk wordt ondersteund door verschillende NIH en interne subsidies.

Het huidige protocol is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Virginia Tech. Aangezien lupusziekte een hogere incidentie heeft bij vrouwen, werden alleen vrouwelijke MRL / lpr-muizen gebruikt. De monsterverzameling werd gestart op de leeftijd van 4 weken en eindigde op de leeftijd van 15 weken. De muizen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Tabel van Materialen) en werden gefokt en onderhouden in een specifieke pathogeenvrije omgeving volgens de institution...

<ol>
	<li>Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Lupus+Erythematosus.">Systemic Lupus Erythematosus.</a> New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).</li><li>Davidson, A., Aranow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupus+nephritis:+lessons+from+murine+models.">Lupus nephritis: lessons from murine models.</a> Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).</li><li>Maldonado, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+environmental+antigens+in+the+spontaneous+development+of+autoimmunity+in+MRL-lpr+mice.">The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice.</a> Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).</li><li>Lech, M., Anders, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+lupus+nephritis.">The pathogenesis of lupus nephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).</li><li>Bagavant, H., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+kidney+disease+in+systemic+lupus+erythematosus.">Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus.</a> Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).</li><li>Li, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+autoantibody+clusters+that+best+predict+lupus+disease+activity+using+glomerular+proteome+arrays.">Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).</li><li>Arag&#243;n, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+biomarkers+in+lupus+nephritis.">Urinary biomarkers in lupus nephritis.</a> Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).</li><li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota.">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73 (2017).</li><li>Lu, T. -. S., Yiao, S. -. Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+biological+and+mechanical+variations+between+the+Lowry+versus+Bradford+method+for+protein+quantification.">Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).</li><li>Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+should+proteinuria+be+detected+and+measured.">How should proteinuria be detected and measured.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 46, 205-217 (2009).</li><li>Viswanathan, G., Upadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+proteinuria.">Assessment of proteinuria.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).</li><li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+outcomes+of+lupus+nephritis+with+tubulointerstitial+inflammation+and+scarring.">Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring.</a> Arthritis Care &amp; Research. 63 (6), 865-874 (2011).</li><li>Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bari&#233;ty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinuria+and+tubulointerstitial+lesions+in+lupus+nephritis.">Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis.</a> Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+B+cell-mediated+immune+responses+and+tubulointerstitial+inflammation+in+human+lupus+nephritis.">In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).</li><li>Schrezenmeier, E., Jayne, D., D&#246;rner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+B+Cells+and+plasma+cells+in+glomerular+diseases:+translational+perspectives.">Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).</li><li>Fitzgibbons, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+analytic+validation+of+immunohistochemical+assays:+Guideline+from+the+college+of+American+pathologists+pathology+and+laboratory+quality+center.">Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).</li><li>Lewis, M. J., Botto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+deficiencies+in+humans+and+animals:+links+to+autoimmunity.">Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity.</a> Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+renal+disease+in+MRL/lpr+mice+genetically+deficient+in+the+alternative+complement+pathway+factor+B.">Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B.</a> Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10+regulates+murine+lupus.">IL-10 regulates murine lupus.</a> Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).</li><li>Singh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+IL-4+and+STAT6+vs+STAT4+to+the+development+of+lupus+nephritis.">Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).</li><li>van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+targets+of+nephritogenic+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus.">Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).</li><li>Zuniga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+IgG+subclasses+and+C-reactive+protein+in+lupus+nephritis:+the+relationship+between+the+composition+of+immune+deposits+and+FCgamma+receptor+type+IIA+alleles.">Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).</li><li>Cabana-Puig, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+drift+in+lupus-prone+MRL/lpr+Mice:+potential+roles+of+micrornas+and+gut+microbiota.">Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota.</a> Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNaseI+treatment+is+a+prerequisite+for+the+amplification+of+cDNA+from+episomal-based+genes.">DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes.</a> Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).</li><li>Park, J. G. -., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+composition+in+normal+human+kidneys.">Immune cell composition in normal human kidneys.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining.">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li><li>Okutucu, B., D&#305;n&#231;er, A., Habib, &. #. 2. 1. 4. ;., Z&#305;hn&#305;oglu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+methods+for+determination+of+total+plasma+protein+concentration.">Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).</li></ol>

LN is een belangrijke doodsoorzaak bij SLE-patiënten en factoren die de ziekte verergeren, blijven onduidelijk. De toepassing van dit protocol is om de nierfunctie te karakteriseren met behulp van meerdere methoden, waaronder meting van proteïnurie, FACS-analyse van geïsoleerde nierleukocyten en immunofluorescentiekleuring van bevroren niersecties.
Een belangrijk punt om te overwegen bij het verzamelen van urine is dat men consistent moet zijn met het tijdstip van de dag en de locatie van u...

De primaire functie van de nier is de eliminatie van giftige stoffen via de urine met behoud van de homeostase van water en zouten1. Deze functie wordt bedreigd bij patiënten met systemische lupus erythematosus (SLE), wat leidt tot zogenaamde lupus nefritis (LN). LN is een gevolg van het immuunsysteem dat de nier aanvalt, wat leidt tot aanhoudende nierontsteking, waardoor het zijn vermogen verliest om afval uit het bloed te verwijderen en zout- en vloeistofconcentraties te reguleren. Dit zal uiteindelijk leiden tot nierfalen, wat fataal kan zijn. Tijdens het nefritische proces worden circulerende B-cellen, T-cellen en monocyten gerekruteerd naar de nier, waarbij chemokines, cytokines en immuuncomplexvormende auto-antilichamen worden afgescheiden. Dit resulteert uiteindelijk in endotheelcelbeschadiging, vliezige verwondingen, renale tubulaire atrofie en fibrose2.
MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) lupus-gevoelige muizen is een klassiek muismodel dat lupus-achtige klinische symptomen vertoont die lijken op menselijke SLE3. Dit model heeft een belangrijke rol gespeeld bij het begrijpen van een van de belangrijkste oorzaken van sterfte bij SLE-patiënten, lupus nefritis (LN)4. Bij zowel menselijke als muis SLE wordt LN gekenmerkt door geleidelijke ontsteking veroorzaakt door renale afzetting van immuuncomplexen, gevolgd door complementactivering, rekrutering van ontstekingscellen en verlies van nierfunctie5. De immuuncomplexafzetting is de eerste stap om chemokine- en cytokineproductie door intrinsieke niercellen te induceren, wat de ontstekingsreactie uitbreidt door immuuncellen te rekruteren6. Het huidige protocol presenteert verschillende technieken om de progressie van nierziekten te volgen die celinfiltratie en immuuncomplexafzetting analyseren.
Urine die elke week wordt verzameld, zorgt voor detectie en visualisatie van het tijdsverloop van proteïnurie vóór, tijdens en na het begin van lupus. Proteïnurie als biomarker kan de biologische progressie van LN bepalen. Andere voordelen van deze techniek zijn dat het niet-invasief, kostenefficiënt en eenvoudig te implementeren is7. Wanneer de nier perfect werkt, is het proteïnurieniveau constant laag; bij MRL/lpr-muizen wordt echter na een leeftijd van 8-9 weken een geleidelijke toename van het proteïnurieniveau waargenomen, dat uiteindelijk hoog genoeg is om nierfalen te veroorzaken8. Meerdere reagenstrips en colorimetrische reagentia zijn in de handel verkrijgbaar om het probleem te monitoren. De Bradford-test is echter goedkoop en zeer nauwkeurig bij het bepalen van het begin van proteïnurie en het beloop van lupus nefritis. Deze test is snel en het reagens wordt niet beïnvloed door de aanwezigheid van oplosmiddelen, buffers, reductiemiddelen en metaalchelaatmiddelen die zich in uw monster kunnen bevinden 9,10,11.
Een belangrijk aspect om te overwegen is celinfiltratie in de nier. Deze infiltraten bevorderen de pathogenese door de afscheiding van oplosbare factoren zoals cytokines te activeren om ontstekingen te verergeren12. Om beter te begrijpen welke celpopulaties aanwezig zijn in de infiltraten, is een nuttige methode om leukocyten te isoleren13. Hier wordt de detectie van renale infiltratie van B-cellen als voorbeeld gebruikt. De procedure begint met een verteringsproces met deoxyribonuclease (DNase) en collagenase, gevolgd door dichtheidsgradiëntscheiding die puin, rode bloedcellen en dichte granulocyten verwijdert. De reden voor het isoleren van B-cellen (CD19+) en plasmacellen (CD138+) is dat lupus nieren deze cellen kunnen concentreren14. Er wordt gesuggereerd dat de aanwezigheid van B-cellen in kleine aggregaten in de nier kan wijzen op klonale expansie en bijgevolg op immunoglobuline (Ig) productie. Van plasmacellen is bekend dat ze ook in deze aggregaten aanwezig zijn15. Zodra leukocyten zijn geïsoleerd, kan fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) worden gebruikt om de cellen van belang te analyseren bij kleuring met verschillende fluorescentie-geconjugeerde antilichamen.
Immunofluorescentie is een van de immunohistochemische (IHC) detectiemethoden die fluorescentie visualisatie van eiwitten in 4 μm dikke nierweefselmonsters mogelijk maakt. Andere IHC-detectiemethoden zijn afhankelijk van de aard van analyten, bindingschemie en andere factoren16. Immunofluorescentie is een snelle identificatiemethode die het antigeen blootstelt aan zijn tegenhanger antilichaam gelabeld met een specifiek fluorochroom (of een fluorescerende kleurstof). Wanneer het wordt geëxciteerd, produceert het licht dat een fluorescentiemicroscoop kan detecteren. Deze techniek kan worden gebruikt om de afzetting van complement C3 en IgG2a17 te observeren. Overmatige complementcascadeactivering kan worden geassocieerd met een ongecontroleerde immuunrespons en functieverlies18. Immuundepositie van anti-dubbelstrengs DNA (anti-dsDNA) auto-antilichamen in de nier is een grote zorg19, waar mensen met IgG2a isotype zijn geassocieerd met LN20. In het bijzonder vertonen anti-dsDNA-antilichamen meer pathogeniciteit en affiniteit met nucleaire materialen en vormen ze immuuncomplexen21. Wanneer IgG2a aanwezig is, wordt de complementcascade, inclusief C3, geactiveerd om de immuuncomplexen te verwijderen22. De C3- en IgG2a-markers kunnen afzonderlijk worden gekwantificeerd of eroverheen worden gelegd om hun correlatie vast te stellen.
Met name serumcreatininemeting is een andere betrouwbare techniek die samen met microscopische hematurie en nierbiopten kan worden gebruikt om LN23 te diagnosticeren. De aanwezigheid van proteïnurie is echter een sterke indicator van glomerulaire schade. In die zin kan het monitoren van het proteïnurieniveau tijdens lupus het begin van de ziekte detecteren en een aanvulling vormen op andere methoden voor het diagnosticeren van lupus. Bovendien kunnen immuuncomplexen die in glomeruli worden afgezet een ontstekingsreactie veroorzaken, het complementsysteem activeren en meer ontstekingscellen rekruteren. Een ander opmerkelijk punt van dit protocol is B-celinfiltratie in de nier. Dit, samen met de geïnfiltreerde T-cellen, versterkt lokale immuunresponsen die orgaanschade veroorzaken. Belangrijk is dat de classificatie van LN niet alleen gebaseerd is op glomerulaire morfologische veranderingen die worden waargenomen in microscopie, maar ook op immuunafzettingen waargenomen met immunofluorescentie. Daarom worden in dit protocol nauwkeurige en kosteneffectieve methoden voor de analyse van de nierfunctie aangeboden in laboratoriumomgevingen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J60764.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse C3</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL7632F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD138 BV711</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-212-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9511236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA-EC</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-ecdna</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 Microscope imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fusion Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>23272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail enamel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any conventional store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T compound</td>
			<td>Tisse-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>R-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 20x TBS Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Albumin standard included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLon Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>FcR block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.1 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell Strainers 100 &#181;M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin Hydrochloride</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>V-200-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>fluorescent dye for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice

Systemische lupus erythematosus (SLE) is een auto-immuunziekte zonder bekende genezing en wordt gekenmerkt door aanhoudende ontsteking in veel organen, waaronder de nieren. Onder dergelijke omstandigheden verliest de nier zijn vermogen om afval uit het bloed te verwijderen en zout- en vloeistofconcentraties te reguleren, wat uiteindelijk leidt tot nierfalen. Vrouwen, met name die in de vruchtbare leeftijd, worden negen keer vaker gediagnosticeerd dan mannen. Nierziekte is de belangrijkste doodsoorzaak bij SLE-patiënten. Het huidige protocol beschrijft een snelle en eenvoudige methode om uitgescheiden eiwitniveaus in verzamelde urine te meten, waarbij de progressie van lupus in de loop van de tijd wordt gevolgd. Daarnaast wordt een benadering geboden om mononucleaire niercellen te isoleren op basis van grootte en dichtheidsselectie om renale infiltratie van leukocyten te onderzoeken. Verder is een immunohistochemische methode ontwikkeld om eiwitafzetting in de glomeruli en leukocyteninfiltratie in de tubulo-interstitiële ruimte te karakteriseren. Samen kunnen deze methoden helpen bij het onderzoeken van de progressie van chronische ontsteking geassocieerd met de nieren van lupus-gevoelige MRL / lpr-muizen.

Het protocol maakt gebruik van meerdere methoden om MRL / lpr-muizen te beoordelen op lupus nefritis. Ten eerste wordt een procedure beschreven om verhoogde proteïnurieniveaus te bestuderen als gevolg van nierdisfunctie in de loop van de tijd. Zoals te zien is in figuur 1, werden vrouwelijke muizen behandeld met een oraal bereik van 200 μL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (1x PBS) als de controlegroep en probiotische Lactobacillus reuteri als de behandelingsgroep, in een concentra...

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

Het huidige protocol beschrijft een methode om lupusprogressie bij muizen te volgen. Twee aanvullende procedures worden gepresenteerd om lupus nefritis te karakteriseren op basis van celinfiltratie en eiwitafzetting in de nieren.

Analyses van proteïnurie, renale infiltratie van leukocyten en renale afzetting van eiwitten bij lupusgevoelige MRL / lpr-muizen

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Deze methoden kunnen helpen bij het onderzoeken van de progressie van chronische ontsteking geassocieerd met nieren bij lupuspatiënten. We bieden een betrouwbaar en kosteneffectief alternatief dat kan worden gebruikt om het ziekteverloop bij lupus te volgen. Begin met het steriliseren van de kap door 70% ethanol te spuiten en plaats een steriele plastic plaat op het oppervlak.Bereid vervolgens tips, buisjes van 1,5 milliliter en een pipet voor om ongeveer 20 microliter van de urine te verzamelen. Neem de kooi en spuit 70% ethanol voordat u deze in de kap plaatst. Houd daarna de muis met één hand vast en gebruik de andere hand om het ventrale gebied van boven naar beneden zachtjes te masseren.Gebruik een buis of pipet van 1,5 milliliter om de urine direct op te vangen. Of als de monsterdruppels het van het plastic vel verzamelen. Zet de muis vervolgens terug in de kooi.Snijd de ontleedde nieren in korrelgrootte en verteer in vijf milliliter digestiebuffer met Collagenase en DNase 1 in RPMI 1640 medium met HEPES gedurende één uur met continu zacht schudden bij 37 graden Celsius. Voeg 10 milliliter ijskoude PBS met 10 millimol EDTA toe en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Vervolgens vortex de suspensie twee keer.Filter later de celsuspensie door een zeef van 100 micrometer en was met 10 milliliter HBSS vol. Centrifugeer daarna op 350 maal G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Bereid een 30, 37 en 70% stock isotone Percoll oplossing en voeg een laag van 37% Percoll oplossing toe aan de 70% oplossing.Resuspensie de cellen in vijf milliliter van 30% voorraad isotone Percoll. Gebruik een Pasteur-pipet om langzaam 37% van vijf milliliter boven en 70% van vijf milliliter aan de onderkant te laden, waardoor stock isotone Percoll-gradiënt ontstaat. Centrifugeer vervolgens met nummer negen omhoog en nummer nul omlaag op 1000 keer G gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Verzamel daarna leukocyten uit de interface van 37 tot 70% en suspensie ze opnieuw in vijf milliliter C 10. Nogmaals, centrifugeer op 350 maal G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Vervolgens wordt de celpellet opnieuw gesuspendeerd in drie milliliter faxbuffer en gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius gecentrifugeerd bij 350 maal G.Gooi vervolgens het supernatant weg en laat ongeveer 50 microliter van het totale volume achter. Voeg 50 microliter FC-receptorblok per buis toe. Volg deze mix en incubeer op ijs in het donker gedurende 10 minuten.Voeg later twee milliliter faxbuffer toe om te wassen. Centrifugeer vervolgens op 350 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi de supernatent weg en laat ongeveer 50 microliter van het totale volume over. Voeg vervolgens 20 microliter van de juiste fluorescerende kleurstof toe en laat het 15 tot 30 minuten op ijs staan.Voeg 50 microliter antilichaammix toe per buis met CD 138 briljant violet zeven 11 en CD 45 Alexa Fluor 700 en incubeer op ijs in het donker gedurende 15 tot 30 minuten. Voeg daarna drie milliliter faxbuffer toe. Centrifugeer op 350 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Verwijder het supernatant door ongeveer 50 microliter van het totale volume vacuüm achter te laten. Later wordt de celpellet opnieuw gesuspendeerd in 200 microliter PBS. Om het monster te verzamelen, integreert u de halve nier in de kleine plastic cryomold met de optimale snijtemperatuurverbinding.Voeg vervolgens droogijs toe in een piepschuimdoos en plaats de cryomold voorzichtig bovenop het droogijs. Verwijder vervolgens de cryomold, wikkel deze in aluminiumfolie en bewaar deze bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik. Bevestig vervolgens de droge tot vier micrometer secties met koude aceton gedurende 10 minuten.Na het bevestigen van de dia's, aan de lucht drogen gedurende 0,5 tot een uur en bewaar ze op min 20 graden Celsius voor een korte tijd of min 80 graden Celsius voor een lange tijd. Om de monsters te kleuren, bevestigt u de dia's gedurende vijf tot 10 minuten opnieuw in koude aceton en laat u de secties opwarmen tot kamertemperatuur. Teken daarna met een dep een hydrofobe cirkel rond de sectie en laat deze drogen.Plaats vervolgens 20 minuten dia's in TBS in de Copeland-pot en schud zachtjes door de pot op de shaker te zetten. Giet vervolgens TBS af en vul de pot met TBS 5%BSA en 0,1%TW 20. Incubeer de pot later gedurende 20 minuten door zachtjes op de shaker te schudden.Haal vervolgens de dia's eruit en veeg de onderkant van de dia's schoon. Voeg 100 microliter geconjugeerde antilichamen C3 fit C en IgG2 APE toe aan de sectie en incubeer de kamertemperatuur in een bevochtigde kamer gedurende een uur. Was de sectie driemaal in PBS 5%BSA en 0,1%TW 20 gedurende 10 minuten op de shaker en schud vervolgens de dia's droog.Monteer de sectie met een anti-fade reagens en vervolgens met een afdekslip. Bewaar de dia's vervolgens op vier graden Celsius totdat ze onder de microscoop worden bekeken. Voor beeldanalyse met behulp van de image J-software, schetst u het gewenste gebied.Stel daarna standaardparameters in door op analyseren te klikken en stel vervolgens metingen in en meet het gebied om de resultaten te krijgen. Breng vervolgens de gegevens die zijn verkregen uit de metingsvensters over naar een spreadsheet. Als u klaar bent, klikt u op analyseren om de regio te meten en de gegevens opnieuw over te zetten naar de vorige spreadsheet.De eiwitniveaus in de urine van MRL LPR-muizen werden in de loop van de tijd gedetecteerd, waar ze werden behandeld met fosfaat gebufferde zoutoplossing als de controlegroep en lactobacillus reuteri als de behandelingsgroep. De muizengroep behandeld met L.reuteri met een agressievere proteïnurieprogressie dan de controlegroep. De faxanalyse werd uitgevoerd voor de geïsoleerde nierleukocyten om de plasmacellen te analyseren.Verder werden de muizen behandeld met vancomycine of vancomycine samen met Escherichia coli dubbelstrengs DNA. Hoewel Escherichia coli dubbelstrengs DNA naar verwachting de nierinfiltratie zou veroorzaken, werd er geen significant verschil gevonden in het percentage plasmacellen. Het complement C3 en IgG2a werden gedetecteerd door immunofluorescentiekleuring op vrouwelijke MRL IPR-niersecties.De effectieve omgevingsfactoren op de renale afzetting van C3 en IgG2a werden vergeleken voor het eigen muizenbrood in de dierenfaciliteit en die gekocht bij een leverancier. De immunohistochemische analyse toonde geen verschil tussen de twee groepen. Het toevoegen van elke laag van de iso 20 percoll-oplossing kan een uitdaging zijn, en als ze zich mengen, moet je opnieuw beginnen.Deze procedure helpt bij de flowcytometer en bij vitterexperimenten, dus je kunt de verschillende nierceltype populaties niet bestuderen. Deze procedure stelt ons in staat om de B-cellen infiltreert in de nieren te bestuderen en er is niet veel informatie in de literatuur.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolatie van Brain-infiltrerende leukocyten

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolatie en analyse van Brain-afgezonderd Leukocyten uit<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-geïnfecteerde muizen

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Cecal ligatie en punctie-geïnduceerde Sepsis als een model om Autophagy studie bij muizen

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Het analyseren van de effecten van stromale cellen op de recrutering van leukocyten van Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolatie van leukocyten uit de Human Maternal-foetale Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Selectief oogsten van Marginating-pulmonaire Leukocyten

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Selectief oogsten van Marginating-lever leukocyten

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypische karakterisering van macrofagen van Rat Kidney door flowcytometrie

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolaire lavage van meneuze longen om ontstekingscelinfiltratie te analyseren

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

Renale Subcapsulaire transplantatie van 2 '-Deoxyguanosine-behandelde Muriene embryonale Thymus in naakt muizen

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...