Name: analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Wir danken der Flow Cytometry Core Facility, dem Histopathology Laboratory, dem Fralin Imaging Center am Virginia Polytechnic Institute und der State University für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wird durch verschiedene NIH- und interne Zuschüsse unterstützt.

Das vorliegende Protokoll wird vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Virginia Tech genehmigt. Da die Lupuserkrankung bei Weibchen häufiger vorkommt, wurden nur weibliche MRL/lpr-Mäuse verwendet. Die Probenentnahme wurde im Alter von 4 Wochen begonnen und nach 15 Wochen beendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle) und wurden in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung gemäß den institutionellen Richtlinien gezüchtet und gehalten....

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LN ist eine der häufigsten Todesursachen bei SLE-Patienten, und Faktoren, die die Krankheit verschlimmern, bleiben unklar. Die Anwendung dieses Protokolls besteht darin, die Nierenfunktion mit mehreren Methoden zu charakterisieren, einschließlich der Messung der Proteinurie, der FACS-Analyse isolierter Nierenleukozyten und der Immunfluoreszenzfärbung von gefrorenen Nierenabschnitten.
Ein wichtiger Punkt, der beim Sammeln von Urin zu beachten ist, ist, dass man mit der Tageszeit und dem Ort ...

Die Hauptfunktion der Niere ist die Ausscheidung toxischer Substanzen durch den Urin unter Aufrechterhaltung der Homöostase von Wasser und Salzen1. Diese Funktion ist bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) bedroht, was zu einer sogenannten Lupusnephritis (LN) führt. LN ist eine Folge des Immunsystems, das die Niere angreift, was zu anhaltenden Nierenentzündungen führt und daher seine Fähigkeit verliert, Abfälle aus dem Blut zu entfernen und Salz- und Flüssigkeitskonzentrationen zu regulieren. Dies führt schließlich zu Nierenversagen, das tödlich sein kann. Während des nephritischen Prozesses werden zirkulierende B-Zellen, T-Zellen und Monozyten in die Niere rekrutiert und sezernieren Chemokine, Zytokine und immunkomplexbildende Autoantikörper. Dies führt letztendlich zu Endothelzellschäden, membranösen Verletzungen, renaler tubulärer Atrophie und Fibrose2.
MRL/Mp-Fas lpr (MRL/lpr) Lupus-anfällige Mäuse sind ein klassisches Mausmodell, das lupusähnliche klinische Symptome aufweist, die dem menschlichen SLE3 ähneln. Dieses Modell hat maßgeblich zum Verständnis einer der häufigsten Todesursachen bei SLE-Patienten, der Lupusnephritis (LN)4, beigetragen. Sowohl beim menschlichen als auch bei der Maus-SLE ist LN durch eine allmähliche Entzündung gekennzeichnet, die durch renale Ablagerung von Immunkomplexen ausgelöst wird, gefolgt von Komplementaktivierung, Rekrutierung von Entzündungszellen und Verlust der Nierenfunktion5. Die Immunkomplexablagerung ist der erste Schritt, um die Chemokin- und Zytokinproduktion durch intrinsische Nierenzellen zu induzieren, die die Entzündungsreaktion durch Rekrutierung von Immunzellen erweitert6. Das aktuelle Protokoll präsentiert mehrere Techniken, um das Fortschreiten der Nierenerkrankung zu verfolgen, die die Zellinfiltration und die Ablagerung von Immunkomplexen analysieren.
Der wöchentlich gesammelte Urin ermöglicht die Erkennung und Visualisierung des zeitlichen Verlaufs der Proteinurie vor, während und nach dem Beginn des Lupus. Proteinurie als Biomarker kann das biologische Fortschreiten von LN bestimmen. Weitere Vorteile dieser Technik sind, dass sie nicht-invasiv, kostengünstig und einfach zu implementieren ist7. Wenn die Niere perfekt funktioniert, ist der Proteinurie-Spiegel konstant niedrig; Bei MRL/LPR-Mäusen wird jedoch nach einem Alter von 8-9 Wochen ein allmählicher Anstieg des Proteinuriespiegels beobachtet, der schließlich hoch genug ist, um Nierenversagen zu verursachen8. Mehrere Reagenzienstreifen und kolorimetrische Reagenzien sind im Handel erhältlich, um das Problem zu überwachen. Der Bradford-Test ist jedoch billig und sehr genau bei der Bestimmung des Beginns der Proteinurie und des Verlaufs der Lupusnephritis. Dieser Assay ist schnell und das Reagenz wird nicht durch das Vorhandensein von Lösungsmitteln, Puffern, Reduktionsmitteln und Metallchelatbildnern beeinflusst, die sich in Ihrer Probe 9,10,11 befinden können.
Ein wichtiger zu berücksichtigender Aspekt ist die Zellinfiltration in der Niere. Diese Infiltrate fördern die Pathogenese, indem sie die Sekretion löslicher Faktoren wie Zytokine auslösen, um die Entzündung zu verschlimmern12. Um besser zu verstehen, welche Zellpopulationen in den Infiltraten vorhanden sind, ist eine nützliche Methode, Leukozyten zu isolieren13. Hier wird der Nachweis einer renalen Infiltration von B-Zellen als Beispiel verwendet. Das Verfahren beginnt mit einem Verdauungsprozess mit Desoxyribonuklease (DNase) und Kollagenase, gefolgt von einer Dichtegradiententrennung, die Trümmer, rote Blutkörperchen und dichte Granulozyten entfernt. Der Grund für die Isolierung von B-Zellen (CD19+) und Plasmazellen (CD138+) ist, dass Lupusnieren diese Zellen konzentrieren können14. Es wird vermutet, dass das Vorhandensein von B-Zellen in kleinen Aggregaten in der Niere auf eine klonale Expansion und folglich auf die Produktion von Immunglobulin (Ig) hinweisen kann. Es ist bekannt, dass Plasmazellen auch in diesen Aggregaten vorhanden sind15. Sobald Leukozyten isoliert wurden, kann die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) verwendet werden, um die interessierenden Zellen nach Färbung mit verschiedenen fluoreszenzkonjugierten Antikörpern zu analysieren.
Die Immunfluoreszenz ist eine der immunhistochemischen (IHC) Nachweismethoden, die eine fluoreszierende Visualisierung von Proteinen in 4 μm dicken Nierengewebeproben ermöglicht. Andere IHC-Nachweismethoden hängen von der Art der Analyten, der Bindungschemie und anderen Faktoren ab16. Immunfluoreszenz ist eine schnelle Identifizierungsmethode, bei der das Antigen seinem Gegenstück Antikörper ausgesetzt wird, der mit einem spezifischen Fluorochrom (oder einem Fluoreszenzfarbstoff) markiert ist. Wenn es angeregt wird, erzeugt es Licht, das ein Fluoreszenzmikroskop erkennen kann. Diese Technik kann verwendet werden, um die Ablagerung von Komplement C3 und IgG2a17 zu beobachten. Eine übermäßige Aktivierung der Komplementkaskade könnte mit einer unkontrollierten Immunantwort und einem Funktionsverlust in Verbindung gebracht werden18. Die Immunablagerung von Anti-Doppelstrang-DNA-Autoantikörpern (Anti-dsDNA) in der Niere ist ein Hauptanliegen19, wo diejenigen mit IgG2a-Isotyp mit LN20 assoziiert wurden. Insbesondere zeigen Anti-dsDNA-Antikörper mehr Pathogenität und Affinität zu Kernmaterialien und bilden Immunkomplexe21. Wenn IgG2a vorhanden ist, wird die Komplementkaskade, einschließlich C3, aktiviert, um die Immunkomplexezu beseitigen 22. Die C3- und IgG2a-Marker können einzeln quantifiziert oder überlagert werden, um ihre Korrelation herzustellen.
Insbesondere die Serumkreatininmessung ist eine weitere zuverlässige Technik, die zusammen mit mikroskopischer Hämaturie und Nierenbiopsien zur Diagnose von LN23 verwendet werden kann. Das Vorhandensein von Proteinurie ist jedoch ein starker Indikator für glomeruläre Schäden. In diesem Sinne kann die Überwachung des Proteinurie-Spiegels während Lupus den Ausbruch der Krankheit erkennen und andere Methoden zur Diagnose von Lupus ergänzen. Darüber hinaus können Immunkomplexe, die in Glomeruli abgelagert werden, eine Entzündungsreaktion auslösen, das Komplementsystem aktivieren und mehr Entzündungszellen rekrutieren. Ein weiterer bemerkenswerter Punkt dieses Protokolls ist die B-Zell-Infiltration in der Niere. Zusammen mit den infiltrierten T-Zellen verstärkt dies lokale Immunantworten, die Organschäden auslösen. Wichtig ist, dass die Klassifizierung von LN nicht nur auf glomerulären morphologischen Veränderungen basiert, die in der Mikroskopie beobachtet werden, sondern auch auf Immunablagerungen, die mit Immunfluoreszenz beobachtet werden. Daher werden in diesem Protokoll genaue und kostengünstige Methoden zur Analyse der Nierenfunktion im Labor angeboten.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J60764.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse C3</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL7632F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD138 BV711</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-212-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9511236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA-EC</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-ecdna</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 Microscope imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fusion Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>23272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail enamel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any conventional store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T compound</td>
			<td>Tisse-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>R-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 20x TBS Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Albumin standard included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLon Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>FcR block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.1 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell Strainers 100 &#181;M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin Hydrochloride</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>V-200-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>fluorescent dye for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice

Systemischer Lupus erythematodes (SLE) ist eine Autoimmunerkrankung ohne bekannte Heilung und ist durch anhaltende Entzündungen in vielen Organen, einschließlich der Nieren, gekennzeichnet. Unter solchen Umständen verliert die Niere ihre Fähigkeit, Abfälle aus dem Blut zu entfernen und die Salz- und Flüssigkeitskonzentrationen zu regulieren, was schließlich zu Nierenversagen führt. Frauen, insbesondere solche im gebärfähigen Alter, werden neunmal häufiger diagnostiziert als Männer. Nierenerkrankungen sind die häufigste Todesursache bei SLE-Patienten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine schnelle und einfache Methode zur Messung der ausgeschiedenen Proteinspiegel im gesammelten Urin und verfolgt das Fortschreiten des Lupus im Laufe der Zeit. Darüber hinaus wird ein Ansatz zur Isolierung mononukleärer Nierenzellen basierend auf der Auswahl von Größe und Dichte bereitgestellt, um die renale Infiltration von Leukozyten zu untersuchen. Darüber hinaus wurde eine immunhistochemische Methode entwickelt, um die Proteinablagerung in den Glomeruli und die Leukozyteninfiltration im tubulointerstitiellen Raum zu charakterisieren. Zusammen können diese Methoden helfen, das Fortschreiten chronischer Entzündungen im Zusammenhang mit den Nieren von Lupus-anfälligen MRL / lpr-Mäusen zu untersuchen.

Das Protokoll verwendet mehrere Methoden, um MRL / lpr-Mäuse auf Lupusnephritis zu untersuchen. Zunächst wird ein Verfahren beschrieben, um erhöhte Proteinuriespiegel aufgrund von Nierenfunktionsstörungen im Laufe der Zeit zu untersuchen. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurden weibliche Mäuse mit oraler Sonde von 200 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) als Kontrollgruppe und probiotischem Lactobacillus reuteri als Behandlungsgruppe in einer Konzentration von 109</...

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Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Verfolgung des Lupusverlaufs bei Mäusen. Zwei zusätzliche Verfahren werden vorgestellt, um die Lupusnephritis basierend auf Zellinfiltration und Proteinablagerung in den Nieren zu charakterisieren.

Analysen der Proteinurie, der renalen Infiltration von Leukozyten und der renalen Ablagerung von Proteinen bei zu Lupus neigenden MRL/lpr-Mäusen

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Diese Methoden können helfen, das Fortschreiten chronischer Nierenentzündungen bei Lupuspatienten zu untersuchen. Wir bieten eine zuverlässige und kostengünstige Alternative, mit der der Krankheitsverlauf bei Lupus überwacht werden kann. Beginnen Sie mit der Sterilisation der Haube, indem Sie 70% Ethanol sprühen und eine sterile Plastikfolie auf die Oberfläche legen.Dann bereiten Sie Spitzen, 1,5-Milliliter-Röhrchen und eine Pipette vor, um etwa 20 Mikroliter des Urins zu sammeln. Nehmen Sie den Käfig und sprühen Sie 70% Ethanol, bevor Sie ihn in die Haube legen. Danach halten Sie die Maus mit einer Hand und massieren mit der anderen Hand sanft den ventralen Bereich von oben nach unten.Sammeln Sie den Urin mit einem 1,5-Milliliter-Röhrchen oder einer Pipette direkt. Oder wenn die Probentropfen sie von der Plastikfolie sammeln. Setzen Sie dann die Maus wieder in den Käfig.Die sezierten Nieren in Korngröße schneiden und in fünf Milliliter Verdauungspuffer mit Kollagenase und DNase 1 in RPMI 1640 Medium mit HEPES für eine Stunde unter kontinuierlichem sanftem Schütteln bei 37 Grad Celsius verdauen. Fügen Sie 10 Milliliter eiskaltes PBS mit 10 Millimol EDTA hinzu und inkubieren Sie für 10 Minuten auf Eis. Dann wirbeln Sie die Aufhängung zweimal durch.Später filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 100-Mikrometer-Sieb und waschen Sie sie mit 10 Milliliter HBSS voll. Danach bei 350 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Bereiten Sie eine isotonische 30-, 37- und 70%ige Standard-Percoll-Lösung vor und fügen Sie eine Schicht 37%iger Percoll-Lösung auf die 70%ige Lösung auf.Resuspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter von 30% Standard-isotonischem Percoll. Mit einer Pasteur-Pipette werden langsam 37% von fünf Milliliter oben und 70% von fünf Milliliter unten geladen, wodurch ein isotonischer Percoll-Gradient entsteht. Dann zentrifugieren Sie mit oben Nummer neun und unten Nummer Null bei 1000 mal G für 30 Minuten bei Raumtemperatur.Danach sammeln Sie Leukozyten von der 37 bis 70%-Schnittstelle und suspendieren sie in fünf Milliliter C10. Auch hier zentrifugieren Sie bei 350 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Anschließend wird das Zellpellet in drei Milliliter Faxpuffer resuspendiert und bei 350 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.Dann verwerfen Sie den Überstand, der etwa 50 Mikroliter des Gesamtvolumens übrig lässt. Fügen Sie 50 Mikroliter FC-Rezeptorblock pro Röhrchen hinzu. Danach mischen und 10 Minuten auf Eis im Dunkeln inkubieren.Fügen Sie später zwei Milliliter Faxpuffer zum Waschen hinzu. Dann zentrifugieren Sie bei 350 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand, so dass etwa 50 Mikroliter des Gesamtvolumens übrig bleiben. Als nächstes fügen Sie 20 Mikroliter des entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffs hinzu und lassen Sie ihn 15 bis 30 Minuten auf Eis stehen.50 Mikroliter Antikörpermischung pro Röhrchen mit CD 138 brillantviolett sieben 11 und CD 45 Alexa Fluor 700 zugeben und 15 bis 30 Minuten auf Eis im Dunkeln inkubieren. Fügen Sie anschließend drei Milliliter Faxpuffer hinzu. Zentrifugieren bei 350 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie den Überstand durch Vakuum, wobei etwa 50 Mikroliter des Gesamtvolumens übrig bleiben. Später suspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter PBS. Um die Probe zu sammeln, betten Sie die halbe Niere in den kleinen Kunststoffkryomold mit der optimalen Schnitttemperaturverbindung ein.Dann Trockeneis in eine Styroporschaumbox geben und das Kryomold vorsichtig auf das Trockeneis legen. Als nächstes entfernen Sie die Kryoform, wickeln Sie sie in Aluminiumfolie und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Anschließend fixieren Sie die trockenen auf vier Mikrometer Abschnitte mit kaltem Aceton für 10 Minuten.Nach dem Befestigen der Dias 0,5 bis eine Stunde an der Luft trocknen und kurzzeitig bei minus 20 Grad Celsius oder lange bei minus 80 Grad Celsius lagern. Um die Proben zu färben, fixieren Sie die Objektträger für fünf bis 10 Minuten in kaltem Aceton und lassen Sie die Abschnitte auf Raumtemperatur erwärmen. Zeichnen Sie anschließend mit einem Klapsstift einen hydrophoben Kreis um den Abschnitt und lassen Sie ihn trocknen.Dann legen Sie die Dias in TBS für 20 Minuten in das Copeland-Glas und schütteln Sie vorsichtig, indem Sie das Glas auf den Shaker stellen. Anschließend TBS abgießen und das Glas mit TBS 5% BSA und 0,1% TW 20 füllen. Später inkubieren Sie das Glas für 20 Minuten, indem Sie leicht auf dem Shaker schütteln.Nehmen Sie dann die Folien heraus und wischen Sie die Unterseite der Folien ab. Fügen Sie 100 Mikroliter konjugierte Antikörper C3 fit C und IgG2 APE in den Abschnitt und inkubieren Sie die Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer für eine Stunde. Waschen Sie den Abschnitt dreimal in PBS 5% BSA und 0,1% TW 20 für 10 Minuten auf dem Shaker und schütteln Sie dann die Objektträger trocken.Montieren Sie den Abschnitt mit einem Anti-Fade-Reagenz und dann mit einem Abdeckglas. Dann lagern Sie die Objektträger bei vier Grad Celsius, bis sie unter dem Mikroskop betrachtet werden. Für die Bildanalyse mit der Image J-Software skizzieren Sie den gewünschten Bereich.Danach legen Sie Standardparameter fest, indem Sie auf Analysieren klicken, dann Messungen und Messbereich festlegen, um die Ergebnisse zu erhalten. Als nächstes übertragen Sie die aus den Messfenstern erhaltenen Daten in eine Tabelle. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Analysieren, um die Region zu messen und die Daten erneut in die vorherige Tabelle zu übertragen.Die Proteinspiegel im Urin von MRL LPR-Mäusen wurden im Laufe der Zeit nachgewiesen, wo sie mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung als Kontrollgruppe und Lactobacillus reuteri als Behandlungsgruppe behandelt wurden. Die Mäusegruppe behandelte mit L.reuteri eine aggressivere Proteinurie-Progression als die Kontrollgruppe. Die Faxanalyse wurde für die isolierten Nierenleukozyten durchgeführt, um die Plasmazellen zu analysieren.Weiterhin wurden die Mäuse mit Vancomycin oder Vancomycin zusammen mit Escherichia coli doppelsträngiger DNA behandelt. Obwohl erwartet wurde, dass Escherichia coli doppelsträngige DNA die Niereninfiltration auslöst, wurde kein signifikanter Unterschied im Prozentsatz der Plasmazellen gefunden. Die Komplemente C3 und IgG2a wurden durch Immunfluoreszenzfärbung an weiblichen MRL-IPR-Nierenabschnitten nachgewiesen.Die effektiven Umweltfaktoren auf die renale Ablagerung von C3 und IgG2a wurden für das hauseigene Mäusebrot in der Tierhaltung und das von einem Verkäufer gekaufte verglichen. Die immunhistochemische Analyse zeigte keinen Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Das Hinzufügen jeder Schicht der prozentualen ISO 20 Percoll-Lösung kann eine Herausforderung sein, und wenn sie gemischt werden, müssen Sie von vorne beginnen.Dieses Verfahren hilft beim Durchflusszytometer und in Vitter-Experimenten, so dass Sie die verschiedenen Nierenzelltypen von Populationen nicht untersuchen können. Dieses Verfahren ermöglicht es uns, die in den Nieren infiltrierten B-Zellen zu untersuchen, und es gibt nicht viele Informationen in der Literatur.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Blinddarm-Ligation und Punktion-induzierten Sepsis als Modell zur Autophagie in Mäusen untersucht

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analyse der Auswirkungen von Stromazellen an der Rekrutierung von Leukozyten von Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Selektive Ernte von Marginating-Lungen-Leukozyten

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Selektive Ernte von Marginating-Leber-Leukozyten

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Phänotypische Charakterisierung von Makrophagen aus Rattenniere mittels Durchflusszytometrie

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveoläre Lavage von murinen Lungen zur Analyse der entzündlichen Zellinfiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

Renale subkapsuläre Transplantation von 2'-Deoxyguanosin-behandeltem murineembryonenden Thymus bei nackten Mäusen

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...