Name: analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

אנו מודים למתקן הליבה של ציטומטריה של זרימה, למעבדה היסטופתולוגית, למרכז ההדמיה של פרלין במכון הפוליטכני של וירג'יניה ולאוניברסיטת המדינה על התמיכה הטכנית. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים שונים של NIH ומענקים פנימיים.

הפרוטוקול הנוכחי מאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בווירג'יניה טק. מאחר שלמחלת הזאבת יש שכיחות גבוהה יותר אצל נקבות, נעשה שימוש רק בנקבות עכברי MRL/lpr. איסוף הדגימות החל בגיל 4 שבועות והסתיים בגיל 15 שבועות. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים) וגוד?...

<ol>
	<li>Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Lupus+Erythematosus.">Systemic Lupus Erythematosus.</a> New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).</li><li>Davidson, A., Aranow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupus+nephritis:+lessons+from+murine+models.">Lupus nephritis: lessons from murine models.</a> Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).</li><li>Maldonado, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+environmental+antigens+in+the+spontaneous+development+of+autoimmunity+in+MRL-lpr+mice.">The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice.</a> Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).</li><li>Lech, M., Anders, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+lupus+nephritis.">The pathogenesis of lupus nephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).</li><li>Bagavant, H., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+kidney+disease+in+systemic+lupus+erythematosus.">Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus.</a> Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).</li><li>Li, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+autoantibody+clusters+that+best+predict+lupus+disease+activity+using+glomerular+proteome+arrays.">Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).</li><li>Arag&#243;n, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+biomarkers+in+lupus+nephritis.">Urinary biomarkers in lupus nephritis.</a> Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).</li><li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota.">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73 (2017).</li><li>Lu, T. -. S., Yiao, S. -. Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+biological+and+mechanical+variations+between+the+Lowry+versus+Bradford+method+for+protein+quantification.">Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).</li><li>Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+should+proteinuria+be+detected+and+measured.">How should proteinuria be detected and measured.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 46, 205-217 (2009).</li><li>Viswanathan, G., Upadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+proteinuria.">Assessment of proteinuria.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).</li><li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+outcomes+of+lupus+nephritis+with+tubulointerstitial+inflammation+and+scarring.">Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring.</a> Arthritis Care &amp; Research. 63 (6), 865-874 (2011).</li><li>Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bari&#233;ty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinuria+and+tubulointerstitial+lesions+in+lupus+nephritis.">Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis.</a> Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+B+cell-mediated+immune+responses+and+tubulointerstitial+inflammation+in+human+lupus+nephritis.">In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).</li><li>Schrezenmeier, E., Jayne, D., D&#246;rner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+B+Cells+and+plasma+cells+in+glomerular+diseases:+translational+perspectives.">Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).</li><li>Fitzgibbons, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+analytic+validation+of+immunohistochemical+assays:+Guideline+from+the+college+of+American+pathologists+pathology+and+laboratory+quality+center.">Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).</li><li>Lewis, M. J., Botto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+deficiencies+in+humans+and+animals:+links+to+autoimmunity.">Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity.</a> Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+renal+disease+in+MRL/lpr+mice+genetically+deficient+in+the+alternative+complement+pathway+factor+B.">Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B.</a> Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10+regulates+murine+lupus.">IL-10 regulates murine lupus.</a> Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).</li><li>Singh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+IL-4+and+STAT6+vs+STAT4+to+the+development+of+lupus+nephritis.">Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).</li><li>van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+targets+of+nephritogenic+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus.">Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).</li><li>Zuniga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+IgG+subclasses+and+C-reactive+protein+in+lupus+nephritis:+the+relationship+between+the+composition+of+immune+deposits+and+FCgamma+receptor+type+IIA+alleles.">Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).</li><li>Cabana-Puig, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+drift+in+lupus-prone+MRL/lpr+Mice:+potential+roles+of+micrornas+and+gut+microbiota.">Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota.</a> Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNaseI+treatment+is+a+prerequisite+for+the+amplification+of+cDNA+from+episomal-based+genes.">DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes.</a> Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).</li><li>Park, J. G. -., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+composition+in+normal+human+kidneys.">Immune cell composition in normal human kidneys.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining.">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li><li>Okutucu, B., D&#305;n&#231;er, A., Habib, &. #. 2. 1. 4. ;., Z&#305;hn&#305;oglu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+methods+for+determination+of+total+plasma+protein+concentration.">Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).</li></ol>

LN הוא גורם מוביל לתמותה בחולי SLE, והגורמים המחמירים את המחלה עדיין אינם ברורים. היישום של פרוטוקול זה הוא לאפיין את תפקוד הכליות באמצעות שיטות מרובות, כולל מדידה של פרוטאינוריה, ניתוח FACS של לויקוציטים בכליות מבודדות, והכתמה אימונופלואורסצנטית של מקטעי כליות קפואים.
נקודה חש...

תפקידה העיקרי של הכליה הוא חיסול חומרים רעילים באמצעות שתן תוך שמירה על הומאוסטזיס של מים ומלחים1. פונקציה זו מאוימת בחולים עם זאבת אדמנתית מערכתית (SLE), מה שמוביל למה שמכונה זאבת נפריטיס (LN). LN הוא תוצאה של מערכת החיסון התוקפת את הכליה, מה שמוביל לדלקת כליות מתמשכת, ולכן מאבד את יכולתו לנקות פסולת מהדם ולווסת את ריכוזי המלח והנוזלים. זה יוביל בסופו של דבר לאי ספיקת כליות, אשר יכול להיות קטלני. במהלך התהליך הנפריטי, תאי B במחזור, תאי T ומונוציטים מגויסים לכליה, ומפרישים כימוקינים, ציטוקינים ונוגדנים עצמיים יוצרי קומפלקס חיסוני. התוצאה היא בסופו של דבר נזק לתאי האנדותל, פציעות ממברניות, ניוון צינורית הכליה ופיברוזיס2.
עכברי MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) הנוטים לזאבת הם מודל עכברים קלאסי המציג סימנים קליניים דמויי זאבת הדומים ל-SLE3 אנושי. מודל זה סייע בהבנת אחד הגורמים המובילים לתמותה בחולי SLE, זאבת נפריטיס (LN)4. הן ב- SLE אנושי והן בעכבר, LN מאופיין בדלקת הדרגתית המופעלת על ידי תצהיר כלייתי של מתחמי חיסון, ואחריו הפעלה משלימה, גיוס תאי דלקת ואובדן תפקוד כלייתי5. תצהיר הקומפלקס החיסוני הוא הצעד הראשון להשראת ייצור כימוקין וציטוקינים על ידי תאי כליה פנימיים, המרחיבים את התגובה הדלקתית על ידי גיוס תאי חיסון6. הפרוטוקול הנוכחי מציג מספר טכניקות למעקב אחר התקדמות מחלת כליות המנתחות חדירת תאים ותצהיר קומפלקס חיסוני.
שתן שנאסף מדי שבוע מאפשר זיהוי והדמיה של מהלך הזמן של פרוטאינוריה לפני, במהלך ואחרי הופעת זאבת. פרוטאינוריה כסמן ביולוגי יכולה לקבוע את ההתקדמות הביולוגית של LN. יתרונות נוספים של טכניקה זו הם שהיא לא פולשנית, חסכונית וקלה ליישום7. כאשר הכליה פועלת בצורה מושלמת, רמת הפרוטאינוריה נמוכה באופן עקבי; עם זאת, בעכברי MRL/lpr, לאחר 8-9 שבועות של גיל, נצפתה עלייה הדרגתית של רמת הפרוטאינוריה, שבסופו של דבר גבוהה מספיק כדי לגרום לאי ספיקת כליות8. רצועות ריאגנטים מרובות וריאגנטים צבעוניים זמינים מסחרית לניטור הבעיה. עם זאת, מבחן ברדפורד הוא זול ומדויק מאוד בקביעת הופעת פרוטאינוריה ואת מהלך זאבת נפריטיס. בדיקה זו היא מהירה, והמגיב אינו מושפע מנוכחותם של ממסים, מאגרים, חומרים מחזרים וחומרים מטאליים שעשויים להיות במדגםשלך 9,10,11.
היבט חשוב אחד שיש לקחת בחשבון הוא חדירת תאים לכליה. חדירות אלה מקדמות פתוגנזה על ידי הפעלת הפרשת גורמים מסיסים כגון ציטוקינים כדי להחמיר את הדלקת12. כדי להבין טוב יותר אילו אוכלוסיות תאים נמצאות בחדירות, שיטה שימושית היא לבודד לויקוציטים13. כאן, זיהוי של חדירה כלייתית של תאי B משמש כדוגמה. ההליך מתחיל בתהליך עיכול עם deoxyribonuclease (DNase) ו collagenase, ואחריו הפרדת גרדיאנט צפיפות המסירה פסולת, כדוריות דם אדומות, גרנולוציטים צפופים. הסיבה לבידוד תאי B (CD19+) ותאי פלזמה (CD138+) היא שכליות זאבת יכולות לרכז את התאים האלה14. הוא הציע כי נוכחות של תאי B באגרגטים קטנים בכליה יכולה להצביע על התרחבות clonal, וכתוצאה מכך, ייצור אימונוגלובולין (Ig). ידוע כי תאי פלזמה נמצאים באגרגטים אלה גם15. לאחר בידוד לויקוציטים, ניתן להשתמש במיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) כדי לנתח את התאים המעניינים בעת צביעה בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים שונים.
אימונופלואורסצנציה היא אחת משיטות הזיהוי האימונוהיסטוכימיה (IHC) המאפשרת הדמיה פלואורסצנטית של חלבונים בדגימות רקמת כליה בעובי 4 מיקרומטר. שיטות גילוי IHC אחרות תלויות באופי האנליטים, בכימיה המחייבת ובגורמים אחרים16. אימונופלואורסצנציה היא שיטת זיהוי מהירה החושפת את האנטיגן לנוגדן מקבילו המסומן בפלואורוכרום ספציפי (או צבע פלואורסצנטי). כאשר הוא מתרגש, הוא מייצר אור שמיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול לזהות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבחון את התצהיר של משלים C3 ו IgG2a17. הפעלה מוגזמת של מפל משלים יכולה להיות קשורה לתגובה חיסונית בלתי מבוקרת ולאובדן תפקוד18. תצהיר חיסוני של נוגדנים עצמיים נגד דנ"א דו-גדילי (anti-dsDNA) בכליה הוא דאגה מרכזית19, כאשר אלה עם איזוטיפ IgG2a נקשרו ל-LN20. באופן ספציפי, נוגדנים נגד dsDNA מפגינים יותר פתוגניות וזיקה לחומרים גרעיניים, ויוצרים קומפלקסים חיסוניים21. כאשר IgG2a קיים, מפל המשלים, כולל C3, מופעל כדי לנקות את מתחמי החיסון22. ניתן לכמת את סמני C3 ו- IgG2a בנפרד או לכסות אותם כדי לבסס את המתאם ביניהם.
יש לציין כי מדידת קריאטינין בסרום היא טכניקה אמינה נוספת שניתן להשתמש בה יחד עם המטוריה מיקרוסקופית וביופסיות כליות לאבחון LN23. עם זאת, נוכחות של פרוטאינוריה היא אינדיקטור חזק של נזק גלומרולרי. במובן זה, ניטור רמת הפרוטאינוריה במהלך זאבת יכול לזהות התפרצות מחלה ולהשלים שיטות אחרות לאבחון זאבת. בנוסף, קומפלקסים חיסוניים שהופקדו glomeruli יכול לעורר תגובה דלקתית, להפעיל את מערכת המשלים, ולגייס תאים דלקתיים נוספים. נקודה נוספת ראויה לציון של פרוטוקול זה היא חדירת תאי B לכליה. זה, יחד עם תאי ה-T החודרים, מגביר את התגובות החיסוניות המקומיות שגורמות נזק לאיברים. חשוב לציין כי הסיווג של LN אינו מבוסס רק על שינויים מורפולוגיים גלומרולריים הנראים במיקרוסקופיה, אלא גם על משקעים חיסוניים שנצפו עם אימונופלואורסצנציה. לכן, בפרוטוקול זה, שיטות מדויקות וחסכוניות לניתוח תפקוד הכליות מוצעות במסגרות מעבדה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J60764.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse C3</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL7632F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD138 BV711</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-212-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9511236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA-EC</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-ecdna</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 Microscope imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fusion Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>23272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail enamel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any conventional store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T compound</td>
			<td>Tisse-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>R-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 20x TBS Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Albumin standard included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLon Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>FcR block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.1 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell Strainers 100 &#181;M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin Hydrochloride</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>V-200-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>fluorescent dye for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice

זאבת אדמנתית מערכתית (SLE) היא הפרעה אוטואימונית ללא תרופה ידועה ומאופיינת בדלקת מתמשכת באיברים רבים, כולל הכליות. בנסיבות כאלה, הכליה מאבדת את יכולתה לנקות פסולת מהדם ולווסת את ריכוזי המלח והנוזלים, מה שמוביל בסופו של דבר לאי ספיקת כליות. נשים, במיוחד אלה בגיל הפוריות, מאובחנות פי תשעה יותר מאשר גברים. מחלת כליות היא הגורם המוביל לתמותה בחולי SLE. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מהירה ופשוטה למדידת רמות החלבון המופרש בשתן שנאסף, תוך מעקב אחר התקדמות הזאבת לאורך זמן. בנוסף, גישה לבידוד תאים חד-גרעיניים בכליות מסופקת על בסיס בחירת גודל וצפיפות כדי לחקור חדירה כלייתית של לויקוציטים. יתר על כן, פותחה שיטה אימונוהיסטוכימית לאפיון תצהיר חלבונים בחדירת גלומרולי ולויקוציטים במרחב הטובולואינטרסטיציאלי. יחד, שיטות אלה יכולות לעזור לחקור את ההתקדמות של דלקת כרונית הקשורה לכליות של עכברי MRL/lpr המועדים לזאבת.

הפרוטוקול משתמש במספר שיטות כדי להעריך עכברי MRL/lpr עבור זאבת נפריטיס. ראשית, מתואר הליך לחקר רמות פרוטאינוריה מוגברות עקב תפקוד לקוי של הכליות לאורך זמן. כפי שמוצג באיור 1, נקבות עכברים טופלו בנטילת שתן פומית של 200 μL של מי מלח עם מאגרי פוספט (1x PBS) כקבוצת הביקורת ולקטובצילוס ...

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה למעקב אחר התקדמות זאבת בעכברים. שני הליכים נוספים מוצגים כדי לאפיין זאבת נפריטיס בהתבסס על חדירת תאים ותצהיר חלבון בכליות.

ניתוחים של פרוטאינוריה, חדירה כלייתית של לויקוציטים ותצהיר כלייתי של חלבונים בעכברי MRL/lpr המועדים לזאבת

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

שיטות אלה יכולות לעזור לחקור את ההתקדמות של דלקת כרונית הקשורה לכליות בחולי זאבת. אנו מציעים חלופה אמינה וחסכונית שניתן להשתמש בה כדי לפקח על מהלך המחלה בזאבת. התחילו לחטא את מכסה המנוע על ידי ריסוס 70% אתנול והניחו יריעת פלסטיק סטרילית על המשטח.לאחר מכן להכין טיפים, צינורות 1.5 מיליליטר פיפטה לאסוף כ 20 microliters של השתן. קח את הכלוב ורסס 70% אתנול לפני הנחתו בתוך מכסה המנוע. לאחר מכן, החזיקו את העכבר ביד אחת והשתמשו ביד השנייה כדי לעסות בעדינות את אזור הגחון מלמעלה למטה.באמצעות צינור 1.5 מיליליטר או פיפטה, לאסוף את השתן ישירות. או אם טיפות הדגימה אוספות אותו מיריעת הפלסטיק. ואז להחזיר את העכבר לכלוב.חותכים את הכליות המנותחות לגודל גרגר ומתעכלים בחמישה מיליליטר של חיץ עיכול המכיל קולגן ו-DNase 1 במדיום RPMI 1640 המכיל HEPES למשך שעה אחת עם טלטול עדין מתמשך בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים 10 מיליליטר של PBS קר כקרח המכיל 10 מילימולר של EDTA ודוגרים במשך 10 דקות על קרח. ואז מערבלים את ההשעיה פעמיים.מאוחר יותר, לסנן את תרחיף התא דרך מסננת 100 מיקרומטר ולשטוף עם 10 מיליליטר של HBSS מלא. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 350 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הכן תמיסת פרקול איזוטונית של 30, 37 ו-70% מלאי והוסף שכבה של תמיסת פרקול 37% על גבי תמיסת 70%.להשעות מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של 30% פרקול איזוטוני מניות. באמצעות פיפטה של פסטר נטען באיטיות 37% מחמישה מיליליטרים למעלה ו-70% מחמישה מיליליטר בתחתית, מה שהופך את המלאי לאיזוטוני פרקול הדרגתי. לאחר מכן, צנטריפוגה עם מספר תשע למעלה ומספר אפס למטה ב 1000 פעמים G במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, לאסוף לויקוציטים מן הממשק 37 עד 70% ולהשעות אותם מחדש בחמישה מיליליטר של C 10. שוב, צנטריפוגה ב 350 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן להשעות מחדש את כדור התא בשלושה מיליליטר של חיץ פקס צנטריפוגה ב 350 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן יש להשליך את הסופר-נאטנט ולהשאיר כ-50 מיקרוליטרים מהנפח הכולל. הוסף 50 מיקרוליטרים של בלוק קולטן FC לכל צינור. בעקבות תערובת זו דגירה על קרח בחושך במשך 10 דקות.מאוחר יותר, להוסיף שני מיליליטר של חיץ פקס לשטיפה. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 350 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatent משאיר כ 50 microliters של נפח הכולל. לאחר מכן, להוסיף 20 microliters של צבע פלואורסצנטי מתאים ולתת לו לעמוד במשך 15 עד 30 דקות על קרח.הוסיפו 50 מיקרוליטרים של תערובת נוגדנים לכל שפופרת המכילה CD 138 סגול מבריק שבעה 11 ו-CD 45 Alexa Fluor 700 ודגרו על קרח בחושך במשך 15 עד 30 דקות. לאחר מכן, הוסף שלושה מיליליטר של מאגר פקס. צנטריפוגה ב 350 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.הסר את supernatant על ידי ואקום משאיר כ 50 microliters של נפח הכולל. מאוחר יותר, להשעות מחדש את כדור התא ב 200 microliters של PBS. כדי לאסוף את הדגימה להטמיע את חצי הכליה בקריומולד הפלסטי הקטן עם תרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית.לאחר מכן הוסיפו קרח יבש לקופסת קצף פוליסטירן והניחו בזהירות את הקריומולד על גבי הקרח היבש. לאחר מכן, להסיר את cryomold, לעטוף אותו ברדיד אלומיניום ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. לאחר מכן לתקן את יבש ארבעה מיקרומטר חלקים עם אצטון קר במשך 10 דקות.לאחר תיקון השקופיות, יש לייבש באוויר למשך 0.5 עד שעה ולאחסן אותן במינוס 20 מעלות צלזיוס לזמן קצר או מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך זמן רב. כדי להכתים את הדגימות, החזירו את השקופיות באצטון קר למשך 5 עד 10 דקות ותנו למקטעים להתחמם לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בעזרת עט טפיחה, ציירו עיגול הידרופובי סביב הקטע ותנו לו להתייבש.לאחר מכן הניחו את השקופיות ב-TBS בצנצנת קופלנד למשך 20 דקות ונערו בעדינות על ידי הנחת הצנצנת על השייקר. לאחר מכן, לשפוך את TBS ולמלא את הצנצנת עם TBS 5% BSA ו 0.1% TW 20. לאחר מכן, דגרו את הצנצנת למשך 20 דקות על ידי ניעור עדין על השייקר.לאחר מכן, הוצא את השקופיות ומחק את החלק התחתון של השקופיות. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של נוגדנים מצומדים C3 מתאימים ל-C ול-IgG2 APE למקטע והדגירו את טמפרטורת החדר בתא לח למשך שעה. יש לשטוף את המקטע שלוש פעמים ב-PBS 5%BSA ו-0.1% TW 20 במשך 10 דקות על השייקר ולאחר מכן לנער את המגלשות.הרכב את הקטע עם מגיב נגד דהייה ולאחר מכן עם כיסוי להחליק. לאחר מכן אחסן את השקופיות בארבע מעלות צלזיוס עד לצפייה מתחת למיקרוסקופ. לניתוח תמונה באמצעות תוכנת Image J, התווה את האזור הרצוי.לאחר מכן, הגדר פרמטרים סטנדרטיים על ידי לחיצה על נתח ואז הגדר מדידות ומדידת שטח כדי לקבל את התוצאות. לאחר מכן, העבר את הנתונים המתקבלים מחלונות המדידה לגיליון אלקטרוני. לאחר שתסיים, לחץ על נתח כדי למדוד את האזור ולהעביר את הנתונים שוב לגיליון האלקטרוני הקודם.רמות החלבון בשתן של עכברי MRL LPR זוהו עם הזמן, שם הם טופלו עם פוספט חצץ מלח כקבוצת הביקורת ולקטובצילוס ראוטרי כקבוצת הטיפול. קבוצת העכברים שטופלה ב-L.reuteri בהתקדמות פרוטאינוריה אגרסיבית יותר מקבוצת הביקורת. ניתוח הפקס בוצע עבור לויקוציטים בכליות מבודדים כדי לנתח את תאי הפלזמה.יתר על כן, העכברים טופלו עם vancomycin או vancomycin יחד עם Escherichia coli דנ"א דו-גדילי. למרות שדנ"א דו-גדילי של Escherichia coli היה צפוי לגרום לחדירת הכליות, לא נמצא הבדל משמעותי באחוז תאי הפלזמה. המשלים C3 ו- IgG2a זוהו באמצעות כתמים אימונופלואורסצנטיים על מקטעי כליות MRL IPR נקבות.הגורמים הסביבתיים היעילים בתצהיר הכליות של C3 ו- IgG2a הושוו עבור לחם העכברים הפנימי במתקן החיות ואלה שנרכשו מספק. הניתוח האימונוהיסטוכימי לא הראה הבדל בין שתי הקבוצות. הוספת כל שכבה של פתרון ISO 20 Percoll באחוזים יכולה להיות מאתגרת, ואם הם מתערבבים אתה צריך להתחיל מחדש.הליך זה מסייע עם ציטומטר זרימה וניסויים in vitter, כך שאתה לא יכול לחקור את סוג תאי הכליה השונים של אוכלוסיות. הליך זה מאפשר לנו לחקור את החדירות של תאי B בכליות ואין הרבה מידע בספרות.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Cecal קשירת ונקר-Induced אלח דם כמודל ללמוד Autophagy בעכברים

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-ריאתי

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-כבדית

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

אפיון פנוטיפי של מקרופאגים כליה עכברוש ידי cytometry זרימה

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

ברונכאלווולאר של ריאות Murine כדי לנתח דלקת תאים דלקתית

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

הכליות Subcapsular ההשתלה של 2 '-Deoxyguanosine-התייחסו מורין מורנה בתימוס בעכברים ערומים

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...