Name: analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Ringraziamo la Flow Cytometry Core Facility, il Laboratorio di Istopatologia, il Fralin Imaging Center presso il Virginia Polytechnic Institute e la State University per il supporto tecnico. Questo lavoro è supportato da vari NIH e sovvenzioni interne.

Il presente protocollo è approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Virginia Tech. Poiché la malattia da lupus ha una maggiore incidenza nelle femmine, sono stati utilizzati solo topi MRL / lpr femmina. La raccolta del campione è iniziata a 4 settimane di età e terminata a 15 settimane. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) e sono stati allevati e mantenuti in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni seguendo le linee gui...

<ol>
	<li>Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Lupus+Erythematosus.">Systemic Lupus Erythematosus.</a> New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).</li><li>Davidson, A., Aranow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupus+nephritis:+lessons+from+murine+models.">Lupus nephritis: lessons from murine models.</a> Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).</li><li>Maldonado, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+environmental+antigens+in+the+spontaneous+development+of+autoimmunity+in+MRL-lpr+mice.">The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice.</a> Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).</li><li>Lech, M., Anders, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+lupus+nephritis.">The pathogenesis of lupus nephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).</li><li>Bagavant, H., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+kidney+disease+in+systemic+lupus+erythematosus.">Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus.</a> Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).</li><li>Li, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+autoantibody+clusters+that+best+predict+lupus+disease+activity+using+glomerular+proteome+arrays.">Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).</li><li>Arag&#243;n, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+biomarkers+in+lupus+nephritis.">Urinary biomarkers in lupus nephritis.</a> Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).</li><li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota.">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73 (2017).</li><li>Lu, T. -. S., Yiao, S. -. Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+biological+and+mechanical+variations+between+the+Lowry+versus+Bradford+method+for+protein+quantification.">Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).</li><li>Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+should+proteinuria+be+detected+and+measured.">How should proteinuria be detected and measured.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 46, 205-217 (2009).</li><li>Viswanathan, G., Upadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+proteinuria.">Assessment of proteinuria.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).</li><li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+outcomes+of+lupus+nephritis+with+tubulointerstitial+inflammation+and+scarring.">Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring.</a> Arthritis Care &amp; Research. 63 (6), 865-874 (2011).</li><li>Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bari&#233;ty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinuria+and+tubulointerstitial+lesions+in+lupus+nephritis.">Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis.</a> Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+B+cell-mediated+immune+responses+and+tubulointerstitial+inflammation+in+human+lupus+nephritis.">In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).</li><li>Schrezenmeier, E., Jayne, D., D&#246;rner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+B+Cells+and+plasma+cells+in+glomerular+diseases:+translational+perspectives.">Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).</li><li>Fitzgibbons, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+analytic+validation+of+immunohistochemical+assays:+Guideline+from+the+college+of+American+pathologists+pathology+and+laboratory+quality+center.">Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).</li><li>Lewis, M. J., Botto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+deficiencies+in+humans+and+animals:+links+to+autoimmunity.">Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity.</a> Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+renal+disease+in+MRL/lpr+mice+genetically+deficient+in+the+alternative+complement+pathway+factor+B.">Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B.</a> Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10+regulates+murine+lupus.">IL-10 regulates murine lupus.</a> Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).</li><li>Singh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+IL-4+and+STAT6+vs+STAT4+to+the+development+of+lupus+nephritis.">Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).</li><li>van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+targets+of+nephritogenic+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus.">Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).</li><li>Zuniga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+IgG+subclasses+and+C-reactive+protein+in+lupus+nephritis:+the+relationship+between+the+composition+of+immune+deposits+and+FCgamma+receptor+type+IIA+alleles.">Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).</li><li>Cabana-Puig, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+drift+in+lupus-prone+MRL/lpr+Mice:+potential+roles+of+micrornas+and+gut+microbiota.">Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota.</a> Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNaseI+treatment+is+a+prerequisite+for+the+amplification+of+cDNA+from+episomal-based+genes.">DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes.</a> Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).</li><li>Park, J. G. -., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+composition+in+normal+human+kidneys.">Immune cell composition in normal human kidneys.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining.">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li><li>Okutucu, B., D&#305;n&#231;er, A., Habib, &. #. 2. 1. 4. ;., Z&#305;hn&#305;oglu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+methods+for+determination+of+total+plasma+protein+concentration.">Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).</li></ol>

La LN è una delle principali cause di mortalità nei pazienti affetti da LES e i fattori che aggravano la malattia rimangono poco chiari. L'applicazione di questo protocollo è quella di caratterizzare la funzione renale utilizzando molteplici metodi, tra cui la misurazione della proteinuria, l'analisi FACS di leucociti renali isolati e la colorazione con immunofluorescenza di sezioni renali congelate.
Un punto importante da considerare durante la raccolta dell'urina è che si deve essere coe...

La funzione primaria del rene è l'eliminazione delle sostanze tossiche attraverso l'urina mantenendo l'omeostasi di acqua e sali1. Questa funzione è minacciata nei pazienti con lupus eritematoso sistemico (LES), che porta alla cosiddetta nefrite da lupus (LN). La LN è una conseguenza del sistema immunitario che attacca il rene, portando a un'infiammazione renale persistente, perdendo quindi la sua capacità di pulire i rifiuti dal sangue e regolare le concentrazioni di sale e liquidi. Questo alla fine porterà a insufficienza renale, che può essere fatale. Durante il processo nefritico, le cellule B circolanti, le cellule T e i monociti vengono reclutati nel rene, secernendo chemochine, citochine e autoanticorpi che formano complessi immunitari. Ciò alla fine si traduce in danno alle cellule endoteliali, lesioni membranose, atrofia tubulare renale e fibrosi2.
MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) topi inclini al lupus sono un modello murino classico che presenta segni clinici simili al lupus che assomigliano al LES umano3. Questo modello è stato determinante per comprendere una delle principali cause di mortalità nei pazienti affetti da LES, la nefrite da lupus (LN)4. Sia nel LES umano che in quello murino, la LN è caratterizzata da un'infiammazione graduale innescata dalla deposizione renale di immunocomplessi, seguita dall'attivazione del complemento, dal reclutamento di cellule infiammatorie e dalla perdita della funzionalità renale5. La deposizione di immunocomplessi è il primo passo per indurre la produzione di chemochine e citochine da parte delle cellule renali intrinseche, che espande la risposta infiammatoria reclutando cellule immunitarie6. L'attuale protocollo presenta diverse tecniche per seguire la progressione della malattia renale che analizzano l'infiltrazione cellulare e la deposizione di complessi immunitari.
L'urina raccolta ogni settimana consente il rilevamento e la visualizzazione del decorso temporale della proteinuria prima, durante e dopo l'insorgenza del lupus. La proteinuria come biomarcatore può determinare la progressione biologica dei LN. Altri vantaggi di questa tecnica sono che non è invasiva, economica e facile da implementare7. Quando il rene funziona perfettamente, il livello di proteinuria è costantemente basso; tuttavia, nei topi MRL/LPR, dopo 8-9 settimane di età, si osserva un graduale aumento del livello di proteinuria, che alla fine è abbastanza alto da causare insufficienza renale8. Strisce di reagenti multipli e reagenti colorimetrici sono disponibili in commercio per monitorare il problema. Tuttavia, il test di Bradford è economico e molto accurato nel determinare l'insorgenza della proteinuria e il decorso della nefrite da lupus. Questo test è rapido e il reagente non è influenzato dalla presenza di solventi, tamponi, agenti riducenti e agenti chelanti dei metalli che possono essere nel campione 9,10,11.
Un aspetto importante da considerare è l'infiltrazione cellulare nel rene. Questi infiltrati promuovono la patogenesi innescando la secrezione di fattori solubili come le citochine per peggiorare l'infiammazione12. Per capire meglio quali popolazioni cellulari sono presenti negli infiltrati, un metodo utile è quello di isolare i leucociti13. Qui, il rilevamento dell'infiltrazione renale delle cellule B viene utilizzato come esempio. La procedura inizia con un processo di digestione con desossiribonucleasi (DNasi) e collagenasi, seguito dalla separazione del gradiente di densità che rimuove detriti, globuli rossi e granulociti densi. La ragione per isolare le cellule B (CD19+) e le plasmacellule (CD138+) è che i reni lupus possono concentrare queste cellule14. Si suggerisce che la presenza di cellule B in piccoli aggregati nel rene possa indicare l'espansione clonale e, di conseguenza, la produzione di immunoglobuline (Ig). Le plasmacellule sono ben note per essere presenti anche in questi aggregati15. Una volta isolati i leucociti, la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) può essere utilizzata per analizzare le cellule di interesse dopo la colorazione con diversi anticorpi coniugati a fluorescenza.
L'immunofluorescenza è uno dei metodi di rilevamento dell'immunoistochimica (IHC) che consente la visualizzazione fluorescente delle proteine in campioni di tessuto renale spessi 4 μm. Altri metodi di rilevazione IHC dipendono dalla natura degli analiti, dalla chimica di legame e da altri fattori16. L'immunofluorescenza è un metodo di identificazione rapida che espone l'antigene alla sua controparte anticorpo marcato con uno specifico fluorocromo (o un colorante fluorescente). Quando è eccitato, produce luce che un microscopio a fluorescenza può rilevare. Questa tecnica può essere utilizzata per osservare la deposizione di complemento C3 e IgG2a17. Un'eccessiva attivazione a cascata del complemento potrebbe essere associata a una risposta immunitaria incontrollata e alla perdita di funzione18. La deposizione immunitaria di autoanticorpi anti-DNA a doppio filamento (anti-dsDNA) nel rene è una delle principali preoccupazioni19, dove quelli con isotipo IgG2a sono stati associati a LN20. In particolare, gli anticorpi anti-dsDNA mostrano maggiore patogenicità e affinità con i materiali nucleari, formando immunocomplessi21. Quando IgG2a è presente, la cascata del complemento, incluso C3, viene attivata per eliminare gli immunocomplessi22. I marcatori C3 e IgG2a possono essere quantificati singolarmente o sovrapposti per stabilire la loro correlazione.
In particolare, la misurazione della creatinina sierica è un'altra tecnica affidabile che può essere utilizzata insieme all'ematuria microscopica e alle biopsie renali per diagnosticare LN23. Tuttavia, la presenza di proteinuria è un forte indicatore di danno glomerulare. In questo senso, il monitoraggio del livello di proteinuria durante il lupus può rilevare l'insorgenza della malattia e integrare altri metodi per diagnosticare il lupus. Inoltre, gli immunocomplessi depositati nei glomeruli possono indurre una risposta infiammatoria, attivare il sistema del complemento e reclutare più cellule infiammatorie. Un altro punto degno di nota di questo protocollo è l'infiltrazione delle cellule B nel rene. Questo, insieme alle cellule T infiltrate, amplifica le risposte immunitarie locali che innescano danni agli organi. È importante sottolineare che la classificazione dei LN non si basa solo sui cambiamenti morfologici glomerulari osservati al microscopio, ma anche sui depositi immunitari osservati con l'immunofluorescenza. Pertanto, in questo protocollo, vengono offerti metodi accurati ed economici per l'analisi della funzionalità renale in ambienti di laboratorio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J60764.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse C3</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL7632F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD138 BV711</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-212-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9511236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA-EC</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-ecdna</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 Microscope imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fusion Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>23272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail enamel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any conventional store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T compound</td>
			<td>Tisse-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>R-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 20x TBS Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Albumin standard included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLon Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>FcR block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.1 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell Strainers 100 &#181;M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin Hydrochloride</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>V-200-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>fluorescent dye for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice

Il lupus eritematoso sistemico (LES) è una malattia autoimmune senza cura nota ed è caratterizzata da infiammazione persistente in molti organi, compresi i reni. In tali circostanze, il rene perde la sua capacità di pulire i rifiuti dal sangue e regolare le concentrazioni di sale e liquidi, portando infine a insufficienza renale. Le donne, in particolare quelle in età fertile, vengono diagnosticate nove volte più spesso degli uomini. La malattia renale è la principale causa di mortalità nei pazienti affetti da LES. Il presente protocollo descrive un metodo rapido e semplice per misurare i livelli di proteine escrete nelle urine raccolte, monitorando la progressione del lupus nel tempo. Inoltre, viene fornito un approccio per isolare le cellule mononucleate renali basato sulla selezione delle dimensioni e della densità per studiare l'infiltrazione renale dei leucociti. Inoltre, è stato sviluppato un metodo immunoistochimico per caratterizzare la deposizione proteica nei glomeruli e l'infiltrazione dei leucociti nello spazio tubulointerstiziale. Insieme, questi metodi possono aiutare a studiare la progressione dell'infiammazione cronica associata ai reni dei topi MRL / LPR inclini al lupus.

Il protocollo utilizza diversi metodi per valutare i topi MRL / lpr per la nefrite da lupus. In primo luogo, viene descritta una procedura per studiare l'aumento dei livelli di proteinuria a causa della disfunzione renale nel tempo. Come mostrato in Figura 1, topi femmina sono stati trattati con sonda gastrica orale di 200 μL di soluzione salina tamponata fosfato (1x PBS) come gruppo di controllo e probiotico Lactobacillus reuteri come gruppo di trattamento, ad una concentrazione d...

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

Il presente protocollo descrive un metodo per monitorare la progressione del lupus nei topi. Vengono presentate due procedure aggiuntive per caratterizzare la nefrite da lupus basate sull'infiltrazione cellulare e sulla deposizione di proteine nei reni.

Analisi della proteinuria, infiltrazione renale dei leucociti e deposizione renale di proteine in topi MRL/lpr inclini al lupus

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Questi metodi possono aiutare a studiare la progressione dell'infiammazione cronica associata ai reni nei pazienti con lupus. Offriamo un'alternativa affidabile ed economica che può essere utilizzata per monitorare il decorso della malattia nel lupus. Iniziare a sterilizzare il cappuccio spruzzando il 70% di etanolo e posizionare un foglio di plastica sterile sulla superficie.Quindi preparare punte, tubi da 1,5 millilitri e una pipetta per raccogliere circa 20 microlitri di urina. Prendi la gabbia e spruzza il 70% di etanolo prima di metterlo all'interno del cappuccio. Successivamente, tieni il mouse con una mano e usa l'altra mano per massaggiare delicatamente l'area ventrale dall'alto verso il basso.Utilizzando un tubo da 1,5 millilitri o una pipetta, raccogliere direttamente l'urina. O se le gocce del campione lo raccolgono dal foglio di plastica. Quindi rimetti il mouse nella gabbia.Tagliare i reni sezionati in granulometria e digerire in cinque millilitri di tampone di digestione contenente collagenasi e DNasi 1 in terreno RPMI 1640 contenente HEPES per un'ora con agitazione continua delicata a 37 gradi Celsius. Aggiungere 10 millilitri di PBS ghiacciato contenente 10 millimolari di EDTA e incubare per 10 minuti su ghiaccio. Quindi vortice la sospensione due volte.Successivamente, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 100 micrometri e lavare con 10 millilitri di HBSS pieno. Successivamente, centrifugare a 350 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Preparare una soluzione isotonica Percoll al 30, 37% e 70% e aggiungere uno strato di soluzione Percoll al 37% sopra la soluzione al 70%.Risospendere le cellule in cinque millilitri di 30% di Percoll isotonico di serie. Utilizzando una pipetta Pasteur caricare lentamente il 37% di cinque millilitri superiore e il 70% di cinque millilitri sul fondo, rendendo il gradiente Percoll isotonico di serie. Quindi, centrifugare con il numero nove e il numero zero a 1000 volte G per 30 minuti a temperatura ambiente.Successivamente, raccogliere i leucociti dall'interfaccia dal 37 al 70% e risospenderli in cinque millilitri di C 10. Anche in questo caso, centrifugare a 350 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente risospendere il pellet cellulare in tre millilitri di tampone fax e centrifugare a 350 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Quindi scartare il surnatante lasciando circa 50 microlitri del volume totale. Aggiungere 50 microlitri di blocco del recettore FC per provetta. Seguire questo mescolare e incubare sul ghiaccio al buio per 10 minuti.Successivamente, aggiungere due millilitri di buffer fax per il lavaggio. Quindi, centrifugare a 350 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante lasciando circa 50 microlitri del volume totale. Quindi, aggiungere 20 microlitri del colorante fluorescente appropriato e lasciare riposare per 15-30 minuti sul ghiaccio.Aggiungere 50 microlitri di miscela di anticorpi per tubo contenente CD 138 brilliant violet seven 11 e CD 45 Alexa Fluor 700 e incubare su ghiaccio al buio per 15-30 minuti. Successivamente, aggiungere tre millilitri di buffer fax. Centrifugare a 350 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Rimuovere il surnatante sottovuoto lasciando circa 50 microlitri del volume totale. Successivamente, risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di PBS. Per raccogliere il campione incorporare il mezzo rene nel piccolo criomold di plastica con il composto della temperatura di taglio ottimale.Quindi aggiungere ghiaccio secco in una scatola di polistirene espanso e posizionare con cura il criomold sopra il ghiaccio secco. Quindi, rimuovere il criostampo, avvolgerlo in un foglio di alluminio e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Quindi fissare l'asciutto a quattro sezioni micrometriche con acetone freddo per 10 minuti.Dopo aver fissato i vetrini, asciugare all'aria per 0,5 a un'ora e conservarli a meno 20 gradi Celsius per un breve periodo o meno 80 gradi Celsius per un lungo periodo. Per colorare i campioni, rifissare i vetrini in acetone freddo per cinque-10 minuti e lasciare che le sezioni si riscaldino a temperatura ambiente. Successivamente, usando una penna a pat, disegna un cerchio idrofobo attorno alla sezione e lasciala asciugare.Quindi posizionare i vetrini in TBS nel barattolo Copeland per 20 minuti e agitare delicatamente mettendo il barattolo sullo shaker. Successivamente, versare TBS e riempire il barattolo con TBS 5% BSA e 0,1% TW 20. Successivamente, incubare il barattolo per 20 minuti agitando delicatamente sullo shaker.Quindi, estrarre le diapositive e pulire la parte inferiore delle diapositive. Aggiungere 100 microlitri di anticorpi coniugati C3 fit C e IgG2 APE alla sezione e incubare la temperatura ambiente in una camera umidificata per un'ora. Lavare la sezione tre volte in PBS 5% BSA e 0,1% TW 20 per 10 minuti sullo shaker e quindi agitare asciugare i vetrini.Montare la sezione con un reagente anti-sbiadimento e poi con un vetrino di copertura. Quindi conservare i vetrini a quattro gradi Celsius fino alla visualizzazione al microscopio. Per l'analisi delle immagini utilizzando il software image J, delineare la regione desiderata.Successivamente, impostare i parametri standard facendo clic su analizza, quindi impostare le misurazioni e misurare l'area per ottenere i risultati. Quindi, trasferire i dati ottenuti dalle finestre di misura a un foglio di calcolo. Una volta fatto, fai clic su analizza per misurare la regione e trasferire nuovamente i dati sul foglio di calcolo precedente.I livelli di proteine nelle urine dei topi MRL LPR sono stati rilevati nel tempo in cui sono stati trattati con soluzione salina tamponata fosfato come gruppo di controllo e lactobacillus reuteri come gruppo di trattamento. Il gruppo di topi trattati con L.reuteri a una progressione della proteinuria più aggressiva rispetto al gruppo di controllo. L'analisi fax è stata eseguita per i leucociti renali isolati per analizzare le plasmacellule.Inoltre, i topi sono stati trattati con vancomicina o vancomicina insieme a DNA a doppio filamento di Escherichia coli. Sebbene ci si aspettasse che il DNA a doppio filamento di Escherichia coli inneschi l'infiltrazione renale, non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nella percentuale di plasmacellule. Il complemento C3 e IgG2a sono stati rilevati attraverso la colorazione con immunofluorescenza su sezioni renali MRL IPR femminili.I fattori ambientali effettivi sulla deposizione renale di C3 e IgG2a sono stati confrontati per il pane per topi interno nella struttura per animali e quelli acquistati da un fornitore. L'analisi immunoistochimica non ha mostrato alcuna differenza tra i due gruppi. L'aggiunta di ogni strato della soluzione percentuale ISO 20 Percoll può essere impegnativo e, se si mescolano, è necessario ricominciare da capo.Questa procedura aiuta con il citometro a flusso e negli esperimenti di Vitter, quindi non è possibile studiare i diversi tipi di cellule renali delle popolazioni. Questa procedura ci consente di studiare gli infiltrati delle cellule B nei reni e non ci sono molte informazioni in letteratura.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolamento di Brain-infiltrazione Leucociti

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA topi infettati

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Cecal legatura e la puntura indotta da sepsi come modello per studiare autofagia nei topi

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analizzando gli effetti delle cellule stromali per il reclutamento dei leucociti da portata

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

L&#39;isolamento dei leucociti di Human Interface materno-fetale

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

La raccolta selettiva di Marginating-polmonari leucociti

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

La raccolta selettiva di Marginating-epatiche leucociti

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Caratterizzazione fenotipica dei macrofagi dal rene di ratto mediante citometria di flusso

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Lavaggio broncoalveolare murini di polmoni per analizzare infiammatoria infiltrazione cellulare

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

Trapianto di subcapsulare renale di 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Topi Nudi

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...