Name: analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Vi takker Flow Cytometry Core Facility, Histopathology Laboratory, Fralin Imaging Center ved Virginia Polytechnic Institute og State University for teknisk støtte. Dette arbeidet støttes av ulike NIH og interne tilskudd.

Denne protokollen er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Virginia Tech. Siden lupussykdom har høyere forekomst hos kvinner, ble det kun brukt MRL/LPR-mus hos kvinner. Prøvesamlingen ble startet ved 4 ukers alder og avsluttet ved 15 uker. Musene ble hentet fra kommersielle kilder (se Materialtabell) og ble avlet og vedlikeholdt i et spesifikt patogenfritt miljø etter de institusjonelle retningslinjene.
1. Proteinuri test
<ol...

<ol>
	<li>Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Lupus+Erythematosus.">Systemic Lupus Erythematosus.</a> New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).</li><li>Davidson, A., Aranow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupus+nephritis:+lessons+from+murine+models.">Lupus nephritis: lessons from murine models.</a> Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).</li><li>Maldonado, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+environmental+antigens+in+the+spontaneous+development+of+autoimmunity+in+MRL-lpr+mice.">The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice.</a> Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).</li><li>Lech, M., Anders, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+lupus+nephritis.">The pathogenesis of lupus nephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).</li><li>Bagavant, H., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+kidney+disease+in+systemic+lupus+erythematosus.">Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus.</a> Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).</li><li>Li, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+autoantibody+clusters+that+best+predict+lupus+disease+activity+using+glomerular+proteome+arrays.">Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).</li><li>Arag&#243;n, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+biomarkers+in+lupus+nephritis.">Urinary biomarkers in lupus nephritis.</a> Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).</li><li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota.">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73 (2017).</li><li>Lu, T. -. S., Yiao, S. -. Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+biological+and+mechanical+variations+between+the+Lowry+versus+Bradford+method+for+protein+quantification.">Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).</li><li>Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+should+proteinuria+be+detected+and+measured.">How should proteinuria be detected and measured.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 46, 205-217 (2009).</li><li>Viswanathan, G., Upadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+proteinuria.">Assessment of proteinuria.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).</li><li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+outcomes+of+lupus+nephritis+with+tubulointerstitial+inflammation+and+scarring.">Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring.</a> Arthritis Care &amp; Research. 63 (6), 865-874 (2011).</li><li>Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bari&#233;ty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinuria+and+tubulointerstitial+lesions+in+lupus+nephritis.">Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis.</a> Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+B+cell-mediated+immune+responses+and+tubulointerstitial+inflammation+in+human+lupus+nephritis.">In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).</li><li>Schrezenmeier, E., Jayne, D., D&#246;rner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+B+Cells+and+plasma+cells+in+glomerular+diseases:+translational+perspectives.">Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).</li><li>Fitzgibbons, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+analytic+validation+of+immunohistochemical+assays:+Guideline+from+the+college+of+American+pathologists+pathology+and+laboratory+quality+center.">Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).</li><li>Lewis, M. J., Botto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+deficiencies+in+humans+and+animals:+links+to+autoimmunity.">Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity.</a> Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+renal+disease+in+MRL/lpr+mice+genetically+deficient+in+the+alternative+complement+pathway+factor+B.">Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B.</a> Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10+regulates+murine+lupus.">IL-10 regulates murine lupus.</a> Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).</li><li>Singh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+IL-4+and+STAT6+vs+STAT4+to+the+development+of+lupus+nephritis.">Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).</li><li>van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+targets+of+nephritogenic+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus.">Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).</li><li>Zuniga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+IgG+subclasses+and+C-reactive+protein+in+lupus+nephritis:+the+relationship+between+the+composition+of+immune+deposits+and+FCgamma+receptor+type+IIA+alleles.">Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).</li><li>Cabana-Puig, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+drift+in+lupus-prone+MRL/lpr+Mice:+potential+roles+of+micrornas+and+gut+microbiota.">Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota.</a> Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNaseI+treatment+is+a+prerequisite+for+the+amplification+of+cDNA+from+episomal-based+genes.">DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes.</a> Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).</li><li>Park, J. G. -., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+composition+in+normal+human+kidneys.">Immune cell composition in normal human kidneys.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining.">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li><li>Okutucu, B., D&#305;n&#231;er, A., Habib, &. #. 2. 1. 4. ;., Z&#305;hn&#305;oglu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+methods+for+determination+of+total+plasma+protein+concentration.">Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).</li></ol>

LN er en ledende dødsårsak hos SLE-pasienter, og faktorer som forverrer sykdommen er fortsatt uklare. Anvendelsen av denne protokollen er å karakterisere nyrefunksjonen ved hjelp av flere metoder, inkludert måling av proteinuri, FACS-analyse av isolerte nyreleukocytter og immunfluorescensfarging av frosne nyreseksjoner.
Et viktig poeng å vurdere når du samler urin er at man må være konsistent med tidspunktet på dagen og plasseringen av urinsamlingen. Mus er nattdyr, så de mest nøyak...

Nyrenes primære funksjon er eliminering av giftige stoffer gjennom urin samtidig som homeostase av vann ogsalter opprettholdes. Denne funksjonen er truet hos pasienter med systemisk lupus erythematosus (SLE), som fører til såkalt lupus nefritt (LN). LN er en konsekvens av at immunsystemet angriper nyrene, noe som fører til vedvarende nyrebetennelse, og mister derfor evnen til å rense avfall fra blodet og regulere salt- og væskekonsentrasjoner. Dette vil til slutt føre til nyresvikt, noe som kan være dødelig. Under den nefritiske prosessen rekrutteres sirkulerende B-celler, T-celler og monocytter til nyrene, utskiller kjemokiner, cytokiner og immunkompleksdannende autoantistoffer. Dette resulterer til slutt i endotelcelleskade, membranøse skader, nyretubulær atrofi og fibrose2.
MRL/Mp-Fas lpr (MRL/lpr) lupusutsatte mus er en klassisk musemodell som viser lupuslignende kliniske tegn som ligner menneskelig SLE3. Denne modellen har vært medvirkende til å forstå en av de viktigste årsakene til dødelighet hos SLE-pasienter, lupus nefritt (LN)4. I både human og mus SLE er LN preget av gradvis betennelse utløst av nyreavsetning av immunkomplekser, etterfulgt av komplementaktivering, rekruttering av inflammatoriske celler og tap av nyrefunksjon5. Immunkompleksavsetningen er det første skrittet for å indusere kjemokin- og cytokinproduksjon av inneboende nyreceller, som utvider den inflammatoriske responsen ved å rekruttere immunceller6. Den nåværende protokollen presenterer flere teknikker for å følge nyresykdomsprogresjon som analyserer celleinfiltrasjon og immunkompleksavsetning.
Urin samlet hver uke muliggjør deteksjon og visualisering av tidsforløpet av proteinuri før, under og etter lupusutbrudd. Proteinuri som biomarkør kan bestemme den biologiske progresjonen av LN. Andre fordeler med denne teknikken er at den er ikke-invasiv, kostnadseffektiv og enkel å implementere7. Når nyrene fungerer perfekt, er proteinurinivået konsekvent lavt; Hos MRL/LPR-mus, etter 8-9 ukers alder, observeres imidlertid en gradvis økning av proteinurinivået, som til slutt er høyt nok til å forårsake nyresvikt8. Flere reagensstrimler og kolorimetriske reagenser er kommersielt tilgjengelige for å overvåke problemet. Bradford-analysen er imidlertid billig og svært nøyaktig for å bestemme utbruddet av proteinuri og løpet av lupus nephritis. Denne analysen er rask, og reagenset påvirkes ikke av tilstedeværelsen av løsningsmidler, buffere, reduksjonsmidler og metallchelaterende midler som kan være i prøven 9,10,11.
Et viktig aspekt å vurdere er celleinfiltrasjon i nyrene. Disse infiltratratene fremmer patogenesen ved å utløse sekresjon av oppløselige faktorer som cytokiner for å forverre betennelse12. For bedre å forstå hvilke cellepopulasjoner som er tilstede i infiltratene, er en nyttig metode å isolere leukocytter13. Her brukes deteksjon av nyreinfiltrasjon av B-celler som et eksempel. Prosedyren begynner med en fordøyelsesprosess med deoksyribonuklease (DNase) og kollagenase, etterfulgt av tetthetsgradientseparasjon som fjerner rusk, røde blodlegemer og tette granulocytter. Årsaken til å isolere B-celler (CD19+) og plasmaceller (CD138+) er at lupus nyrer kan konsentrere disse cellene14. Det foreslås at tilstedeværelsen av B-celler i små aggregater i nyrene kan indikere klonal ekspansjon og følgelig immunoglobulin (Ig) produksjon. Plasmaceller er velkjente for å være til stede i disse aggregatene også15. Når leukocytter er isolert, kan fluorescensaktivert cellesortering (FACS) brukes til å analysere cellene av interesse ved farging med forskjellige fluorescenskonjugerte antistoffer.
Immunfluorescens er en av immunhistokjemi (IHC) deteksjonsmetoder som muliggjør fluorescerende visualisering av proteiner i 4 μm tykke nyrevevsprøver. Andre IHC-deteksjonsmetoder avhenger av arten av analytter, bindingskjemi og andre faktorer16. Immunfluorescens er en rask identifikasjonsmetode som utsetter antigenet for dets motpartsantistoff merket med et spesifikt fluorokrom (eller et fluorescerende fargestoff). Når den er opphisset, produserer den lys som et fluorescensmikroskop kan oppdage. Denne teknikken kan brukes til å observere avsetningen av komplement C3 og IgG2a17. Overdreven komplementkaskadeaktivering kan være forbundet med en ukontrollert immunrespons og tap av funksjon18. Immunavsetning av anti-dobbeltstrenget DNA (anti-dsDNA) autoantistoffer i nyrene er en stor bekymring19, hvor de med IgG2a isotype har vært assosiert med LN20. Spesielt viser anti-dsDNA-antistoffer mer patogenitet og affinitet til nukleære materialer, og danner immunkomplekser21. Når IgG2a er tilstede, aktiveres komplementkaskaden, inkludert C3, for å fjerne immunkompleksene22. C3- og IgG2a-markørene kan kvantifiseres individuelt eller overlappes for å fastslå korrelasjonen.
Spesielt er serumkreatininmåling en annen pålitelig teknikk som kan brukes sammen med mikroskopisk hematuri og nyrebiopsier for å diagnostisere LN23. Tilstedeværelsen av proteinuri er imidlertid en sterk indikator på glomerulær skade. I den forstand kan overvåking av proteinurinivået under lupus oppdage sykdomsutbrudd og utfylle andre metoder for å diagnostisere lupus. I tillegg kan immunkomplekser avsatt i glomeruli indusere en inflammatorisk respons, aktivere komplementsystemet og rekruttere flere inflammatoriske celler. Et annet bemerkelsesverdig poeng med denne protokollen er B-celleinfiltrasjon i nyrene. Dette, sammen med de infiltrerte T-cellene, forsterker lokale immunresponser som utløser organskade. Det er viktig at klassifiseringen av LN ikke bare er basert på glomerulære morfologiske endringer sett i mikroskopi, men også immunavsetninger observert med immunfluorescens. Derfor, i denne protokollen, tilbys nøyaktige og kostnadseffektive metoder for analyse av nyrefunksjon i laboratorieinnstillinger.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J60764.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse C3</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL7632F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD138 BV711</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-212-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9511236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA-EC</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-ecdna</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 Microscope imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fusion Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>23272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail enamel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any conventional store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T compound</td>
			<td>Tisse-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>R-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 20x TBS Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Albumin standard included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLon Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>FcR block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.1 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell Strainers 100 &#181;M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin Hydrochloride</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>V-200-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>fluorescent dye for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice

Systemisk lupus erythematosus (SLE) er en autoimmun lidelse uten kjent kur og er preget av vedvarende betennelse i mange organer, inkludert nyrene. Under slike omstendigheter mister nyrene sin evne til å rense avfall fra blodet og regulere salt- og væskekonsentrasjoner, noe som til slutt fører til nyresvikt. Kvinner, spesielt de i fertil alder, diagnostiseres ni ganger oftere enn menn. Nyresykdom er den viktigste årsaken til dødelighet hos SLE-pasienter. Denne protokollen beskriver en rask og enkel metode for å måle utskilte proteinnivåer i innsamlet urin, og spore lupusprogresjon over tid. I tillegg er en tilnærming til å isolere mononukleære nyreceller gitt basert på størrelse og tetthetsvalg for å undersøke nyreinfiltrasjon av leukocytter. Videre er det utviklet en immunhistokjemisk metode for å karakterisere proteinavsetning i glomeruli- og leukocyttinfiltrasjon i tubulointerstitiell plass. Sammen kan disse metodene bidra til å undersøke utviklingen av kronisk betennelse assosiert med nyrene til lupus-utsatte MRL / lpr-mus.

Protokollen bruker flere metoder for å vurdere MRL / lpr mus for lupus nefritt. Først beskrives en prosedyre for å studere økte proteinurinivåer på grunn av nyresvikt over tid. Som vist i figur 1 ble hunnmus behandlet med oral gavage på 200 μL fosfatbufret saltvann (1x PBS) som kontrollgruppe og probiotisk Lactobacillus reuteri som behandlingsgruppe, i en konsentrasjon på 109 cfu/ml, to ganger i uken. Behandlingen startet ved 3 ukers alder og avsluttet ved 15 uke...

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

Den nåværende protokollen beskriver en metode for å spore lupusprogresjon hos mus. Ytterligere to prosedyrer presenteres for å karakterisere lupus nefritt basert på celleinfiltrasjon og proteinavsetning i nyrene.

Analyser av proteinuri, renal infiltrasjon av leukocytter og nyreavsetning av proteiner i lupusutsatt MRL/lpr-mus

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Disse metodene kan bidra til å undersøke utviklingen av kronisk betennelse assosiert med nyrer i lupus pasienter. Vi tilbyr et pålitelig og kostnadseffektivt alternativ som kan brukes til å overvåke sykdomsforløpet i lupus. Begynn å sterilisere hetten ved å sprøyte 70% etanol og legg et sterilt plastark på overflaten.Forbered deretter tips, 1,5 milliliter rør og en pipette for å samle ca. 20 mikroliter urin. Ta buret og spray 70% etanol før du plasserer det inne i hetten. Etterpå holder du musen med den ene hånden og bruker den andre hånden til å forsiktig massere ventralområdet fra topp til bunn.Bruk et 1,5 milliliter rør eller pipette, samle urinen direkte. Eller hvis prøven faller samle den fra plastplaten. Sett deretter musen tilbake i buret.Skjær de dissekerte nyrene i kornstørrelse og fordøy i fem milliliter fordøyelsesbuffer som inneholder kollagenase og DNase 1 i RPMI 1640 medium som inneholder HEPES i en time med kontinuerlig mild risting ved 37 grader Celsius. Tilsett 10 ml iskald PBS som inneholder 10 millimolar EDTA og inkuber i 10 minutter på is. Deretter vortex suspensjonen to ganger.Senere filtrerer du cellesuspensjonen gjennom en 100 mikrometer sil og vasker med 10 ml HBSS full. Etterpå sentrifuger ved 350 ganger G i 10 minutter ved romtemperatur. Forbered en 30, 37 og 70% lager isotonisk Percoll-løsning og legg til et lag med 37% Percoll-løsning på toppen av 70%-løsningen.Re suspendere cellene i fem milliliter av 30% lager isotonisk Percoll. Ved hjelp av en Pasteur pipette sakte laste 37% av fem milliliter topp og 70% av fem milliliter på bunnen, noe som gjør lager isotonisk Percoll gradient. Sentrifuger deretter med opp nummer ni og ned nummer null ved 1000 ganger G i 30 minutter ved romtemperatur.Etterpå samler du leukocytter fra 37 til 70% grensesnittet og suspenderer dem i fem milliliter C 10. Igjen, sentrifuger ved 350 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Deretter suspendere cellepelleten i tre milliliter faksbuffer og sentrifuge ved 350 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius.Kast deretter supernatanten og la omtrent 50 mikroliter av totalvolumet. Tilsett 50 mikroliter FC-reseptorblokk per rør. Etter denne blandingen og inkuber på is i mørket i 10 minutter.Senere legger du til to milliliter faksbuffer for vasking. Sentrifuger deretter ved 350 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius og kast supernatenten og etterlater ca. 50 mikroliter av totalvolumet. Deretter tilsettes 20 mikroliter av riktig fluorescerende fargestoff og la det stå i 15 til 30 minutter på is.Tilsett 50 mikroliter antistoffblanding per rør som inneholder CD 138 briljant fiolett syv 11 og CD 45 Alexa Fluor 700 og rug på is i mørket i 15 til 30 minutter. Etterpå legger du til tre milliliter faksbuffer. Sentrifuge ved 350 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius.Fjern supernatanten ved vakuum og etterlat ca. 50 mikroliter av totalvolumet. Senere, suspendere cellepelleten i 200 mikroliter PBS. For å samle prøven, legg den halve nyren i den lille plastkryommen med den optimale skjæretemperaturforbindelsen.Tilsett deretter tørris i en isoporskumboks og legg kryommen forsiktig på toppen av tørrisen. Fjern deretter kryommet, pakk det inn i aluminiumsfolie og oppbevar det ved minus 80 grader Celsius til videre bruk. Fest deretter de tørre til fire mikrometerseksjonene med kald aceton i 10 minutter.Etter å ha festet lysbildene, luft tørk i 0,5 til en time og oppbevar dem ved minus 20 grader Celsius i kort tid eller minus 80 grader Celsius i lang tid. For å flekke prøvene, fest lysbildene i kald aceton i fem til 10 minutter og la seksjonene varmes opp til romtemperatur. Etterpå, bruk en klapppenn, tegn en hydrofob sirkel rundt seksjonen og la den tørke.Legg deretter lysbilder i TBS i Copeland-krukken i 20 minutter og rist forsiktig ved å sette krukken på shakeren. Hell deretter TBS og fyll krukken med TBS 5% BSA og 0,1% TW 20. Senere, inkuber krukken i 20 minutter ved å riste forsiktig på shakeren.Ta deretter lysbildene ut og tørk bunnen av lysbildene. Tilsett 100 mikroliter konjugerte antistoffer C3 fit C og IgG2 APE til seksjonen og inkuber romtemperatur i et fuktet kammer i en time. Vask seksjonen tre ganger i PBS 5% BSA og 0,1% TW 20 i 10 minutter på shakeren og rist deretter skliene.Monter seksjonen med et anti-fade reagens og deretter med en dekselslipp. Oppbevar deretter lysbildene ved fire grader Celsius til du ser under mikroskopet. For bildeanalyse ved hjelp av bildet J-programvaren, skissere ønsket region.Etterpå angir du standardparametere ved å klikke på analyser og deretter angi målinger og måleområde for å få resultatene. Deretter overfører du dataene som er hentet fra målevinduene til et regneark. Når du er ferdig, klikker du på analyser for å måle regionen og overføre dataene igjen til forrige regneark.Proteinnivåene i urinen hos MRL LPR-mus ble påvist over tid der de ble behandlet med fosfatbufret saltvann som kontrollgruppe og lactobacillus reuteri som behandlingsgruppe. Musgruppen behandlet med L.reuteri ved en mer aggressiv proteinuriprogresjon enn kontrollgruppen. Faksanalysen ble utført for de isolerte nyreleukocyttene for å analysere plasmacellene.Videre ble musene behandlet med vancomycin eller vancomycin sammen med Escherichia coli dobbeltstrenget DNA. Selv om dobbeltstrenget DNA fra Escherichia coli var forventet å utløse nyreinfiltrasjonen, ble det ikke funnet noen signifikant forskjell i prosentandelen plasmaceller. Komplement C3 og IgG2a ble påvist ved immunfluorescensfarging på kvinnelige MRL IPR nyreseksjoner.De effektive miljøfaktorene på nyreavsetning av C3 og IgG2a ble sammenlignet for det interne musebrødet i dyreanlegget og de som ble kjøpt fra en leverandør. Den immunhistokjemiske analysen viste ingen forskjell mellom de to gruppene. Det kan være utfordrende å legge til hvert lag av prosentandelen ISO 20 Percoll-løsning, og hvis de blander seg, må du starte på nytt.Denne prosedyren hjelper med flowcytometeret og i vittereksperimenter, slik at du ikke kan studere de forskjellige nyrecelletypene av populasjoner. Denne prosedyren lar oss studere B-cellenes infiltrater i nyrene, og det er ikke mye informasjon i litteraturen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolering og analyse av Brain-sequestered Leukocytter fra<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infiserte mus

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Cecal hemorroider og punkterings indusert Sepsis som en modell for å studere Autophagy i Mus

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analysere effekten av stromalceller på rekruttering av leukocytter fra Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolering av leukocytter fra Human Maternal-foster Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Selektiv Høsting av Marginating-lunge Leukocytter

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Selektiv Høsting av Marginating-lever Leukocytter

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypisk Karakterisering av makrofager fra Rat Nyre ved flowcytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage av Murine Lunger å analysere inflammatorisk celleinfiltrasjon

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

Renal Subcapsular transplantasjon av 2 '-Deoxyguanosine-behandlet murine embryonale thymus i Nude mus

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...