Name: analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Agradecemos ao Centro de Citometria de Fluxo, ao Laboratório de Histopatologia, ao Centro de Imagem Fralin do Instituto Politécnico da Virgínia e à Universidade Estadual pelo apoio técnico. Este trabalho é apoiado por várias subvenções internas e do NIH.

O presente protocolo é aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Virginia Tech. Como a doença de lúpus tem maior incidência em fêmeas, apenas os camundongos femininos mrl/lpr foram utilizados. A coleta de amostras foi iniciada com 4 semanas de idade e terminada com 15 semanas. Os camundongos foram obtidos a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) e foram criados e mantidos em um ambiente específico livre de patógenos seguindo as diretrizes institucio...

<ol>
	<li>Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Lupus+Erythematosus.">Systemic Lupus Erythematosus.</a> New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).</li><li>Davidson, A., Aranow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupus+nephritis:+lessons+from+murine+models.">Lupus nephritis: lessons from murine models.</a> Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).</li><li>Maldonado, M. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNaseI+treatment+is+a+prerequisite+for+the+amplification+of+cDNA+from+episomal-based+genes.">DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes.</a> Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).</li><li>Park, J. G. -., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+composition+in+normal+human+kidneys.">Immune cell composition in normal human kidneys.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining.">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li><li>Okutucu, B., D&#305;n&#231;er, A., Habib, &. #. 2. 1. 4. ;., Z&#305;hn&#305;oglu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+methods+for+determination+of+total+plasma+protein+concentration.">Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).</li></ol>

A LN é uma das principais causas de mortalidade em pacientes com SLE, e os fatores que agravam a doença permanecem incertos. A aplicação deste protocolo é caracterizar a função renal utilizando múltiplos métodos, incluindo medição de proteinúria, análise FACS de leucócitos renais isolados e coloração de imunofluorescência de seções renais congeladas.
Um ponto importante a considerar durante a coleta de urina é que é preciso ser consistente com a hora do dia e a localizaç?...

A função primária do rim é a eliminação de substâncias tóxicas através da urina, mantendo a homeostase da água e sais1. Esta função está ameaçada em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (SLE), levando à chamada nefrite lúpus (LN). A LN é uma consequência do sistema imunológico atacar o rim, levando a inflamações renais persistentes, perdendo assim sua capacidade de limpar resíduos do sangue e regular concentrações de sal e fluidos. Isso eventualmente levará à insuficiência renal, que pode ser fatal. Durante o processo nefrástico, células B circulantes, células T e monócitos são recrutados para o rim, secretando quimiocinas, citocinas e autoanticorpos de formação de complexos imunológicos. Isso resulta em danos nas células endoteliais, lesões membranous, atrofia tubular renal e fibrose2.
MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) é um modelo clássico de rato que exibe sinais clínicos semelhantes ao lúpus que se assemelham ao SLE3 humano. Este modelo tem sido fundamental na compreensão de uma das principais causas de mortalidade em pacientes com SLE, a nefrite lúpus (LN)4. Tanto no SLE humano quanto no camundongo, a LN é caracterizada por inflamação gradual desencadeada pela deposição renal de complexos imunológicos, seguida de ativação complementar, recrutamento de células inflamatórias e perda da função renal5. A deposição do complexo imunológico é o primeiro passo para induzir a produção de quimiocina e citocinas por células renais intrínsecas, o que expande a resposta inflamatória recrutando células imunes6. O protocolo atual apresenta várias técnicas para acompanhar a progressão da doença renal que analisam a infiltração celular e a deposição do complexo imunológico.
A urina coletada toda semana permite a detecção e visualização do curso de tempo de proteinúria antes, durante e depois do início do lúpus. Proteinúria como biomarcador pode determinar a progressão biológica da LN. Outras vantagens dessa técnica são que ela é não invasiva, econômica e fácil de implementar7. Quando o rim está funcionando perfeitamente, o nível de proteinúria é consistentemente baixo; no entanto, em camundongos MRL/lpr, após 8-9 semanas de idade, observa-se um aumento gradual do nível de proteinúria, que eventualmente é alto o suficiente para causar insuficiência renal8. Várias tiras de reagente e reagentes colorimétricos estão disponíveis comercialmente para monitorar o problema. No entanto, o ensaio de Bradford é barato e muito preciso na determinação do aparecimento de proteinúria e o curso de nefrite lúpus. Este ensaio é rápido, e o reagente não é afetado pela presença de solventes, buffers, agentes de redução e agentes de corte de metal que podem estar em sua amostra 9,10,11.
Um aspecto importante a considerar é a infiltração celular no rim. Esses infiltrados promovem a patogênese desencadeando a secreção de fatores solúveis, como citocinas, para piorar a inflamação12. Para entender melhor quais populações celulares estão presentes nos infiltrados, um método útil é isolar os leucócitos13. Aqui, a detecção de infiltração renal de células B é usada como exemplo. O procedimento começa com um processo de digestão com desoxyribonuclease (DNase) e colagenase, seguido pela separação gradiente de densidade que remove detritos, glóbulos vermelhos e granulócitos densos. A razão para isolar células B (CD19+) e células plasmáticas (CD138+) é que os rins de lúpus podem concentrar essas células14. Sugere-se que a presença de células B em pequenos agregados no rim pode indicar expansão clonal e, consequentemente, produção de imunoglobulina (Ig). As células plasmáticas são bem conhecidas por estarem presentes nestes agregados, bem como15. Uma vez que os leucócitos tenham sido isolados, a triagem celular ativada pela fluorescência (FACS) pode ser usada para analisar as células de interesse ao coloração com diferentes anticorpos conjugados pela fluorescência.
A imunofluorescência é um dos métodos de detecção de imunohistoquímica (IHC) que permite a visualização fluorescente de proteínas em amostras de tecido renal de 4 μm de espessura. Outros métodos de detecção de IHC dependem da natureza dos analitos, química de vinculação e outros fatores16. A imunofluorescência é um método de identificação rápida que expõe o antígeno ao seu anticorpo de contrapartida rotulado com um fluorocromo específico (ou um corante fluorescente). Quando excitado, produz luz que um microscópio de fluorescência pode detectar. Esta técnica pode ser usada para observar a deposição do complemento C3 e IgG2a17. A ativação excessiva da cascata de complementos pode estar associada a uma resposta imune descontrolada e perda de função18. A deposição imune de autoanticorpos de DNA anti-dsDNA (anti-dsDNA) no rim é uma grande preocupação19, onde aqueles com isótipo IgG2a foram associados com LN20. Especificamente, anticorpos anti-dsDNA apresentam mais patogenicidade e afinidade com materiais nucleares, formando complexos imunológicos21. Quando o IgG2a está presente, a cascata complementar, incluindo c3, é ativada para limpar os complexos imunológicos22. Os marcadores C3 e IgG2a podem ser quantificados individualmente ou sobrepostos para estabelecer sua correlação.
Notavelmente, a medição da creatinina sé serum é outra técnica confiável que pode ser usada em conjunto com hematuria microscópica e biópsias renais para diagnosticar LN23. No entanto, a presença de proteinúria é um forte indicador de danos glomerulares. Nesse sentido, o monitoramento do nível de proteinúria durante o lúpus pode detectar o aparecimento da doença e complementar outros métodos para o diagnóstico de lúpus. Além disso, os complexos imunológicos depositados em glomeruli podem induzir uma resposta inflamatória, ativar o sistema complementar e recrutar mais células inflamatórias. Outro ponto importante deste protocolo é a infiltração de células B no rim. Isso, juntamente com as células T infiltradas, amplifica as respostas imunes locais que desencadeiam danos nos órgãos. É importante ressaltar que a classificação da LN não se baseia apenas em alterações morfológicas glomerulares vistas na microscopia, mas também depósitos imunológicos observados com imunofluorescência. Portanto, neste protocolo, métodos precisos e econômicos para a análise da função renal são oferecidos em ambientes laboratoriais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J60764.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse C3</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL7632F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD138 BV711</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-212-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9511236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA-EC</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-ecdna</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 Microscope imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fusion Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>23272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail enamel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any conventional store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T compound</td>
			<td>Tisse-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>R-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 20x TBS Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Albumin standard included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLon Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>FcR block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.1 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell Strainers 100 &#181;M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin Hydrochloride</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>V-200-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>fluorescent dye for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice

O lúpus eritematoso sistêmico (SLE) é uma doença autoimune sem cura conhecida e é caracterizada por inflamação persistente em muitos órgãos, incluindo os rins. Sob tais circunstâncias, o rim perde sua capacidade de limpar resíduos do sangue e regular concentrações de sal e fluidos, eventualmente levando à insuficiência renal. As mulheres, particularmente as em idade fértil, são diagnosticadas nove vezes mais frequentemente do que os homens. A doença renal é a principal causa de mortalidade em pacientes com SLE. O presente protocolo descreve um método rápido e simples para medir os níveis de proteína excretada na urina coletada, acompanhando a progressão do lúpus ao longo do tempo. Além disso, uma abordagem para isolar as células mononucleares renais é fornecida com base na seleção de tamanho e densidade para investigar a infiltração renal de leucócitos. Além disso, um método imunohistoquímico foi desenvolvido para caracterizar a deposição proteica na infiltração glomeruli e leucócito no espaço tubulointersticial. Juntos, esses métodos podem ajudar a investigar a progressão da inflamação crônica associada aos rins de camundongos mrl/lpr propensos ao lúpus.

O protocolo utiliza vários métodos para avaliar camundongos MRL/lpr para nefrite lúpus. Primeiro, um procedimento é descrito para estudar o aumento dos níveis de proteinúria devido à disfunção renal ao longo do tempo. Como mostrado na Figura 1, os camundongos fêmeas foram tratados com gavage oral de 200 μL de soro fisco tamponado (1x PBS) como o grupo controle e o probiótico Lactobacillus reuteri como o grupo de tratamento, numa concentração de 109 cfu/mL, d...

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Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

O presente protocolo descreve um método para rastrear a progressão do lúpus em camundongos. Dois procedimentos adicionais são apresentados para caracterizar a nefrite lúpus com base na infiltração celular e na deposição de proteínas nos rins.

Análises de Proteinúria, Infiltração Renal de Leucócitos e Deposição Renal de Proteínas em Camundongos MRL/lpr propensos a Lúpus

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Esses métodos podem ajudar a investigar a progressão da inflamação crônica associada aos rins em pacientes com lúpus. Estamos oferecendo uma alternativa confiável e econômica que pode ser usada para monitorar o curso de doenças em lúpus. Comece a esterilizar o capô pulverizando 70% de etanol e coloque uma folha de plástico estéril na superfície.Em seguida, prepare dicas, tubos de 1,5 mililitro e uma pipeta para coletar cerca de 20 microliters da urina. Pegue a gaiola e pulverize 70% de etanol antes de colocá-la dentro do capô. Depois, segure o mouse com uma mão e use a outra mão para massagear suavemente a área ventral de cima para baixo.Usando um tubo de 1,5 mililitro ou pipeta, colete a urina diretamente. Ou se a amostra cair, colecione-a da folha de plástico. Então coloque o rato de volta na gaiola.Corte os rins dissecados em tamanho de grão e digerir em cinco mililitros de tampão de digestão contendo Colagenase e DNase 1 em RPMI 1640 médio contendo HEPES por uma hora com agitação suave contínua a 37 graus Celsius. Adicione 10 mililitros de PBS gelado contendo 10 mililitros de EDTA e incubar por 10 minutos no gelo. Em seguida, vórtice a suspensão duas vezes.Posteriormente, filtre a suspensão da célula através de um coador de 100 micrômetros e lave com 10 mililitros de HBSS cheios. Depois, centrífuga a 350 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente. Prepare uma solução percoll isotônica de 30, 37% e 70% de estoque e adicione uma camada de solução percoll de 37% em cima da solução de 70%.Suspenda as células em cinco mililitros de 30% de estoque isotônico Percoll. Usando uma pipeta Pasteur carga lentamente 37% de cinco mililitros superiores e 70% de cinco mililitros na parte inferior, fazendo o gradiente percoll isotônico de estoque. Em seguida, centrífuga com o número nove e para baixo número zero a 1000 vezes G por 30 minutos em temperatura ambiente.Depois, colete leucócitos da interface de 37 a 70% e suspenda-os em cinco mililitros de C 10. Novamente, centrífuga a 350 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Posteriormente, suspenda a pelota de célula em três mililitros de tampão de fax e centrífuga a 350 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, descarte o supernatante deixando cerca de 50 microliters do volume total. Adicione 50 microliters de bloco receptor FC por tubo. Seguindo esta mistura e incubar no gelo no escuro por 10 minutos.Mais tarde, adicione dois mililitros de tampão de fax para lavagem. Em seguida, centrífuga a 350 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o supernacente deixando cerca de 50 microliters do volume total. Em seguida, adicione 20 microliters do corante fluorescente apropriado e deixe-o ficar por 15 a 30 minutos no gelo.Adicione 50 microliters de mistura de anticorpos por tubo contendo CD 138 violeta brilhante sete 11 e CD 45 Alexa Fluor 700 e incubar no gelo no escuro por 15 a 30 minutos. Depois, adicione três mililitros de tampão de fax. Centrifugar a 350 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Remova o supernatante por vácuo deixando cerca de 50 microliters do volume total. Mais tarde, suspenda a pelota celular em 200 microliters da PBS. Para coletar a amostra incorpore o meio rim no pequeno criomold plástico com o composto de temperatura de corte ideal.Em seguida, adicione gelo seco em uma caixa de espuma de poliestireno e coloque cuidadosamente o criomold em cima do gelo seco. Em seguida, remova a criomold, enrole-a em papel alumínio e armazene-a a menos 80 graus Celsius até usar mais. Em seguida, fixar o seco em quatro seções de micrômetros com acetona fria por 10 minutos.Depois de fixar os slides, o ar seco por 0,5 a uma hora e armazená-los a menos 20 graus Celsius por um curto período de tempo ou menos 80 graus Celsius por um longo tempo. Para colorar as amostras, refixe os slides em acetona fria por cinco a 10 minutos e deixe que as seções aqueçam até a temperatura ambiente. Depois, usando uma caneta de tapinha, desenhe um círculo hidrofóbico ao redor da seção e deixe-o secar.Em seguida, coloque slides em TBS no frasco de Copeland por 20 minutos e agite suavemente colocando o frasco no shaker. Posteriormente, despeje o TBS e encha o frasco com TBS 5%BSA e 0,1%TW 20. Mais tarde, incubar o frasco por 20 minutos sacudindo suavemente o shaker.Em seguida, tire os slides e limpe a parte inferior dos slides. Adicione 100 microliters de anticorpos conjugados C3 encaixe C e IgG2 APE à seção e incubar a temperatura ambiente em uma câmara umidificada por uma hora. Lave a seção três vezes em PBS 5%BSA e 0,1%TW 20 por 10 minutos no agitador e depois agite os slides.Monte a seção com um reagente anti-fade e, em seguida, com um deslizamento de cobertura. Em seguida, armazene os slides a quatro graus Celsius até visualizar sob o microscópio. Para análise de imagem usando o software imagem J, delineie a região desejada.Depois, defina parâmetros padrão clicando em analisar e, em seguida, definir medidas e medir a área para obter os resultados. Em seguida, transfira os dados obtidos das janelas de medida para uma planilha. Uma vez feito, clique em analisar para medir a região e transferir os dados novamente para a planilha anterior.Os níveis de proteína na urina dos camundongos MRL LPR foram detectados ao longo do tempo em que foram tratados com soro fisiológico tamponado fosfato como o grupo controle e lactobacillus reuteri como o grupo de tratamento. O grupo de camundongos tratado com L.reuteri em uma progressão de proteinúria mais agressiva do que o grupo controle. A análise de fax foi realizada para os leucócitos renais isolados analisarem as células plasmáticas.Além disso, os camundongos foram tratados com vancomicina ou vancomicina, juntamente com DNA duplo encalhado de Escherichia coli. Embora espera-se que o DNA duplo encalhado de Escherichia coli desencadeie a infiltração renal, nenhuma diferença significativa foi encontrada na porcentagem de células plasmáticas. O complemento C3 e IgG2a foram detectados através de coloração de imunofluorescência em seções renais mrl ipr femininas.Os fatores ambientais eficazes na deposição renal de C3 e IgG2a foram comparados para o pão de camundongos interno na instalação animal e aqueles comprados de um vendedor. A análise imunohistoquímica não mostrou diferença entre os dois grupos. Adicionar cada camada da solução de estoque percentual ISO 20 Percoll pode ser desafiador, e se eles se misturarem, você tem que começar de novo.Este procedimento ajuda com o citómetro de fluxo e em experimentos vitter, de modo que você não pode estudar o tipo diferente de células renais de populações. Este procedimento nos permite estudar as células B infiltradas nos rins e não há muita informação na literatura.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Imunologia e Infecção

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolamento e Análise de Cérebro-sequestrados de Leucócitos<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA infectadas Mice

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Cecal ligadura e punção induzida Sepsis como um modelo para estudar a autofagia em Ratos

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Colheita seletiva de Marginating-pulmonar Leucócitos

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Colheita seletiva de Marginating-hepática Leucócitos

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Caracterização fenotípica dos macrófagos a partir de rim de rato por Citometria de Fluxo

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Lavagem Broncoalveolar de Pulmões Murinos para Analisar a Infiltração de Células Inflamatórias

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

Transplantação subcapsular renal do Thymus Embryonic murine 2 '-Deoxyguanosine-Tratado em ratos nus

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...