Name: analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Мы благодарим Центр проточной цитометрии, Лабораторию гистопатологии, Центр визуализации Фралина в Политехническом институте Вирджинии и Государственный университет за техническую поддержку. Эта работа поддерживается различными NIH и внутренними грантами.

Настоящий протокол одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Virginia Tech. Поскольку болезнь волчанки имеет более высокую заболеваемость у самок, использовались только самки мышей MRL / lpr. Отбор проб начинался в возрасте 4 недель и заканчивался в 15 не?...

<ol>
	<li>Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Lupus+Erythematosus.">Systemic Lupus Erythematosus.</a> New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).</li><li>Davidson, A., Aranow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupus+nephritis:+lessons+from+murine+models.">Lupus nephritis: lessons from murine models.</a> Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).</li><li>Maldonado, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+environmental+antigens+in+the+spontaneous+development+of+autoimmunity+in+MRL-lpr+mice.">The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice.</a> Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).</li><li>Lech, M., Anders, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+lupus+nephritis.">The pathogenesis of lupus nephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).</li><li>Bagavant, H., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+kidney+disease+in+systemic+lupus+erythematosus.">Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus.</a> Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).</li><li>Li, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+autoantibody+clusters+that+best+predict+lupus+disease+activity+using+glomerular+proteome+arrays.">Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).</li><li>Arag&#243;n, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+biomarkers+in+lupus+nephritis.">Urinary biomarkers in lupus nephritis.</a> Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).</li><li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota.">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73 (2017).</li><li>Lu, T. -. S., Yiao, S. -. Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+biological+and+mechanical+variations+between+the+Lowry+versus+Bradford+method+for+protein+quantification.">Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).</li><li>Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+should+proteinuria+be+detected+and+measured.">How should proteinuria be detected and measured.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 46, 205-217 (2009).</li><li>Viswanathan, G., Upadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+proteinuria.">Assessment of proteinuria.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).</li><li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+outcomes+of+lupus+nephritis+with+tubulointerstitial+inflammation+and+scarring.">Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring.</a> Arthritis Care &amp; Research. 63 (6), 865-874 (2011).</li><li>Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bari&#233;ty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinuria+and+tubulointerstitial+lesions+in+lupus+nephritis.">Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis.</a> Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+B+cell-mediated+immune+responses+and+tubulointerstitial+inflammation+in+human+lupus+nephritis.">In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).</li><li>Schrezenmeier, E., Jayne, D., D&#246;rner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+B+Cells+and+plasma+cells+in+glomerular+diseases:+translational+perspectives.">Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).</li><li>Fitzgibbons, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+analytic+validation+of+immunohistochemical+assays:+Guideline+from+the+college+of+American+pathologists+pathology+and+laboratory+quality+center.">Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).</li><li>Lewis, M. J., Botto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+deficiencies+in+humans+and+animals:+links+to+autoimmunity.">Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity.</a> Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+renal+disease+in+MRL/lpr+mice+genetically+deficient+in+the+alternative+complement+pathway+factor+B.">Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B.</a> Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10+regulates+murine+lupus.">IL-10 regulates murine lupus.</a> Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).</li><li>Singh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+IL-4+and+STAT6+vs+STAT4+to+the+development+of+lupus+nephritis.">Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).</li><li>van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+targets+of+nephritogenic+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus.">Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).</li><li>Zuniga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+IgG+subclasses+and+C-reactive+protein+in+lupus+nephritis:+the+relationship+between+the+composition+of+immune+deposits+and+FCgamma+receptor+type+IIA+alleles.">Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).</li><li>Cabana-Puig, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+drift+in+lupus-prone+MRL/lpr+Mice:+potential+roles+of+micrornas+and+gut+microbiota.">Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota.</a> Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNaseI+treatment+is+a+prerequisite+for+the+amplification+of+cDNA+from+episomal-based+genes.">DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes.</a> Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).</li><li>Park, J. G. -., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+composition+in+normal+human+kidneys.">Immune cell composition in normal human kidneys.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining.">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li><li>Okutucu, B., D&#305;n&#231;er, A., Habib, &. #. 2. 1. 4. ;., Z&#305;hn&#305;oglu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+methods+for+determination+of+total+plasma+protein+concentration.">Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).</li></ol>

ЛН является основной причиной смертности у пациентов с СКВ, и факторы, усугубляющие заболевание, остаются неясными. Применение этого протокола заключается в характеристике функции почек с использованием нескольких методов, включая измерение протеинурии, анализ FACS изолированных лейк?...

Основной функцией почек является выведение токсических веществ через мочу при сохранении гомеостаза воды и солей1. Эта функция находится под угрозой у пациентов с системной красной волчанкой (СКВ), что приводит к так называемому волчаночному нефриту (ЛН). LN является следствием того, что иммунная система атакует почки, что приводит к постоянному воспалению почек, поэтому она теряет способность очищать отходы из крови и регулировать концентрацию соли и жидкости. Это в конечном итоге приведет к почечной недостаточности, которая может быть фатальной. Во время нефритического процесса циркулирующие В-клетки, Т-клетки и моноциты рекрутируются в почку, секретируя хемокины, цитокины и иммунные комплексообразующие аутоантитела. Это в конечном итоге приводит к повреждению эндотелиальных клеток, мембранным повреждениям, атрофии почечных канальцев и фиброзу2.
MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) мыши, склонные к волчанке, являются классической моделью мыши, проявляющей волчаноподобные клинические признаки, которые напоминают человеческую СКВ3. Эта модель сыграла важную роль в понимании одной из ведущих причин смертности у пациентов с СКВ, волчаночного нефрита (LN)4. Как у человека, так и у мышей СКВ LN характеризуется постепенным воспалением, вызванным почечным отложением иммунных комплексов, за которым следует активация комплемента, набор воспалительных клеток и потеря функции почек5. Отложение иммунного комплекса является первым шагом к индуцированию производства хемокина и цитокина внутренними почечными клетками, что расширяет воспалительный ответ путем набора иммунных клеток6. Текущий протокол представляет несколько методов для отслеживания прогрессирования почечной недостаточности, которые анализируют инфильтрацию клеток и отложение иммунного комплекса.
Моча, собранная каждую неделю, позволяет обнаружить и визуализировать временное течение протеинурии до, во время и после начала волчанки. Протеинурия как биомаркер может определять биологическую прогрессию ЛН. Другие преимущества этого метода заключаются в том, что он неинвазивный, экономически эффективный и простой в реализации7. Когда почка работает отлично, уровень протеинурии стабильно низкий; однако у мышей MRL/lpr после 8-9-недельного возраста наблюдается постепенное повышение уровня протеинурии, который в конечном итоге достаточно высок, чтобы вызвать почечную недостаточность8. Несколько полосок реагентов и колориметрических реагентов коммерчески доступны для мониторинга проблемы. Однако брэдфордский анализ дешев и очень точен в определении начала протеинурии и течения волчаночного нефрита. Этот анализ является быстрым, и на реагент не влияет присутствие растворителей, буферов, восстановителей и хелатирующих агентов, которые могут быть в вашем образце 9,10,11.
Одним из важных аспектов, которые следует учитывать, является инфильтрация клеток в почках. Эти инфильтраты способствуют патогенезу, вызывая секрецию растворимых факторов, таких как цитокины, для усугубления воспаления12. Чтобы лучше понять, какие клеточные популяции присутствуют в инфильтратах, полезным методом является выделение лейкоцитов13. Здесь в качестве примера используется обнаружение почечной инфильтрации В-клеток. Процедура начинается с процесса пищеварения дезоксирибонуклеазой (ДНКаза) и коллагеназой, за которым следует разделение градиента плотности, которое удаляет мусор, эритроциты и плотные гранулоциты. Причина выделения В-клеток (CD19+) и плазматических клеток (CD138+) заключается в том, что волчаночные почки могут концентрировать эти клетки14. Предполагается, что наличие В-клеток в небольших агрегатах в почках может свидетельствовать о клональной экспансии и, следовательно, выработке иммуноглобулина (Ig). Хорошо известно, что плазматические клетки присутствуют в этих агрегатах, а также15. После того, как лейкоциты были выделены, флуоресцентно-активированная клеточная сортировка (FACS) может быть использована для анализа клеток, представляющих интерес, при окрашивании различными флуоресцентно-конъюгированными антителами.
Иммунофлуоресценция является одним из методов иммуногистохимии (IHC), который позволяет флуоресцентную визуализацию белков в образцах почечной ткани толщиной 4 мкм. Другие методы обнаружения IHC зависят от природы аналитов, химии связывания и других факторов16. Иммунофлуоресценция — это метод быстрой идентификации, который подвергает антиген воздействию его аналога антитела, меченного специфическим фторхромом (или флуоресцентным красителем). При возбуждении он производит свет, который может обнаружить флуоресцентный микроскоп. Этот метод может быть использован для наблюдения осаждения комплемента C3 и IgG2a17. Чрезмерная каскадная активация комплемента может быть связана с неконтролируемым иммунным ответом и потерей функции18. Иммунная депонирование антидвухлопчатых аутоантител ДНК (анти-dsDNA) в почках является основной проблемой19, где те, у кого изотип IgG2a, были связаны с LN20. В частности, анти-dsDNA антитела проявляют большую патогенность и сродство к ядерным материалам, образуя иммунные комплексы21. Когда присутствует IgG2a, каскад комплемента, включая C3, активируется для очистки иммунных комплексов22. Маркеры C3 и IgG2a могут быть количественно определены по отдельности или наложены для установления их корреляции.
Примечательно, что измерение креатинина в сыворотке крови является еще одним надежным методом, который можно использовать вместе с микроскопической гематурией и биопсией почек для диагностики LN23. Однако наличие протеинурии является сильным показателем повреждения клубочков. В этом смысле мониторинг уровня протеинурии во время волчанки может обнаружить начало заболевания и дополнить другие методы диагностики волчанки. Кроме того, иммунные комплексы, отложенные в клубочках, могут вызывать воспалительную реакцию, активировать систему комплемента и набирать больше воспалительных клеток. Еще одним примечательным моментом этого протокола является инфильтрация В-клеток в почке. Это, вместе с инфильтрированными Т-клетками, усиливает местные иммунные реакции, которые вызывают повреждение органов. Важно отметить, что классификация LN основана не только на клубочковых морфологических изменениях, наблюдаемых в микроскопии, но и на иммунных отложениях, наблюдаемых при иммунофлуоресценции. Поэтому в данном протоколе предлагаются точные и экономически эффективные методы анализа функции почек в лабораторных условиях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J60764.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse C3</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL7632F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD138 BV711</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-212-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9511236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA-EC</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-ecdna</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 Microscope imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fusion Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>23272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail enamel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any conventional store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T compound</td>
			<td>Tisse-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>R-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 20x TBS Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Albumin standard included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLon Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>FcR block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.1 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell Strainers 100 &#181;M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin Hydrochloride</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>V-200-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>fluorescent dye for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice

Системная красная волчанка (СКВ) является аутоиммунным заболеванием без известного лечения и характеризуется стойким воспалением во многих органах, включая почки. При таких обстоятельствах почка теряет способность очищать отходы из крови и регулировать концентрацию соли и жидкости, что в конечном итоге приводит к почечной недостаточности. Женщины, особенно детородного возраста, диагностируются в девять раз чаще, чем мужчины. Заболевание почек является основной причиной смертности у пациентов с СКВ. Настоящий протокол описывает быстрый и простой метод измерения уровня выделяемого белка в собранной моче, отслеживая прогрессирование волчанки с течением времени. Кроме того, предусмотрен подход к выделению мононуклеарных клеток почек на основе выбора размера и плотности для исследования почечной инфильтрации лейкоцитов. Кроме того, разработан иммуногистохимический метод для характеристики отложений белка в клубочках и инфильтрации лейкоцитов в тубулоинтерстициальном пространстве. Вместе эти методы могут помочь исследовать прогрессирование хронического воспаления, связанного с почками склонных к волчанке МРЛ / лпр мышей.

Протокол использует несколько методов для оценки МРЛ/лпр мышей на волчаночный нефрит. Во-первых, описана процедура изучения повышенного уровня протеинурии из-за дисфункции почек с течением времени. Как показано на рисунке 1, самок мышей лечили пероральным приемом 200 мкл...

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

Настоящий протокол описывает метод отслеживания прогрессирования волчанки у мышей. Представлены две дополнительные процедуры для характеристики волчаночного нефрита на основе клеточной инфильтрации и отложении белка в почках.

Анализ протеинурии, почечной инфильтрации лейкоцитов и почечного отложения белков у склонных к волчанке МРЛ/ЛПР мышей

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Эти методы могут помочь исследовать прогрессирование хронического воспаления, связанного с почками, у пациентов с волчанкой. Мы предлагаем надежную и экономически эффективную альтернативу, которая может быть использована для мониторинга течения заболевания при волчанке. Начните стерилизацию капюшона, распыляя 70% этанола и поместите стерильный пластиковый лист на поверхность.Затем подготовьте наконечники, 1,5 миллилитровые трубки и пипетку, чтобы собрать около 20 микролитров мочи. Возьмите клетку и распылите 70% этанола, прежде чем поместить его в капот. После этого держите мышь одной рукой, а другой рукой мягко массируйте вентральную область сверху донизу.Используя 1,5-миллилитровый тюбик или пипетку, соберите мочу напрямую. Или если капли образца собирают его из пластикового листа. Затем поместите мышь обратно в клетку.Разрезать рассеченные почки на размер зерна и переварить в пяти миллилитрах буфера пищеварения, содержащего коллагеназу и ДНКазу 1 в среде RPMI 1640, содержащей HEPES, в течение одного часа с непрерывным мягким встряхиванием при 37 градусах Цельсия. Добавьте 10 миллилитров ледяного холодного PBS, содержащего 10 миллимоляров ЭДТА, и инкубируйте в течение 10 минут на льду. Затем дважды вихрь суспензии.Затем фильтруйте клеточную суспензию через 100-микрометровый ситечко и промывайте 10 миллилитрами HBSS полным. После этого центрифугируют в 350 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре. Приготовьте 30, 37 и 70% изотонический раствор Перколла и добавьте слой 37%-ного раствора Перколла поверх 70%-ного раствора.Повторно суспендировать клетки в пяти миллилитрах 30% запаса изотонического Перколла. Используя пипетку Пастера, медленно загружайте 37% пяти миллилитров сверху и 70% пяти миллилитров внизу, делая запас изотоническим градиентом Перколла. Затем центрифугу с номером девять вверх и вниз номером ноль в 1000 раз G в течение 30 минут при комнатной температуре.После этого соберите лейкоциты от границы раздела от 37 до 70% и повторно приостановите их в пяти миллилитрах С10. Опять же, центрифуга в 350 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Впоследствии приостановить ячейку гранулы в трех миллилитрах факсимильного буфера и центрифуги при 350 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.Затем выбросьте супернатант, оставив около 50 микролитров от общего объема. Добавьте 50 микролитров блока рецепторов FC на пробирку. После этого смешивают и насиживают на льду в темноте в течение 10 минут.Затем добавьте два миллилитра факсимильного буфера для стирки. Затем центрифугируют в 350 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и отбрасывают супернатент, оставляя около 50 микролитров от общего объема. Затем добавьте 20 микролитров соответствующего флуоресцентного красителя и дайте ему постоять в течение 15-30 минут на льду.Добавьте 50 микролитров смеси антител на пробирку, содержащую CD 138 бриллиантовой фиалки семь 11 и CD 45 Alexa Fluor 700 и инкубируйте на льду в темноте в течение 15-30 минут. После этого добавьте три миллилитра буфера факса. Центрифуга в 350 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.Удалите супернатант вакуумом, оставив около 50 микролитров от общего объема. Позже повторно суспендировать ячейку гранулы в 200 микролитрах PBS. Для сбора образца встраивают половину почки в небольшой пластиковый криомольд с оптимальной температурой резания соединения.Затем добавьте сухой лед в пенополистироловый ящик и аккуратно поместите криомольд поверх сухого льда. Далее снимите криомольд, заверните его в алюминиевую фольгу и храните при минус 80 градусах Цельсия до дальнейшего использования. Затем зафиксируйте сухие до четырех микрометровых участков холодным ацетоном на 10 минут.После фиксации горок высушите на воздухе от 0,5 до одного часа и храните их при минус 20 градусах Цельсия в течение короткого времени или минус 80 градусов Цельсия в течение длительного времени. Чтобы окрасить образцы, зафиксируйте слайды в холодном ацетоне на пять-10 минут и дайте секциям прогреться до комнатной температуры. После этого, используя ручку для похлопывания, нарисуйте гидрофобный круг вокруг секции и дайте ему высохнуть.Затем поместите слайды в TBS в банку Copeland на 20 минут и аккуратно встряхните, положив банку на шейкер. После этого вылейте TBS и наполните банку TBS 5%BSA и 0,1%TW 20. Затем высиживайте банку в течение 20 минут, осторожно встряхивая шейкер.Затем выньте слайды и протрите нижнюю часть слайдов. Добавьте в секцию 100 микролитров конъюгированных антител C3, соответствующих C и IgG2 APE, и инкубируйте комнатную температуру в увлажненной камере в течение одного часа. Трижды вымойте секцию в PBS 5%BSA и 0,1%TW 20 в течение 10 минут на шейкере, а затем высушите горки.Установите секцию с помощью антивядающего реагента, а затем с помощью крышки. Затем храните слайды при четырех градусах Цельсия до просмотра под микроскопом. Для анализа изображений с помощью программного обеспечения image J наметьте нужную область.После этого установите стандартные параметры, нажав на анализ, затем установите измерения и измерьте площадь, чтобы получить результаты. Затем перенесите данные, полученные из окон измерения, в электронную таблицу. После этого нажмите «Анализ», чтобы измерить регион и снова перенести данные в предыдущую электронную таблицу.Уровни белка в моче мышей MRL LPR были обнаружены с течением времени, когда их обрабатывали фосфатно-буферным физиологическим раствором в качестве контрольной группы и lactobacillus reuteri в качестве группы лечения. Группа мышей, получавших L.reuteri с более агрессивным прогрессированием протеинурии, чем контрольная группа. Факсимильный анализ проводили для изолированных лейкоцитов почек для анализа плазматических клеток.Кроме того, мышей лечили ванкомицином или ванкомицином вместе с двухцепочечной ДНК Escherichia coli. Хотя ожидалось, что двухцепочечная ДНК Escherichia coli вызовет почечную инфильтрацию, не было обнаружено существенной разницы в процентном соотношении плазматических клеток. Комплемент C3 и IgG2a были обнаружены путем иммунофлуоресцентного окрашивания на женских участках почек MRL IPR.Эффективные факторы окружающей среды на почечное осаждение C3 и IgG2a сравнивали для собственного мышиного хлеба на животноводческом объекте и тех, которые были приобретены у продавца. Иммуногистохимический анализ не показал никакой разницы между двумя группами. Добавление каждого слоя процентного запаса ISO 20 Percoll solution может быть сложной задачей, и если они смешиваются, вам придется начинать все сначала.Эта процедура помогает с проточным цитометром и в экспериментах с виттером, поэтому вы не можете изучать различные типы популяций клеток почек. Эта процедура позволяет изучить инфильтраты В-клеток в почках и информации в литературе не так много.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Выделение Брейн-Лейкоциты проникают

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Выделение и анализ Brain-секвестрированных лейкоцитов из<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-инфицированных мышей

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Слепой кишки Лигирование и прокол, вызванной Сепсис как модель для изучения аутофагии у мышей

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Анализ влияния стромальных клеток на вербовкой лейкоцитов из потока

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Выделение лейкоцитов из интерфейса человека матери и плода

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Селективный Заготовка Marginating-легочными Лейкоциты

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Селективный Заготовка Marginating-печеночной Лейкоциты

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Фенотипическая Характеристика макрофаги почек крыс с помощью проточной цитометрии

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Бронхоальвеолярное спазмы легких у мышей для анализа воспалительной клеточной инфильтрации

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

Почечная субкапсулярная трансплантация 2'-Деоксигуанозин-обработанный Мурин Эмбриональный Тимус в обнаженных мышей

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...