Name: analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Agradecemos a la Flow Cytometry Core Facility, al Laboratorio de Histopatología, al Centro de Imágenes Fralin del Instituto Politécnico de Virginia y a la Universidad Estatal por su apoyo técnico. Este trabajo es apoyado por varios NIH y subvenciones internas.

El presente protocolo está aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Virginia Tech. Dado que la enfermedad lúpica tiene una mayor incidencia en las hembras, solo se utilizaron ratones MRL / lpr hembra. La recolección de muestras se inició a las 4 semanas de edad y terminó a las 15 semanas. Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales) y fueron criados y mantenidos en un ambiente específico libre de patógenos siguiendo las pautas inst...

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining.">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li><li>Okutucu, B., D&#305;n&#231;er, A., Habib, &. #. 2. 1. 4. ;., Z&#305;hn&#305;oglu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+methods+for+determination+of+total+plasma+protein+concentration.">Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).</li></ol>

La LN es una de las principales causas de mortalidad en pacientes con LES, y los factores que agravan la enfermedad siguen sin estar claros. La aplicación de este protocolo consiste en caracterizar la función renal utilizando múltiples métodos, incluida la medición de proteinuria, el análisis FACS de leucocitos renales aislados y la tinción por inmunofluorescencia de secciones renales congeladas.
Un punto importante a considerar al recolectar orina es que uno tiene que ser consistente c...

La función principal del riñón es la eliminación de sustancias tóxicas a través de la orina, manteniendo la homeostasis del agua y las sales1. Esta función está amenazada en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES), lo que lleva a la llamada nefritis lúpica (LN). LN es una consecuencia de que el sistema inmune ataca el riñón, lo que lleva a una inflamación renal persistente, por lo tanto, pierde su capacidad para limpiar los desechos de la sangre y regular las concentraciones de sal y líquidos. Esto eventualmente conducirá a insuficiencia renal, que puede ser fatal. Durante el proceso nefrítico, las células B circulantes, las células T y los monocitos se reclutan en el riñón, secretando quimiocinas, citoquinas y autoanticuerpos formadores de complejos inmunes. En última instancia, esto resulta en daño de las células endoteliales, lesiones membranosas, atrofia tubular renal y fibrosis2.
Los ratones propensos al lupus MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) son un modelo clásico de ratón que exhibe signos clínicos similares al lupus que se asemejan al LES humano3. Este modelo ha sido fundamental para comprender una de las principales causas de mortalidad en pacientes con LES, la nefritis lúpica (LN)4. Tanto en el LES humano como en el ratón, la LN se caracteriza por una inflamación gradual desencadenada por la deposición renal de complejos inmunes, seguida de la activación del complemento, el reclutamiento de células inflamatorias y la pérdida de la función renal5. El depósito del complejo inmune es el primer paso para inducir la producción de quimiocinas y citoquinas por las células renales intrínsecas, lo que expande la respuesta inflamatoria al reclutar células inmunes6. El protocolo actual presenta varias técnicas para seguir la progresión de la enfermedad renal que analizan la infiltración celular y la deposición de complejos inmunes.
La orina recolectada cada semana permite la detección y visualización del curso temporal de la proteinuria antes, durante y después del inicio del lupus. La proteinuria como biomarcador puede determinar la progresión biológica de la LN. Otras ventajas de esta técnica son que no es invasiva, rentable y fácil de implementar7. Cuando el riñón está funcionando perfectamente, el nivel de proteinuria es consistentemente bajo; sin embargo, en ratones LMR/LPR, después de las 8-9 semanas de edad, se observa un aumento gradual del nivel de proteinuria, que finalmente es lo suficientemente alto como para causar insuficiencia renal8. Múltiples tiras de reactivos y reactivos colorimétricos están disponibles comercialmente para monitorear el problema. Sin embargo, el ensayo de Bradford es barato y muy preciso para determinar la aparición de proteinuria y el curso de la nefritis lúpica. Este ensayo es rápido y el reactivo no se ve afectado por la presencia de disolventes, tampones, agentes reductores y agentes quelantes de metales que pueden estar en su muestra 9,10,11.
Un aspecto importante a considerar es la infiltración celular en el riñón. Estos infiltrados promueven la patogénesis al desencadenar la secreción de factores solubles como las citoquinas para empeorar la inflamación12. Para comprender mejor qué poblaciones celulares están presentes en los infiltrados, un método útil es aislar leucocitos13. Aquí, la detección de la infiltración renal de las células B se utiliza como ejemplo. El procedimiento comienza con un proceso de digestión con desoxirribonucleasa (DNasa) y colagenasa, seguido de una separación de gradiente de densidad que elimina desechos, glóbulos rojos y granulocitos densos. La razón para aislar las células B (CD19+) y las células plasmáticas (CD138+) es que los riñones lúpicos pueden concentrar estas células14. Se sugiere que la presencia de células B en pequeños agregados en el riñón puede indicar expansión clonal y, en consecuencia, producción de inmunoglobulina (Ig). Se sabe que las células plasmáticas también están presentes en estos agregados15. Una vez que se han aislado los leucocitos, se puede utilizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para analizar las células de interés al teñir con diferentes anticuerpos conjugados con fluorescencia.
La inmunofluorescencia es uno de los métodos de detección de inmunohistoquímica (IHC) que permite la visualización fluorescente de proteínas en muestras de tejido renal de 4 μm de espesor. Otros métodos de detección de IHQ dependen de la naturaleza de los analitos, la química de unión y otros factores16. La inmunofluorescencia es un método de identificación rápida que expone el antígeno a su anticuerpo homólogo marcado con un fluorocromo específico (o un colorante fluorescente). Cuando se excita, produce luz que un microscopio de fluorescencia puede detectar. Esta técnica puede ser utilizada para observar la deposición del complemento C3 e IgG2a17. La activación excesiva de la cascada del complemento podría estar asociada con una respuesta inmune incontrolada y pérdida de función18. La deposición inmune de autoanticuerpos anti-ADN bicatenario (anti-dsDNA) en el riñón es una preocupación importante19, donde aquellos con isotipo IgG2a se han asociado con LN20. Específicamente, los anticuerpos anti-dsDNA exhiben más patogenicidad y afinidad con los materiales nucleares, formando complejos inmunes21. Cuando la IgG2a está presente, la cascada del complemento, incluyendo C3, se activa para eliminar los complejos inmunes22. Los marcadores C3 e IgG2a se pueden cuantificar individualmente o superpuestos para establecer su correlación.
En particular, la medición de la creatinina sérica es otra técnica confiable que se puede usar junto con hematuria microscópica y biopsias renales para diagnosticar LN23. Sin embargo, la presencia de proteinuria es un fuerte indicador de daño glomerular. En ese sentido, el monitoreo del nivel de proteinuria durante el lupus puede detectar la aparición de la enfermedad y complementar otros métodos para diagnosticar el lupus. Además, los complejos inmunes depositados en los glomérulos pueden inducir una respuesta inflamatoria, activar el sistema del complemento y reclutar más células inflamatorias. Otro punto destacable de este protocolo es la infiltración de células B en el riñón. Esto, junto con las células T infiltradas, amplifica las respuestas inmunes locales que desencadenan el daño orgánico. Es importante destacar que la clasificación de LN no solo se basa en los cambios morfológicos glomerulares observados en microscopía, sino también en los depósitos inmunes observados con inmunofluorescencia. Por lo tanto, en este protocolo, se ofrecen métodos precisos y rentables para el análisis de la función renal en entornos de laboratorio.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J60764.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse C3</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL7632F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD138 BV711</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-212-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9511236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA-EC</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-ecdna</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 Microscope imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fusion Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>23272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail enamel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any conventional store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T compound</td>
			<td>Tisse-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>R-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 20x TBS Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Albumin standard included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLon Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>FcR block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.1 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell Strainers 100 &#181;M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin Hydrochloride</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>V-200-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>fluorescent dye for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
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</table>

analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice

El lupus eritematoso sistémico (LES) es un trastorno autoinmune sin cura conocida y se caracteriza por una inflamación persistente en muchos órganos, incluidos los riñones. En tales circunstancias, el riñón pierde su capacidad de limpiar los desechos de la sangre y regular las concentraciones de sal y líquidos, lo que eventualmente conduce a insuficiencia renal. Las mujeres, particularmente las en edad fértil, son diagnosticadas nueve veces más a menudo que los hombres. La enfermedad renal es la principal causa de mortalidad en pacientes con LES. El presente protocolo describe un método rápido y simple para medir los niveles de proteína excretada en la orina recolectada, rastreando la progresión del lupus a lo largo del tiempo. Además, se proporciona un enfoque para aislar células mononucleares renales basado en la selección de tamaño y densidad para investigar la infiltración renal de leucocitos. Además, se ha desarrollado un método inmunohistoquímico para caracterizar la deposición de proteínas en los glomérulos y la infiltración leucocitaria en el espacio tubulointersticial. Juntos, estos métodos pueden ayudar a investigar la progresión de la inflamación crónica asociada con los riñones de ratones MRL / lpr propensos al lupus.

El protocolo utiliza múltiples métodos para evaluar los ratones MRL/lpr para la nefritis lúpica. En primer lugar, se describe un procedimiento para estudiar el aumento de los niveles de proteinuria debido a la disfunción renal a lo largo del tiempo. Como se muestra en la Figura 1, los ratones hembra fueron tratados con sonda oral de 200 μL de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) como grupo control y probiótico Lactobacillus reuteri como grupo de tratamiento, a una c...

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Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

El presente protocolo describe un método para rastrear la progresión del lupus en ratones. Se presentan dos procedimientos adicionales para caracterizar la nefritis lúpica basada en la infiltración celular y la deposición de proteínas en los riñones.

Análisis de proteinuria, infiltración renal de leucocitos y depósito renal de proteínas en ratones LMR/LPR propensos al lupus

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Estos métodos pueden ayudar a investigar la progresión de la inflamación crónica asociada con los riñones en pacientes con lupus. Estamos ofreciendo una alternativa confiable y rentable que se puede utilizar para controlar el curso de la enfermedad en el lupus. Comience a esterilizar la campana rociando etanol al 70% y coloque una lámina de plástico estéril en la superficie.Luego prepare puntas, tubos de 1,5 mililitros y una pipeta para recoger unos 20 microlitros de la orina. Tome la jaula y rocíe etanol al 70% antes de colocarla dentro de la campana. Después, sostenga el mouse con una mano y use la otra mano para masajear suavemente el área ventral de arriba a abajo.Con un tubo o pipeta de 1,5 mililitros, recoja la orina directamente. O si la muestra gotas recógela de la lámina de plástico. Luego vuelva a colocar el mouse en la jaula.Corte los riñones disecados en tamaño de grano y digiera en cinco mililitros de tampón de digestión que contenga colagenasa y DNasa 1 en medio RPMI 1640 que contiene HEPES durante una hora con agitación suave continua a 37 grados centígrados. Añadir 10 mililitros de PBS helado que contenga 10 milimolares de EDTA e incubar durante 10 minutos sobre hielo. Luego vortex la suspensión dos veces.Posteriormente, filtre la suspensión celular a través de un colador de 100 micrómetros y lave con 10 mililitros de HBSS lleno. Después, centrifugar a 350 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Prepare una solución isotónica de Percoll al 30, 37 y 70% y agregue una capa de solución de Percoll al 37% sobre la solución al 70%.Re suspender las células en cinco mililitros de 30% de stock isotónico Percoll. Usando una pipeta Pasteur cargue lentamente el 37% de cinco mililitros en la parte superior y el 70% de cinco mililitros en la parte inferior, lo que hace que el gradiente isotónico estándar de Percoll. Luego, centrifugar con el número nueve arriba y el número cero hacia abajo a 1000 veces G durante 30 minutos a temperatura ambiente.Después, recoger leucocitos de la interfaz 37 a 70% y volver a suspenderlos en cinco mililitros de C 10. Nuevamente, centrifugar a 350 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Posteriormente, vuelva a suspender el pellet celular en tres mililitros de tampón de fax y centrifugar a 350 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Luego deseche el sobrenadante dejando unos 50 microlitros del volumen total. Agregue 50 microlitros de bloqueo del receptor FC por tubo. Después de esta mezcla e incubar en hielo en la oscuridad durante 10 minutos.Más tarde, agregue dos mililitros de búfer de fax para lavar. Luego, centrifugar a 350 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante dejando unos 50 microlitros del volumen total. A continuación, agregue 20 microlitros del tinte fluorescente apropiado y déjelo reposar durante 15 a 30 minutos en hielo.Añadir 50 microlitros de mezcla de anticuerpos por tubo que contenga CD 138 violeta brillante siete 11 y CD 45 Alexa Fluor 700 e incubar en hielo en la oscuridad durante 15 a 30 minutos. Después, agregue tres mililitros de búfer de fax. Centrifugar a 350 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Retirar el sobrenadante al vacío dejando unos 50 microlitros del volumen total. Posteriormente, se vuelve a suspender el pellet celular en 200 microlitros de PBS. Para recoger la muestra, incruste la mitad del riñón en el pequeño criomold de plástico con el compuesto de temperatura de corte óptimo.Luego agregue hielo seco en una caja de espuma de poliestireno y coloque cuidadosamente el criomold sobre el hielo seco. A continuación, retire el molde criogénico, envuélvalo en papel de aluminio y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta que se vuelva a usar. Luego fije las secciones secas a cuatro micrómetros con acetona fría durante 10 minutos.Después de fijar los portaobjetos, seque al aire durante 0,5 a una hora y guárdelos a menos 20 grados centígrados durante un corto período de tiempo o menos 80 grados centígrados durante mucho tiempo. Para teñir las muestras, vuelva a fijar los portaobjetos en acetona fría durante cinco a 10 minutos y deje que las secciones se calienten a temperatura ambiente. Después, usando un bolígrafo, dibuje un círculo hidrófobo alrededor de la sección y deje que se seque.Luego coloque las diapositivas en TBS en el frasco de Copeland durante 20 minutos y agite suavemente colocando el frasco en la coctelera. Posteriormente, vierta TBS y llene el frasco con TBS 5% BSA y 0.1% TW 20. Más tarde, incubar el frasco durante 20 minutos agitando suavemente sobre la coctelera.Luego, saque las diapositivas y limpie la parte inferior de las diapositivas. Agregue 100 microlitros de anticuerpos conjugados C3 fit C e IgG2 APE a la sección e incube la temperatura ambiente en una cámara humidificada durante una hora. Lave la sección tres veces en PBS 5% BSA y 0.1% TW 20 durante 10 minutos en la coctelera y luego seque las diapositivas.Monte la sección con un reactivo antidecoloración y luego con un cubreobjetos. Luego guarde los portaobjetos a cuatro grados centígrados hasta que los vea bajo el microscopio. Para el análisis de imágenes utilizando el software de imagen J, describa la región deseada.Luego, establezca parámetros estándar haciendo clic en analizar y luego establecer mediciones y área de medición para obtener los resultados. A continuación, transfiera los datos obtenidos de las ventanas de medida a una hoja de cálculo. Una vez hecho esto, haga clic en analizar para medir la región y transferir los datos nuevamente a la hoja de cálculo anterior.Los niveles de proteína en la orina de ratones LMR LMR se detectaron a lo largo del tiempo, donde fueron tratados con solución salina tamponada con fosfato como grupo control y lactobacillus reuteri como grupo de tratamiento. El grupo de ratones tratados con L.reuteri en una progresión de proteinuria más agresiva que el grupo control. El análisis por fax se realizó para los leucocitos renales aislados para analizar las células plasmáticas.Además, los ratones fueron tratados con vancomicina o vancomicina junto con ADN bicatenario de Escherichia coli. Aunque se esperaba que el ADN bicatenario de Escherichia coli desencadenara la infiltración renal, no se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de células plasmáticas. El complemento C3 e IgG2a se detectaron mediante tinción de inmunofluorescencia en secciones renales de LMR IPR femenino.Los factores ambientales efectivos en la deposición renal de C3 e IgG2a se compararon para el pan de ratones interno en la instalación para animales y los comprados a un proveedor. El análisis inmunohistoquímico no mostró ninguna diferencia entre los dos grupos. Agregar cada capa de la solución ISO 20 Percoll de stock porcentual puede ser un desafío, y si se mezclan, debe comenzar de nuevo.Este procedimiento ayuda con el citómetro de flujo y los experimentos in vitter, por lo que no se pueden estudiar los diferentes tipos de poblaciones de células renales. Este procedimiento nos permite estudiar los infiltrados de células B en los riñones y no hay mucha información en la literatura.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

El aislamiento de la infiltración de leucocitos cerebro-

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Aislamiento y análisis de Brain-secuestrados Los leucocitos de<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA de ratones infectados

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

La ligadura y punción cecal inducida por sepsis como un modelo para estudiar la autofagia en ratones

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

El análisis de los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos de Flujo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Aislamiento de leucocitos de la interfaz humana Materno-fetal

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

La recolección selectiva de leucocitos marginando-pulmonar

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

La recolección selectiva de leucocitos marginando-hepáticas

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Caracterización fenotípica de los macrófagos a partir de riñón de rata por Citometría de Flujo

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Lavado broncoalveolar de los pulmones murinos para analizar infiltración de células inflamatorias

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

Trasplante subcapsular renal de timo embrionario murino tratado con 2'-desoxiguanosina en ratones desnudos

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...