Name: analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Vi tackar Flow Cytometry Core Facility, Histopathology Laboratory, Fralin Imaging Center vid Virginia Polytechnic Institute och State University för teknisk support. Detta arbete stöds av olika NIH och interna bidrag.

Detta protokoll är godkänt av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Virginia Tech. Eftersom lupussjukdom har en högre incidens hos kvinnor användes endast kvinnliga MRL/lpr-möss. Provtagningen påbörjades vid 4 veckors ålder och avslutades vid 15 veckor. Mössen erhölls från kommersiella källor (se materialförteckning) och föddes upp och hölls i en specifik patogenfri miljö enligt de institutionella riktlinjerna.
1. Proteinuritest...

<ol>
	<li>Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Lupus+Erythematosus.">Systemic Lupus Erythematosus.</a> New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).</li><li>Davidson, A., Aranow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupus+nephritis:+lessons+from+murine+models.">Lupus nephritis: lessons from murine models.</a> Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).</li><li>Maldonado, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+environmental+antigens+in+the+spontaneous+development+of+autoimmunity+in+MRL-lpr+mice.">The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice.</a> Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).</li><li>Lech, M., Anders, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+lupus+nephritis.">The pathogenesis of lupus nephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).</li><li>Bagavant, H., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+kidney+disease+in+systemic+lupus+erythematosus.">Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus.</a> Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).</li><li>Li, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+autoantibody+clusters+that+best+predict+lupus+disease+activity+using+glomerular+proteome+arrays.">Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).</li><li>Arag&#243;n, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+biomarkers+in+lupus+nephritis.">Urinary biomarkers in lupus nephritis.</a> Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).</li><li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota.">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73 (2017).</li><li>Lu, T. -. S., Yiao, S. -. Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+biological+and+mechanical+variations+between+the+Lowry+versus+Bradford+method+for+protein+quantification.">Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).</li><li>Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+should+proteinuria+be+detected+and+measured.">How should proteinuria be detected and measured.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 46, 205-217 (2009).</li><li>Viswanathan, G., Upadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+proteinuria.">Assessment of proteinuria.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).</li><li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+outcomes+of+lupus+nephritis+with+tubulointerstitial+inflammation+and+scarring.">Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring.</a> Arthritis Care &amp; Research. 63 (6), 865-874 (2011).</li><li>Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bari&#233;ty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinuria+and+tubulointerstitial+lesions+in+lupus+nephritis.">Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis.</a> Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+B+cell-mediated+immune+responses+and+tubulointerstitial+inflammation+in+human+lupus+nephritis.">In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).</li><li>Schrezenmeier, E., Jayne, D., D&#246;rner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+B+Cells+and+plasma+cells+in+glomerular+diseases:+translational+perspectives.">Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).</li><li>Fitzgibbons, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+analytic+validation+of+immunohistochemical+assays:+Guideline+from+the+college+of+American+pathologists+pathology+and+laboratory+quality+center.">Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).</li><li>Lewis, M. J., Botto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+deficiencies+in+humans+and+animals:+links+to+autoimmunity.">Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity.</a> Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+renal+disease+in+MRL/lpr+mice+genetically+deficient+in+the+alternative+complement+pathway+factor+B.">Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B.</a> Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10+regulates+murine+lupus.">IL-10 regulates murine lupus.</a> Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).</li><li>Singh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+IL-4+and+STAT6+vs+STAT4+to+the+development+of+lupus+nephritis.">Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).</li><li>van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+targets+of+nephritogenic+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus.">Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).</li><li>Zuniga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+IgG+subclasses+and+C-reactive+protein+in+lupus+nephritis:+the+relationship+between+the+composition+of+immune+deposits+and+FCgamma+receptor+type+IIA+alleles.">Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).</li><li>Cabana-Puig, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+drift+in+lupus-prone+MRL/lpr+Mice:+potential+roles+of+micrornas+and+gut+microbiota.">Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota.</a> Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNaseI+treatment+is+a+prerequisite+for+the+amplification+of+cDNA+from+episomal-based+genes.">DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes.</a> Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).</li><li>Park, J. G. -., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+composition+in+normal+human+kidneys.">Immune cell composition in normal human kidneys.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining.">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li><li>Okutucu, B., D&#305;n&#231;er, A., Habib, &. #. 2. 1. 4. ;., Z&#305;hn&#305;oglu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+methods+for+determination+of+total+plasma+protein+concentration.">Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).</li></ol>

LN är en ledande dödsorsak hos SLE-patienter, och faktorer som förvärrar sjukdomen är fortfarande oklara. Tillämpningen av detta protokoll är att karakterisera njurfunktionen med hjälp av flera metoder, inklusive mätning av proteinuri, FACS-analys av isolerade njurleukocyter och immunofluorescensfärgning av frysta njursektioner.
En viktig punkt att tänka på när man samlar urin är att man måste vara konsekvent med tiden på dagen och platsen för urinuppsamling. Möss är nattlig...

Njurens primära funktion är eliminering av giftiga ämnen genom urin samtidigt som homeostasen av vatten och salter bibehålls1. Denna funktion hotas hos patienter med systemisk lupus erythematosus (SLE), vilket leder till så kallad lupusnefrit (LN). LN är en följd av att immunsystemet attackerar njurarna, vilket leder till ihållande njurinflammation och därför förlorar sin förmåga att rengöra avfall från blodet och reglera salt- och vätskekoncentrationer. Detta kommer så småningom att leda till njursvikt, vilket kan vara dödligt. Under den nefritiska processen rekryteras cirkulerande B-celler, T-celler och monocyter till njurarna och utsöndrar kemokiner, cytokiner och immunkomplexbildande autoantikroppar. Detta resulterar i slutändan i endotelcellskador, membranskador, renal tubulär atrofi och fibros2.
MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) lupusbenägna möss är en klassisk musmodell som uppvisar lupusliknande kliniska tecken som liknar humant SLE3. Denna modell har varit avgörande för att förstå en av de främsta orsakerna till dödlighet hos SLE-patienter, lupusnefrit (LN)4. I både humant och mus-SLE kännetecknas LN av gradvis inflammation utlöst av njuravsättning av immunkomplex, följt av komplementaktivering, rekrytering av inflammatoriska celler och förlust av njurfunktion5. Immunkomplexavsättningen är det första steget för att inducera kemokin- och cytokinproduktion av inneboende njurceller, vilket utökar det inflammatoriska svaret genom att rekrytera immunceller6. Det aktuella protokollet presenterar flera tekniker för att följa njursjukdomsprogression som analyserar cellinfiltration och immunkomplexavsättning.
Urin som samlas in varje vecka möjliggör detektering och visualisering av proteinuriens tidsförlopp före, under och efter lupusdebut. Proteinuri som biomarkör kan bestämma den biologiska utvecklingen av LN. Andra fördelar med denna teknik är att den är icke-invasiv, kostnadseffektiv och lätt att implementera7. När njuren fungerar perfekt är proteinurinivån konsekvent låg; Hos MRL/lpr-möss observeras dock efter 8-9 veckors ålder en gradvis ökning av proteinurinivån, som så småningom är tillräckligt hög för att orsaka njursvikt8. Flera reagensremsor och kolorimetriska reagenser är kommersiellt tillgängliga för att övervaka problemet. Bradford-analysen är dock billig och mycket exakt för att bestämma uppkomsten av proteinuri och förloppet av lupusnefrit. Denna analys är snabb och reagenset påverkas inte av närvaron av lösningsmedel, buffertar, reduktionsmedel och metallkelaterande medel som kan finnas i ditt prov 9,10,11.
En viktig aspekt att tänka på är cellinfiltration i njuren. Dessa infiltrat främjar patogenes genom att utlösa utsöndringen av lösliga faktorer såsom cytokiner för att förvärra inflammation12. För att bättre förstå vilka cellpopulationer som finns i infiltraten är en användbar metod att isolera leukocyter13. Här används detektering av njurinfiltration av B-celler som ett exempel. Förfarandet börjar med en matsmältningsprocess med deoxiribonukleas (DNase) och kollagenas, följt av densitetsgradientseparation som tar bort skräp, röda blodkroppar och täta granulocyter. Anledningen till att isolera B-celler (CD19+) och plasmaceller (CD138+) är att lupusnjurar kan koncentrera dessa celler14. Det föreslås att närvaron av B-celler i små aggregat i njurarna kan indikera klonal expansion och följaktligen immunoglobulin (Ig) produktion. Plasmaceller är välkända för att vara närvarande i dessa aggregat också15. När leukocyter har isolerats kan fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) användas för att analysera cellerna av intresse vid färgning med olika fluorescenskonjugerade antikroppar.
Immunofluorescens är en av de immunhistokemiska (IHC) detektionsmetoderna som möjliggör fluorescerande visualisering av proteiner i 4 μm tjocka njurvävnadsprover. Andra IHC-detektionsmetoder beror på analyternas natur, bindningskemi och andra faktorer16. Immunofluorescens är en snabb identifieringsmetod som utsätter antigenet för dess motsvarighetsantikropp märkt med en specifik fluorokrom (eller ett fluorescerande färgämne). När den är upphetsad producerar den ljus som ett fluorescensmikroskop kan upptäcka. Denna teknik kan användas för att observera avsättningen av komplement C3 och IgG2a17. Överdriven komplementkaskadaktivering kan associeras med ett okontrollerat immunsvar och funktionsförlust18. Immunavsättning av anti-dubbelsträngade DNA (anti-dsDNA) autoantikroppar i njuren är ett stort problem19, där de med IgG2a-isotyp har associerats med LN20. Specifikt uppvisar anti-dsDNA-antikroppar mer patogenicitet och affinitet till kärnmaterial och bildar immunkomplex21. När IgG2a är närvarande aktiveras komplementkaskaden, inklusive C3, för att rensa immunkomplexen22. C3- och IgG2a-markörerna kan kvantifieras individuellt eller överlagras för att fastställa deras korrelation.
I synnerhet är serumkreatininmätning en annan pålitlig teknik som kan användas tillsammans med mikroskopisk hematuri och njurbiopsier för att diagnostisera LN23. Närvaron av proteinuri är emellertid en stark indikator på glomerulär skada. I den meningen kan övervakning av proteinurinivån under lupus upptäcka sjukdomsdebut och komplettera andra metoder för att diagnostisera lupus. Dessutom kan immunkomplex avsatta i glomeruli inducera ett inflammatoriskt svar, aktivera komplementsystemet och rekrytera mer inflammatoriska celler. En annan anmärkningsvärd punkt i detta protokoll är B-cellinfiltration i njurarna. Detta, tillsammans med de infiltrerade T-cellerna, förstärker lokala immunsvar som utlöser organskador. Viktigt är att klassificeringen av LN inte bara baseras på glomerulära morfologiska förändringar som ses i mikroskopi utan också immunavlagringar observerade med immunofluorescens. Därför erbjuds i detta protokoll exakta och kostnadseffektiva metoder för analys av njurfunktionen i laboratorieinställningar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J60764.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse C3</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL7632F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD138 BV711</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-212-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9511236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA-EC</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-ecdna</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 Microscope imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fusion Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>23272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail enamel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any conventional store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T compound</td>
			<td>Tisse-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>R-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 20x TBS Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Albumin standard included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLon Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>FcR block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.1 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell Strainers 100 &#181;M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin Hydrochloride</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>V-200-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>fluorescent dye for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice

Systemisk lupus erythematosus (SLE) är en autoimmun sjukdom utan känt botemedel och kännetecknas av ihållande inflammation i många organ, inklusive njurarna. Under sådana omständigheter förlorar njuren sin förmåga att rengöra avfall från blodet och reglera salt- och vätskekoncentrationer, vilket så småningom leder till njursvikt. Kvinnor, särskilt de i fertil ålder, diagnostiseras nio gånger oftare än män. Njursjukdom är den vanligaste dödsorsaken hos SLE-patienter. Detta protokoll beskriver en snabb och enkel metod för att mäta utsöndrade proteinnivåer i insamlad urin och spåra lupusprogression över tid. Dessutom tillhandahålls ett tillvägagångssätt för att isolera njurmononukleära celler baserat på storlek och densitetsval för att undersöka njurinfiltration av leukocyter. Vidare har en immunohistokemisk metod utvecklats för att karakterisera proteinavsättning i glomeruli- och leukocytinfiltrationen i tubulointerstitiella utrymmet. Tillsammans kan dessa metoder hjälpa till att undersöka utvecklingen av kronisk inflammation i samband med njurarna hos lupusbenägna MRL/lpr-möss.

Protokollet använder flera metoder för att bedöma MRL/lpr-möss för lupusnefrit. Först beskrivs ett förfarande för att studera ökade proteinurinivåer på grund av njursvikt över tid. Som visas i figur 1, honmöss behandlades med oral sondmatning av 200 μl fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS) som kontrollgrupp och probiotiska Lactobacillus reuteri som behandlingsgrupp, i en koncentration av 109 cfu/ml, två gånger i veckan. Behandlingen började vid 3 veckors å...

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

Detta protokoll beskriver en metod för att spåra lupusprogression hos möss. Två ytterligare procedurer presenteras för att karakterisera lupusnefrit baserat på cellinfiltration och proteinavsättning i njurarna.

Analyser av proteinuri, njurinfiltration av leukocyter och njuravsättning av proteiner hos lupusbenägna MRL/lpr-möss

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Dessa metoder kan hjälpa till att undersöka utvecklingen av kronisk inflammation i samband med njurar hos lupuspatienter. Vi erbjuder ett pålitligt och kostnadseffektivt alternativ som kan användas för att övervaka sjukdomsförloppet i lupus. Börja sterilisera huven genom att spruta 70% etanol och placera ett sterilt plastark på ytan.Förbered sedan tips, 1,5 ml rör och en pipett för att samla cirka 20 mikroliter av urinen. Ta buret och spraya 70% etanol innan du placerar den inuti huven. Håll sedan musen med ena handen och använd den andra handen för att försiktigt massera det ventrala området från topp till botten.Använd ett 1,5 ml rör eller pipett, samla urinen direkt. Eller om provdropparna samlar det från plastarket. Sätt sedan tillbaka musen i buret.Skär de dissekerade njurarna i kornstorlek och smält i fem ml matsmältningsbuffert innehållande kollagenas och DNas 1 i RPMI 1640-medium innehållande HEPES i en timme med kontinuerlig försiktig skakning vid 37 grader Celsius. Tillsätt 10 ml iskall PBS innehållande 10 ml EDTA och inkubera i 10 minuter på is. Virvla sedan suspensionen två gånger.Senare filtrerar du cellsuspensionen genom en 100 mikrometer sil och tvättar med 10 ml HBSS full. Centrifugera därefter vid 350 gånger G i 10 minuter vid rumstemperatur. Förbered en 30, 37 och 70% lager isotonisk Percoll-lösning och tillsätt ett lager av 37% Percoll-lösning ovanpå 70% -lösningen.Åter suspendera cellerna i fem milliliter 30% lager isotonisk Percoll. Använd en Pasteur-pipett ladda långsamt 37% av fem milliliter topp och 70% av fem milliliter på botten, vilket gör lager isotonisk Percoll-gradient. Centrifugera sedan med upp nummer nio och ner nummer noll vid 1000 gånger G i 30 minuter vid rumstemperatur.Samla sedan leukocyter från 37 till 70% -gränssnittet och suspendera dem igen i fem milliliter C 10. Återigen, centrifugera vid 350 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Därefter suspenderas cellpelleten i tre milliliter faxbuffert och centrifugeras vid 350 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius.Kassera sedan supernatanten och lämna cirka 50 mikroliter av den totala volymen. Tillsätt 50 mikroliter FC-receptorblock per rör. Efter denna blandning och inkubera på is i mörkret i 10 minuter.Senare tillsätt två milliliter faxbuffert för tvätt. Centrifugera sedan vid 350 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius och kassera supernatenten och lämna cirka 50 mikroliter av den totala volymen. Tillsätt sedan 20 mikroliter lämpligt fluorescerande färgämne och låt det stå i 15 till 30 minuter på is.Tillsätt 50 mikroliter antikroppsblandning per rör innehållande CD 138 briljantviolett sju 11 och CD 45 Alexa Fluor 700 och inkubera på is i mörkret i 15 till 30 minuter. Tillsätt sedan tre milliliter faxbuffert. Centrifugera vid 350 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius.Ta bort supernatanten genom vakuum och lämna cirka 50 mikroliter av den totala volymen. Senare, åter avbryta cellpelleten i 200 mikroliter PBS. För att samla provet bädda in den halva njuren i den lilla plastkryomolden med den optimala skärtemperaturföreningen.Tillsätt sedan torris i en polystyrenskumlåda och placera försiktigt kryomolden ovanpå torrisen. Ta sedan bort kryomolden, linda den i aluminiumfolie och förvara den vid minus 80 grader Celsius tills vidare användning. Fixa sedan det torra till fyra mikrometersektioner med kall aceton i 10 minuter.Efter fixering av bilderna, lufttorka i 0,5 till en timme och förvara dem vid minus 20 grader Celsius under en kort tid eller minus 80 grader Celsius under lång tid. För att fläcka proverna, fixa om bilderna i kall aceton i fem till 10 minuter och låt sektionerna värmas upp till rumstemperatur. Därefter, med en klapppenna, rita en hydrofob cirkel runt sektionen och låt den torka.Placera sedan bilder i TBS i Copeland-burken i 20 minuter och skaka försiktigt genom att sätta burken på skakaren. Häll sedan av TBS och fyll burken med TBS 5% BSA och 0,1% TW 20. Senare inkubera burken i 20 minuter genom att skaka försiktigt på skakaren.Ta sedan ut bilderna och torka av botten av bilderna. Tillsätt 100 mikroliter konjugerade antikroppar C3 fit C och IgG2 APE till sektionen och inkubera rumstemperatur i en fuktad kammare i en timme. Tvätta sektionen tre gånger i PBS 5% BSA och 0,1% TW 20 i 10 minuter på skakaren och skaka sedan torka glasrutschbanorna.Montera sektionen med ett anti-fade reagens och sedan med en täckglidning. Förvara sedan bilderna vid fyra grader Celsius tills de visas under mikroskopet. För bildanalys med hjälp av bild J-programvaran, skissera önskad region.Ställ sedan in standardparametrar genom att klicka på analysera och ställ sedan in mätningar och mätområde för att få resultaten. Överför sedan data som erhållits från mätfönstren till ett kalkylblad. När du är klar klickar du på analysera för att mäta regionen och överföra data igen till föregående kalkylblad.Proteinnivåerna i urinen hos MRL LPR-möss påvisades över tid där de behandlades med fosfatbuffrad saltlösning som kontrollgrupp och lactobacillus reuteri som behandlingsgrupp. Mössgruppen behandlades med L.reuteri vid en mer aggressiv proteinuriprogression än kontrollgruppen. Faxanalysen utfördes för de isolerade njurleukocyterna för att analysera plasmacellerna.Vidare behandlades mössen med vankomycin eller vankomycin tillsammans med Escherichia coli dubbelsträngat DNA. Även om Escherichia coli dubbelsträngat DNA förväntades utlösa njurinfiltrationen, hittades ingen signifikant skillnad i andelen plasmaceller. Komplementet C3 och IgG2a detekterades genom immunofluorescensfärgning på kvinnliga MRL IPR-njursektioner.De effektiva miljöfaktorerna på njuravsättningen av C3 och IgG2a jämfördes för det egna mössbrödet i djuranläggningen och de som köptes från en leverantör. Den immunohistokemiska analysen visade ingen skillnad mellan de två grupperna. Att lägga till varje lager av den procentuella lager ISO 20 Percoll-lösningen kan vara utmanande, och om de blandas måste du börja om igen.Denna procedur hjälper till med flödescytometern och i vitter-experiment, så du kan inte studera de olika njurcellstyperna av populationer. Denna procedur gör att vi kan studera B-cellerna infiltrerar i njurarna och det finns inte mycket information i litteraturen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolering av Brain-infiltrera leukocyter

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolering och analys av Brain-binds Leukocyter från<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infekterade möss

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Cecal Ligation och Punktering-inducerad Sepsis som en modell för att studera Autophagy i möss

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analysera effekterna av stromaceller celler på rekrytering av leukocyter från Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolering av leukocyter från Human Maternal-foster Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Selektiv Skörd av Marginating-lung leukocyter

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Selektiv Skörd av Marginating-lever leukocyter

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypisk karakterisering av makrofager från råttnjure med flödescytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Lungsköljning av murina lungor Analysera infiltration av inflammatoriska celler

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

Renal subkapsulär transplantation av 2 '-Deoxyguanosinbehandlade murina embryonala bräss hos nakna möss

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...