Name: analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Teknik destek için Flow Cytometry Core Facility, Histopathology Laboratory, Fralin Imaging Center at Virginia Polytechnic Institute ve State University'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma çeşitli NIH ve dahili hibelerle desteklenmektedir.

Mevcut protokol, Virginia Tech'teki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Lupus hastalığı kadınlarda daha yüksek bir insidansa sahip olduğundan, sadece dişi MRL / lpr fareleri kullanılmıştır. Numune toplama 4 haftalıkken başlatıldı ve 15 haftada bitirildi. Fareler ticari kaynaklardan elde edildi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve kurumsal yönergeleri izleyerek belirli bir patojensiz ortamda yetiştirildi ve muhafaza edildi.
<p class="jov...

<ol>
	<li>Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Lupus+Erythematosus.">Systemic Lupus Erythematosus.</a> New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).</li><li>Davidson, A., Aranow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupus+nephritis:+lessons+from+murine+models.">Lupus nephritis: lessons from murine models.</a> Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).</li><li>Maldonado, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+environmental+antigens+in+the+spontaneous+development+of+autoimmunity+in+MRL-lpr+mice.">The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice.</a> Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).</li><li>Lech, M., Anders, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+lupus+nephritis.">The pathogenesis of lupus nephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).</li><li>Bagavant, H., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+kidney+disease+in+systemic+lupus+erythematosus.">Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus.</a> Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).</li><li>Li, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+autoantibody+clusters+that+best+predict+lupus+disease+activity+using+glomerular+proteome+arrays.">Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).</li><li>Arag&#243;n, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+biomarkers+in+lupus+nephritis.">Urinary biomarkers in lupus nephritis.</a> Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).</li><li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota.">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73 (2017).</li><li>Lu, T. -. S., Yiao, S. -. Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+biological+and+mechanical+variations+between+the+Lowry+versus+Bradford+method+for+protein+quantification.">Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).</li><li>Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+should+proteinuria+be+detected+and+measured.">How should proteinuria be detected and measured.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 46, 205-217 (2009).</li><li>Viswanathan, G., Upadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+proteinuria.">Assessment of proteinuria.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).</li><li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+outcomes+of+lupus+nephritis+with+tubulointerstitial+inflammation+and+scarring.">Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring.</a> Arthritis Care &amp; Research. 63 (6), 865-874 (2011).</li><li>Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bari&#233;ty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinuria+and+tubulointerstitial+lesions+in+lupus+nephritis.">Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis.</a> Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+B+cell-mediated+immune+responses+and+tubulointerstitial+inflammation+in+human+lupus+nephritis.">In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).</li><li>Schrezenmeier, E., Jayne, D., D&#246;rner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+B+Cells+and+plasma+cells+in+glomerular+diseases:+translational+perspectives.">Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).</li><li>Fitzgibbons, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+analytic+validation+of+immunohistochemical+assays:+Guideline+from+the+college+of+American+pathologists+pathology+and+laboratory+quality+center.">Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).</li><li>Lewis, M. J., Botto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+deficiencies+in+humans+and+animals:+links+to+autoimmunity.">Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity.</a> Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+renal+disease+in+MRL/lpr+mice+genetically+deficient+in+the+alternative+complement+pathway+factor+B.">Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B.</a> Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10+regulates+murine+lupus.">IL-10 regulates murine lupus.</a> Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).</li><li>Singh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+IL-4+and+STAT6+vs+STAT4+to+the+development+of+lupus+nephritis.">Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).</li><li>van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+targets+of+nephritogenic+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus.">Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).</li><li>Zuniga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+IgG+subclasses+and+C-reactive+protein+in+lupus+nephritis:+the+relationship+between+the+composition+of+immune+deposits+and+FCgamma+receptor+type+IIA+alleles.">Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).</li><li>Cabana-Puig, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+drift+in+lupus-prone+MRL/lpr+Mice:+potential+roles+of+micrornas+and+gut+microbiota.">Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota.</a> Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).</li><li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine.">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li><li>Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNaseI+treatment+is+a+prerequisite+for+the+amplification+of+cDNA+from+episomal-based+genes.">DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes.</a> Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).</li><li>Park, J. G. -., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+composition+in+normal+human+kidneys.">Immune cell composition in normal human kidneys.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining.">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li><li>Okutucu, B., D&#305;n&#231;er, A., Habib, &. #. 2. 1. 4. ;., Z&#305;hn&#305;oglu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+methods+for+determination+of+total+plasma+protein+concentration.">Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).</li></ol>

LN, SLE hastalarında mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir ve hastalığı şiddetlendiren faktörler belirsizliğini korumaktadır. Bu protokolün uygulanması, proteinüri ölçümü, izole böbrek lökositlerinin FACS analizi ve donmuş böbrek bölümlerinin immünofloresan boyanması dahil olmak üzere çoklu yöntemler kullanarak böbrek fonksiyonunu karakterize etmektir.
İdrar toplarken göz önünde bulundurulması gereken önemli bir nokta, günün saati ve idrar toplama ye...

Böbreğin birincil işlevi, su ve tuzların homeostazını korurken idrar yoluyla toksik maddelerin elimine edilmesidir1. Bu fonksiyon, sistemik lupus eritematozuslu (SLE) hastalarda tehdit altındadır ve lupus nefritine (LN) yol açar. LN, bağışıklık sisteminin böbreğe saldırmasının bir sonucudur, bu da kalıcı böbrek iltihabına yol açar, bu nedenle atıkları kandan temizleme ve tuz ve sıvı konsantrasyonlarını düzenleme yeteneğini kaybeder. Bu sonunda ölümcül olabilen böbrek yetmezliğine yol açacaktır. Nefritik süreç sırasında, dolaşımdaki B hücreleri, T hücreleri ve monositler böbreğe alınır, kemokinler, sitokinler ve immün kompleks oluşturan otoantikorlar salgılanır. Bu sonuçta endotel hücre hasarı, membranöz yaralanmalar, renal tübüler atrofi ve fibroz2 ile sonuçlanır.
MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) lupus eğilimli fareler, insan SLE3'e benzeyen lupus benzeri klinik bulgular sergileyen klasik bir fare modelidir. Bu model, SLE hastalarında mortalitenin önde gelen nedenlerinden biri olan lupus nefritinin (LN)4 anlaşılmasında etkili olmuştur. Hem insan hem de fare SLE'sinde LN, immün komplekslerin renal birikimi ile tetiklenen kademeli inflamasyon, ardından kompleman aktivasyonu, enflamatuar hücrelerin işe alınması ve böbrek fonksiyon kaybı ile karakterizedir5. İmmün kompleks birikimi, intrinsik böbrek hücreleri tarafından kemokin ve sitokin üretimini indüklemek için ilk adımdır ve bu da immün hücreleri işe alarak enflamatuar yanıtı genişletir6. Mevcut protokol, böbrek hastalığı progresyonunu takip etmek için hücre infiltrasyonunu ve immün kompleks birikimini analiz eden çeşitli teknikler sunmaktadır.
Her hafta toplanan idrar, lupus başlangıcından önce, sırasında ve sonrasında proteinürinin zaman seyrinin tespit edilmesini ve görselleştirilmesini sağlar. Bir biyobelirteç olarak proteinüri, LN'nin biyolojik ilerlemesini belirleyebilir. Bu tekniğin diğer avantajları, invaziv olmayan, uygun maliyetli ve uygulanması kolayolmasıdır 7. Böbrek mükemmel çalıştığında, proteinüri seviyesi sürekli olarak düşüktür; Bununla birlikte, MRL / lpr farelerinde, 8-9 haftalıktan sonra, proteinüri seviyesinde, sonunda böbrek yetmezliğine neden olacak kadar yüksek olan kademeli bir artış gözlenir8. Sorunu izlemek için çok sayıda reaktif şeridi ve kolorimetrik reaktifler ticari olarak temin edilebilir. Bununla birlikte, Bradford testi, proteinürinin başlangıcını ve lupus nefritinin seyrini belirlemede ucuz ve çok doğrudur. Bu tahlil hızlıdır ve reaktif, numunenizde bulunabilecek çözücülerin, tamponların, indirgeyici ajanların ve metal şelatlama ajanlarının varlığından etkilenmez 9,10,11.
Dikkate alınması gereken önemli bir husus, böbrekte hücre infiltrasyonudur. Bu infiltrasyonlar, inflamasyonu kötüleştirmek için sitokinler gibi çözünür faktörlerin salgılanmasını tetikleyerek patogenezi teşvik eder12. Sızıntılarda hangi hücre popülasyonlarının bulunduğunu daha iyi anlamak için, yararlı bir yöntem lökositleri izole etmektir13. Burada, B hücrelerinin renal infiltrasyonunun tespiti örnek olarak kullanılmıştır. Prosedür, deoksiribonükleaz (DNaz) ve kollajenaz içeren bir sindirim işlemi ile başlar, ardından döküntüleri, kırmızı kan hücrelerini ve yoğun granülositleri gideren yoğunluk gradyanı ayrımı ile devam eder. B hücrelerini (CD19+) ve plazma hücrelerini (CD138+) izole etmenin nedeni, lupus böbreklerinin bu hücreleri konsantre edebilmesidir14. Böbrekteki küçük agregalarda B hücrelerinin varlığının klonal genişlemeyi ve dolayısıyla immünoglobulin (Ig) üretimini gösterebileceği öne sürülmektedir. Plazma hücrelerinin bu agregalarda da mevcut olduğu iyi bilinmektedir15. Lökositler izole edildikten sonra, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), farklı floresan konjuge antikorlarla boyandıktan sonra ilgili hücreleri analiz etmek için kullanılabilir.
İmmünofloresan, 4 μm kalınlığındaki böbrek dokusu örneklerinde proteinlerin floresan olarak görüntülenmesini sağlayan immünohistokimya (IHC) tespit yöntemlerinden biridir. Diğer IHC tespit yöntemleri, analitlerin doğasına, bağlayıcı kimyaya ve diğer faktörlere bağlıdır16. İmmünofloresan, antijeni spesifik bir florokrom (veya floresan boya) ile etiketlenmiş muadili antikora maruz bırakan hızlı bir tanımlama yöntemidir. Heyecanlandığında, floresan mikroskobun tespit edebileceği ışık üretir. Bu teknik, kompleman C3 ve IgG2a17'nin birikimini gözlemlemek için kullanılabilir. Aşırı kompleman kaskad aktivasyonu, kontrolsüz bir immün yanıt ve fonksiyon kaybı ile ilişkili olabilir18. Böbrekte anti-çift sarmallı DNA (anti-dsDNA) otoantikorlarının immün birikimi, IgG2a izotipine sahip olanların LN20 ile ilişkili olduğu büyük bir endişe kaynağıdır19. Spesifik olarak, anti-dsDNA antikorları, nükleer materyallere daha fazla patojenite ve afinite göstererek bağışıklık kompleksleri oluşturur21. IgG2a mevcut olduğunda, bağışıklık komplekslerini temizlemek için C3 dahil olmak üzere kompleman kaskadı aktive edilir22. C3 ve IgG2a belirteçleri ayrı ayrı ölçülebilir veya korelasyonlarını oluşturmak için üst üste bindirilebilir.
Özellikle, serum kreatinin ölçümü, LN23'ü teşhis etmek için mikroskobik hematüri ve böbrek biyopsileri ile birlikte kullanılabilecek başka bir güvenilir tekniktir. Bununla birlikte, proteinüri varlığı glomerüler hasarın güçlü bir göstergesidir. Bu anlamda, lupus sırasında proteinüri seviyesinin izlenmesi, hastalığın başlangıcını tespit edebilir ve lupus tanısı için diğer yöntemleri tamamlayabilir. Ek olarak, glomerüllerde biriken bağışıklık kompleksleri enflamatuar bir yanıtı indükleyebilir, kompleman sistemini aktive edebilir ve daha fazla enflamatuar hücre alabilir. Bu protokolün dikkat çeken bir diğer noktası da böbrekte B hücresi infiltrasyonudur. Bu, infiltre edilmiş T hücreleri ile birlikte, organ hasarını tetikleyen lokal bağışıklık tepkilerini arttırır. Daha da önemlisi, LN'nin sınıflandırılması sadece mikroskopide görülen glomerüler morfolojik değişikliklere değil, aynı zamanda immünofloresan ile gözlenen immün birikintilere de dayanmaktadır. Bu nedenle, bu protokolde, laboratuvar ortamlarında böbrek fonksiyonlarının analizi için doğru ve uygun maliyetli yöntemler sunulmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J60764.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse C3</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL7632F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD138 BV711</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-212-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9511236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA-EC</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-ecdna</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 Microscope imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fusion Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>23272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail enamel</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any conventional store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T compound</td>
			<td>Tisse-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>R-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 20x TBS Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Albumin standard included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLon Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>FcR block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.1 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell Strainers 100 &#181;M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin Hydrochloride</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>V-200-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>fluorescent dye for flow cytometry analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of proteinuria, renal infiltration of leukocytes, and renal deposition of proteins in lupus-prone mrl/lpr mice

Sistemik lupus eritematozus (SLE), tedavisi bilinmeyen otoimmün bir hastalıktır ve böbrekler de dahil olmak üzere birçok organda kalıcı inflamasyon ile karakterizedir. Bu koşullar altında, böbrek atıkları kandan temizleme ve tuz ve sıvı konsantrasyonlarını düzenleme yeteneğini kaybeder ve sonunda böbrek yetmezliğine yol açar. Kadınlar, özellikle doğurganlık çağındakiler, erkeklerden dokuz kat daha sık teşhis edilir. SLE hastalarında böbrek hastalığı önde gelen mortalite nedenidir. Mevcut protokol, toplanan idrarda atılan protein seviyelerini ölçmek ve zaman içinde lupus ilerlemesini izlemek için hızlı ve basit bir yöntem tanımlamaktadır. Ek olarak, lökositlerin renal infiltrasyonunu araştırmak için boyut ve yoğunluk seçimine dayalı olarak böbrek mononükleer hücrelerini izole etmek için bir yaklaşım sağlanmıştır. Ayrıca, glomerüllerde protein birikimini ve tübülointerstisyel boşlukta lökosit infiltrasyonunu karakterize etmek için immünohistokimyasal bir yöntem geliştirilmiştir. Birlikte, bu yöntemler lupus eğilimli MRL / lpr farelerinin böbrekleri ile ilişkili kronik inflamasyonun ilerlemesini araştırmaya yardımcı olabilir.

Protokol, lupus nefriti için MRL / lpr farelerini değerlendirmek için birden fazla yöntem kullanır. İlk olarak, zamanla böbrek fonksiyon bozukluğuna bağlı olarak artan proteinüri seviyelerini incelemek için bir prosedür tanımlanmıştır. Şekil 1'de gösterildiği gibi, dişi fareler kontrol grubu olarak 200 μL fosfat tamponlu salin (1x PBS) oral gavajı ve tedavi grubu olarak probiyotik Lactobacillus reuteri ile haftada iki kez 109 cfu / mL konsantrasyonu...

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice at JoVE.com

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

Mevcut protokol, farelerde lupus ilerlemesini izlemek için bir yöntem açıklamaktadır. Böbreklerde hücre infiltrasyonu ve protein birikimine bağlı lupus nefritini karakterize etmek için iki ek prosedür sunulmuştur.

Lupus Eğilimli MRL/lpr Farelerde Proteinüri, Lökositlerin Renal İnfiltrasyonu ve Proteinlerin Renal Birikimi Analizleri

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Bu yöntemler, lupus hastalarında böbreklerle ilişkili kronik inflamasyonun ilerlemesini araştırmaya yardımcı olabilir. Lupusta hastalığın seyrini izlemek için kullanılabilecek güvenilir ve uygun maliyetli bir alternatif sunuyoruz. % 70 etanol püskürterek davlumbazın sterilize edilmesine başlayın ve yüzeye steril bir plastik tabaka yerleştirin.Daha sonra yaklaşık 20 mikrolitre idrar toplamak için uçlar, 1,5 mililitrelik tüpler ve bir pipet hazırlayın. Kafesi alın ve kaputun içine yerleştirmeden önce% 70 etanol püskürtün. Daha sonra, fareyi bir elinizle tutun ve ventral bölgeye yukarıdan aşağıya nazikçe masaj yapmak için diğer elinizi kullanın.1,5 mililitrelik bir tüp veya pipet kullanarak idrarı doğrudan toplayın. Veya numune düşerse plastik tabakadan toplayın. Sonra fareyi tekrar kafese koyun.Disseke edilmiş böbrekleri tane büyüklüğüne kesin ve HEPES içeren RPMI 1640 ortamında Kollajenaz ve DNaz 1 içeren beş mililitre sindirim tamponunda bir saat boyunca 37 santigrat derecede sürekli hafifçe sallanarak sindirim. 10 milimolar EDTA içeren 10 mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra süspansiyonu iki kez vorteksleyin.Daha sonra, hücre süspansiyonunu 100 mikrometrelik bir süzgeçten süzün ve 10 mililitre HBSS dolu olarak yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj yapın. % 30, 37 ve% 70'lik bir stok izotonik Percoll çözeltisi hazırlayın ve% 70'lik çözeltinin üzerine% 37'lik bir Percoll çözeltisi tabakası ekleyin.Re, hücreleri beş mililitre% 30 stok izotonik Percoll içinde askıya alın. Bir Pasteur pipet kullanarak üstten beş mililitrenin %37'sini ve alttan beş mililitrenin %70'ini yavaşça yükleyerek stok izotonik Percoll gradyanı oluşturur. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1000 kez G'de dokuz numaraya kadar ve sıfır numaraya kadar santrifüjleyin.Daha sonra, lökositleri% 37 ila% 70 arayüzünden toplayın ve bunları beş mililitre C 10'da yeniden askıya alın. Yine, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj. Daha sonra hücre peletini üç mililitre faks tamponunda yeniden askıya alın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj yapın.Ardından, toplam hacmin yaklaşık 50 mikrolitresini bırakarak süpernatantı atın. Tüp başına 50 mikrolitre FC reseptör bloğu ekleyin. Bu karışımı takiben karanlıkta buz üzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra, yıkamak için iki mililitre faks arabelleği ekleyin. Daha sonra, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj yapın ve toplam hacmin yaklaşık 50 mikrolitresini bırakarak süpernatenti atın. Daha sonra, 20 mikrolitre uygun floresan boya ekleyin ve buz üzerinde 15 ila 30 dakika bekletin.CD 138 parlak menekşe yedi 11 ve CD 45 Alexa Fluor 700 içeren tüp başına 50 mikrolitre antikor karışımı ekleyin ve karanlıkta 15 ila 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. Daha sonra, üç mililitre faks arabelleği ekleyin. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj.Süpernatantı toplam hacmin yaklaşık 50 mikrolitresini bırakarak vakumla çıkarın. Daha sonra, hücre peletini 200 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Numuneyi toplamak için yarım böbreği en uygun kesme sıcaklığı bileşiği ile küçük plastik kriyomolda gömün.Daha sonra bir polistiren köpük kutusuna kuru buz ekleyin ve kriyomoldu dikkatlice kuru buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, kriyokalıbı çıkarın, alüminyum folyoya sarın ve daha fazla kullanana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Daha sonra kuruyu 10 dakika boyunca soğuk asetonla dört mikrometrelik bölüme sabitleyin.Slaytları sabitledikten sonra, 0,5 ila bir saat boyunca hava kurutun ve kısa bir süre eksi 20 santigrat derecede veya uzun süre eksi 80 santigrat derecede saklayın. Numuneleri lekelemek için, slaytları beş ila 10 dakika boyunca soğuk asetonda yeniden sabitleyin ve bölümlerin oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. Daha sonra, bir pat kalemi kullanarak, bölümün etrafına hidrofobik bir daire çizin ve kurumasını bekleyin.Daha sonra slaytları TBS'ye 20 dakika boyunca Copeland kavanozuna yerleştirin ve kavanozu çalkalayıcının üzerine koyarak hafifçe çalkalayın. Daha sonra, TBS'yi dökün ve kavanozu TBS% 5 BSA ve% 0.1 TW 20 ile doldurun. Daha sonra, çalkalayıcı üzerinde hafifçe sallayarak kavanozu 20 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, slaytları çıkarın ve slaytların alt kısmını silin. Bölüme 100 mikrolitre konjuge antikor C3 fit C ve IgG2 APE ekleyin ve oda sıcaklığını nemlendirilmiş bir odada bir saat boyunca inkübe edin. Kesiti çalkalayıcıda 10 dakika boyunca PBS% 5 BSA ve% 0.1 TW 20'de üç kez yıkayın ve ardından slaytları kurulayın.Bölümü bir solma önleyici reaktifle ve ardından bir kapak kaymasıyla monte edin. Ardından, mikroskop altında görüntülenene kadar slaytları dört santigrat derecede saklayın. Görüntü J yazılımını kullanarak görüntü analizi için, istenen bölgeyi ana hatlarıyla belirtin.Daha sonra, analiz et'e tıklayarak standart parametreleri ayarlayın, ardından sonuçları almak için ölçümleri ve ölçüm alanını ayarlayın. Ardından, hesaplama pencerelerinden elde edilen verileri bir e-tabloya aktarın. İşiniz bittiğinde, bölgeyi ölçmek ve verileri tekrar önceki e-tabloya aktarmak için analiz et'e tıklayın.MRL LPR farelerinin idrarındaki protein düzeyleri zamanla tespit edildi ve kontrol grubu olarak fosfat tamponlu salin ve tedavi grubu olarak lactobacillus reuteri ile tedavi edildi. L.reuteri ile tedavi edilen fare grubu, kontrol grubundan daha agresif bir proteinüri progresyonunda. İzole böbrek lökositlerinin plazma hücrelerini analiz etmesi için faks analizi yapıldı.Ayrıca, fareler Escherichia coli çift sarmallı DNA ile birlikte vankomisin veya vankomisin ile tedavi edildi. Escherichia coli çift sarmallı DNA'nın renal infiltrasyonu tetiklemesi beklenmesine rağmen, plazma hücrelerinin yüzdesinde anlamlı bir fark bulunamadı. Kompleman C3 ve IgG2a, kadın MRL IPR böbrek kesitlerinde immünofloresan boyama ile saptandı.C3 ve IgG2a'nın böbrek birikimi üzerindeki etkili çevresel faktörler, hayvan tesisindeki kurum içi fare ekmeği ve bir satıcıdan satın alınanlar için karşılaştırılmıştır. İmmünohistokimyasal analiz iki grup arasında herhangi bir fark göstermedi. ISO 20 Percoll çözümünün her bir katmanını stok yüzdesinin her bir katmanını eklemek zor olabilir ve eğer karışırlarsa yeniden başlamanız gerekir.Bu prosedür akış sitometresine ve in vitter deneylere yardımcı olur, bu nedenle farklı böbrek hücresi tipi popülasyonlarını inceleyemezsiniz. Bu prosedür, böbreklere sızan B hücrelerini incelememize izin verir ve literatürde çok fazla bilgi yoktur.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Çekal ligasyon ve Farelerde Autophagy incelemek için bir model olarak Sepsis Patamaya kaynaklı

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Akış adlı lökositlerin üzerine Stromal hücreler Etkilerinin İncelenmesi

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Marginating pulmoner lökosit seçici Hasat

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Marginating-hepatik lökosit seçici Hasat

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Akış Sitometrisi ile Sıçan Böbrek gelen Makrofagların Fenotipik Karakterizasyonu

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

Çıplak farelerde 2 '-Deoxyguanosine tedavi Murine embriyonik Thymus renal subkapsüler nakli

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...