Name: eye removal in living zebrafish larvae to examine innervation-dependent growth and development of the visual system
Uploaded: 2022-02-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System at JoVE.com

تم دعم تمويل هذا العمل في المقام الأول من خلال أموال بدء التشغيل من كلية ريد إلى KLC ، وأموال زمالة هيلين ستافورد للأبحاث إلى OLH ، وزمالة أبحاث العلوم في كلية ريد إلى YK. بدأ هذا المشروع في مختبر ستيف ويلسون كتعاون مع الموارد البشرية ، الذي تم دعمه من قبل Wellcome Trust Studentship (2009-2014). نشكر ماتي فارغا وستيف ويلسون وأعضاء آخرين في مختبر ويلسون على المناقشات الأولية حول هذا المشروع ، ونشكر بشكل خاص فلورنسيا كافوداسي وكيت إدواردز ، الذين كانوا أول من علم KLC كيفية تركيب الأجنة في الأغاروز وإجراء تشريح دماغ الزرد. كما نشكر غريتا غلوفر وجاي إيوينغ على المساعدة في تجميع جهاز شحذ إبرة التنغستن.

تم إجراء الأساليب الواردة في هذه الورقة وفقا للمبادئ التوجيهية وموافقة لجان رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في كلية ريد وكلية لندن الجامعية. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول سلالات أسماك الزرد المستخدمة في هذه الدراسة.
1. إعداد المواد والأدوات
<o...

<ol>
	<li>Butler, A. B., Hodos, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+tectum.">Optic tectum.</a> Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , 311-340 (2005).</li><li>Cang, J., Feldheim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+mechanisms+of+topographic+map+formation+and+alignment.">Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment.</a> Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).</li><li>Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+circuits+of+visual+perception+and+cognition+through+the+superior+colliculus.">Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus.</a> Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).</li><li>Burrill, J. D., Easter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+retinofugal+projections+in+the+embryonic+and+larval+zebrafish+(Brachydanio+rerio).">Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio).</a> The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).</li><li>Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System Available from: <a target="_blank" href="https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/">https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/</a> (2021)</li><li>Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System Available from: <a target="_blank" href="https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/">https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/</a> (2021)</li><li>Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continued+growth+and+circuit+building+in+the+anamniote+visual+system.">Continued growth and circuit building in the anamniote visual system.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).</li><li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish.">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).</li><li>Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+has+a+specific+influence+on+optic+nerve+and+tectum+development+in+the+blind+cavefish+Astyanax.">The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax.</a> Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).</li><li>White, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+study+of+the+relationship+between+the+size+of+the+eye+and+the+size+of+the+optic+tectum+in+the+brain+of+the+developing+teleost,+Fundulus+heteroclitus.">An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus.</a> Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).</li><li>Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+growth+of+the+optic+tectum+in+goldfish.+II.+Modulation+of+cell+proliferation+by+retinal+fiber+input.">Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input.</a> The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).</li><li>Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+nerve+input-dependent+regulation+of+neural+stem+cell+proliferation+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish.">Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).</li><li>Hall, Z. J., Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+experience+facilitates+BDNF-dependent+adaptive+recruitment+of+new+neurons+in+the+postembryonic+optic+tectum.">Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marc's+modified+Ringer's+(MMR)+(10X,+pH+7.4).">Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4).</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li><li>Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+dissection+of+zebrafish+brain+development.">Anatomical dissection of zebrafish brain development.</a> Brain Development. 1082, 197-214 (2014).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>. ZFIN Tricaine recipe Available from: <a target="_blank" href="https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE">https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</a> (2018)</li><li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues.">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028 (2010).</li><li>. ZFIN protocols Available from: <a target="_blank" href="https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview">https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview</a> (2021)</li><li>Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trov&#242;, L., Paquet, D., Godinho, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+subcellular+structures+in+the+living+zebrafish+embryo.">Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456 (2016).</li><li>ImageJ with batteries included. Fiji Available from: <a target="_blank" href="https://figi.sc/">https://figi.sc/</a> (2021)</li><li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins.">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).</li><li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo.">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).</li><li>Karlstrom, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mutations+affecting+retinotectal+axon+pathfinding.">Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding.</a> Development. 123 (1), 427-438 (1996).</li><li>Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+nerve+regeneration+in+larval+zebrafish+exhibits+spontaneous+capacity+for+retinotopic+but+not+tectum+specific+axon+targeting.">Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting.</a> PLOS ONE. 14 (6), 0218667 (2019).</li><li>Robles, E., Filosa, A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+lamination+of+retinal+axons+generates+multiple+parallel+input+pathways+in+the+tectum.">Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum.</a> Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).</li><li>Vargas, M. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+Is+Wallerian+degeneration+in+the+CNS+so+slow.">Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).</li><li>Hughes, A. N., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+phagocytose+myelin+sheaths+to+modify+developmental+myelination.">Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination.</a> Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).</li><li>de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+physiological+analysis+in+a+zebrafish+model+of+epilepsy.">Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837 (2021).</li><li>Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+external+medium+composition+on+membrane+water+permeability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos.">The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos.</a> Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).</li><li>Fredj, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+activity-dependent+competition+regulates+axon+arbor+maturation,+growth+arrest,+and+territory+in+the+retinotectal+projection.">Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection.</a> Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).</li><li>Alberio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-gated+potassium+channel+for+sustained+neuronal+inhibition.">A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition.</a> Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).</li><li>Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+genesis+requires+lakritz,+a+zebrafish+atonal+homolog.">Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog.</a> Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).</li><li>Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+activity-deprived+zebrafish+mutant+macho+reveals+an+essential+requirement+of+neuronal+activity+for+the+development+of+a+fine-grained+visuotopic+map.">Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).</li><li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astyanax+surface+and+cave+fish+morphs.">Astyanax surface and cave fish morphs.</a> EvoDevo. 11 (1), 14 (2020).</li><li>Sieger, D., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+studying+microglia:+The+first,+the+popular,+and+the+new.">Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new.</a> Glia. 61 (1), 3-9 (2013).</li><li>Svahn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ramified+microglia+from+early+macrophages+in+the+zebrafish+optic+tectum.">Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum.</a> Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).</li><li>Herzog, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+clearance+of+cellular+debris+by+microglia+limits+secondary+neuronal+cell+death+after+brain+injury+in+vivo.">Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo.</a> Development. 146 (9), (2019).</li><li>Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-imaging+of+astrocyte+morphogenesis+and+function+in+zebrafish+neural+circuits.">Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).</li></ol>

توضح التقنيات الموصوفة في هذه الورقة واحدة من العديد من الطرق لدراسة تطور النظام البصري للفقاريات في أسماك الزرد. نشر باحثون آخرون طرقا لتشريح الشبكية الجنينية وإجراء تحليلات التعبير الجيني19 أو تصور النشاط العصبي في التكتوم البصري30. تقدم هذه الورقة نهجا لاستكش?...

الهدف من هذه الطريقة هو التحقيق في كيفية تأثير مدخلات الشبكية على نمو وتطور التكتوم البصري ، وهو مركز المعالجة البصرية في دماغ الزرد. من خلال إزالة عين واحدة ثم مقارنة جانبي التكتوم البصري ، يمكن ملاحظة التغيرات التكتالية داخل نفس العينة وتطبيعها ، مما يتيح المقارنة عبر عينات متعددة. سوف تسفر الأساليب الجزيئية الحديثة جنبا إلى جنب مع هذه التقنية عن رؤى ثاقبة حول الآليات الكامنة وراء نمو النظام البصري وتطوره ، بالإضافة إلى الانحطاط والتجديد المحوري.
تجمع الأنظمة الحسية - البصرية والسمعية والحسية الجسدية - المعلومات من الأعضاء الخارجية وتنقل تلك المعلومات إلى الجهاز العصبي المركزي ، وتولد "خرائط" للعالم الخارجي عبر الدماغ المتوسط 1,2. الرؤية هي الطريقة الحسية السائدة لجميع الفقاريات تقريبا ، بما في ذلك العديد من الأسماك. تجمع شبكية العين، وهي النسيج العصبي في العين، المعلومات مع دائرة عصبية تتكون في المقام الأول من المستقبلات الضوئية، والخلايا ثنائية القطب، وخلايا العقدة الشبكية (RGCs)، وهي الخلايا العصبية الإسقاط في شبكية العين. تحتوي RGCs على محاور طويلة تجد طريقها عبر السطح الداخلي للشبكية إلى رأس العصب البصري ، حيث تبهر وتنتقل معا عبر الدماغ ، وتنتهي في النهاية في مركز المعالجة البصرية في الدماغ المتوسط الظهري. ويسمى هذا الهيكل التكتوم البصري في الأسماك وغيرها من الفقاريات غير الثدييات وهو متجانس مع كوليكولوس متفوقة في الثدييات3.
التكتوم البصري هو بنية متعددة الطبقات متماثلة ثنائيا في الدماغ المتوسط الظهري. في أسماك الزرد ومعظم الأسماك الأخرى ، يتلقى كل فص من التكتوم البصري مدخلات بصرية فقط من العين المقابلة ، بحيث ينتهي العصب البصري الأيسر في الفص التكتال الأيمن وينتهي العصب البصري الأيمن في الفص التكتالي الأيسر4 (الشكل 1). مثل نظيره الثدييات ، كوليكولوس المتفوق ، يدمج التكتوم البصري المعلومات البصرية مع المدخلات الحسية الأخرى ، بما في ذلك الاختبار والإحساس الجسدي ، والتحكم في التحولات في الانتباه البصري وحركات العين مثل saccades 1,5,6. ومع ذلك ، على عكس كوليكولوس الثدييات العليا ، فإن التكتوم البصري يولد باستمرار خلايا عصبية ودبقية جديدة من مكانة الخلايا الجذعية المتخصصة بالقرب من الحواف الإنسية والذيلية للفصوص التكتالية التي تسمى منطقة الانتشار التكتالي7. تساهم صيانة السلف التكاثرية في التكتوم البصري ومناطق أخرى من الجهاز العصبي المركزي ، جزئيا ، في القدرة التجديدية الرائعة الموثقة في الزرد8.
كشفت الأبحاث السابقة التي فحصت أدمغة الأسماك العمياء أو ذات العين الواحدة أن حجم التكتوم البصري يتناسب طرديا مع كمية تعصيب الشبكية التي يتلقاها9،10،11. في أسماك الكهوف البالغة ، التي تتدهور عيونها في التكوين الجنيني المبكر ، يكون التكتوم البصري أصغر بشكل ملحوظ من الأسماك السطحية المبصرة ذات الصلة الوثيقة9. يمكن منع تنكس عين سمكة الكهف عن طريق استبدال العدسة الداخلية بعدسة من سمكة سطحية أثناء التكوين الجنيني. عندما يتم تربية أسماك الكهوف ذات العين الواحدة هذه حتى مرحلة البلوغ ، يحتوي الفص التكتال المعصب على خلايا أكثر بنسبة 10٪ تقريبا من الفص التكتال غير المعصب9. وبالمثل ، في أسماك اليرقات اليرقات التي تم احتضانها بعلاجات كيميائية لتوليد عيون بأحجام مختلفة داخل نفس الفرد ، كان جانب التكتوم مع المزيد من التعصيب أكبر ويحتوي على المزيد من الخلايا العصبية10. تشير الأدلة المستقاة من تجارب سحق العصب البصري في الأسماك الذهبية البالغة إلى أن التعصيب يعزز الانتشار ، مع انخفاض تكاثر الخلايا التكتالية عندما تعطل التعصيب11.
وتأكيدا لهذه الدراسات الكلاسيكية وتوسيعها، تقدم العديد من التقارير الحديثة بيانات تشير إلى أن الانتشار استجابة للتعصيب يتم تعديله، جزئيا على الأقل، من خلال مسار BDNF-TrkB12,13. لا تزال هناك العديد من الأسئلة المفتوحة حول نمو التكتوم البصري وتطوره ، بما في ذلك كيفية تعامل النظام الحسي النامي مع الإصابة وانحطاط المحور العصبي ، والإشارات الخلوية والجزيئية التي تمكن مدخلات الشبكية من تنظيم نمو التكتوم البصري ، ومتى تصبح هذه الآليات نشطة ، وما إذا كان الانتشار والتمايز المرتبطان بالتعصيب يمكنان شبكية العين وأنسجتها المستهدفة من تنسيق معدلات النمو وضمان رسم خرائط دقيقة للشبكية الشبكية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك أسئلة أكبر بكثير حول التطور المعتمد على النشاط والتي يمكن معالجتها عن طريق استجواب النظام البصري لأسماك الزرد باستخدام الأساليب الجراحية مثل تلك الموضحة أدناه.
للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي يغير بها النشاط العصبي ، وتحديدا من المدخلات البصرية ، بقاء الخلايا وانتشارها ، يقارن النهج الموصوف مباشرة الفصوص التكتالية المعصبة والمشوهة (الشكل 1) داخل يرقات الزرد الفردية. تسمح هذه الطريقة بتوثيق تنكس محور RGC في التكتوم البصري وتأكيد أن عدد الخلايا الانقسامية يرتبط بالتعصيب.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63509/63509fig01.jpg"> الشكل 1: رسومات ليرقات الزرد قبل وبعد إزالة العين من جانب واحد . (أ) رسم يرقات 5 dpf كما ينظر إليها تحت المجهر تشريح. يتم تضمين كل يرقة في الأغاروز منخفض الانصهار وتوجيهها أفقيا قبل استخدام إبرة التنغستن ذات الطرف الحاد المدمن على المخدرات لإخراج العين متجهة لأعلى (العين اليسرى في هذا المثال). (ب) رسم المنظر الظهري ليرقة 9 dpf الناتجة عن الجراحة الموضحة في A. تظهر ثلاثة محاور RGC عالية التخطيط فقط من العين اليمنى وهي تزيل اللفافة وتتصل بالخلايا العصبية في الفص التكتالي الأيسر. الاختصارات: dpf = أيام بعد الإخصاب ؛ dps = أيام ما بعد الجراحة; RGC = خلايا العقدة الشبكية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63509/63509fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment and supplies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breeding boxes</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high vacuum grease</td>
			<td>Sigma or equivalent supplier</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks (125 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>DWK Lifescience</td>
			<td>63A53 &#38; 63A53WT</td>
			<td>For pipetting embryos and larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides for microscopy</td>
			<td>VWR or equivalent supplier</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware including graduated bottles and graduated cylinders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making and storing solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-part epoxy resin</td>
			<td>ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent</td>
			<td>0.85 oz syringe</td>
			<td>https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.7 mL)</td>
			<td>VWR or equivalent supplier</td>
			<td>22234-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel plated pin holder (17 cm length)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>26018-17</td>
			<td>To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh tea strainer or equivalent</td>
			<td>Ali Express or equivalent</td>
			<td></td>
			<td>For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper clip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>Fischer Scientific or equivalent supplier</td>
			<td>50-190-0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mm</td>
			<td>Fischer Scientific or equivalent supplier</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette pump</td>
			<td>SP Bel-Art or equivalent</td>
			<td>F37898-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>909122</td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (variable voltage)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire (0.125 mm diameter)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>TGW0515</td>
			<td>Sharpen to remove eye and dissect larvae.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable temperature heat block</td>
			<td>The Lab Depot or equivalent supplier</td>
			<td>BSH1001 or BSH1002</td>
			<td>Set to 40-42 &#176;C ahead of experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wires with alligator clip leads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. 
			Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for surgeries and dissections:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Make 1% in embryo medium (E3) or Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374248</td>
			<td>For embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19210</td>
			<td>Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td>Dilute 1:100 in Marc&#39;s Modified Ringers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) tablets</td>
			<td>Diagnostic BioSystems</td>
			<td>DMR E404-01</td>
			<td>Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>100G #TRS1</td>
			<td>Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for immunohistochemistry:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI or ToPro3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1306 or T3605</td>
			<td>Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>A component of immunoblock buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td>Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50-062Z</td>
			<td>A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody to detect phosphohistone H3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td>Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)</td>
			<td>MBL International</td>
			<td>PM005</td>
			<td>Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (PK)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308-10MG</td>
			<td>Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 &#181;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Fiji)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop or GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available from the&#160; Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

eye removal in living zebrafish larvae to examine innervation-dependent growth and development of the visual system

تظهر أسماك الزرد نموا ملحوظا مدى الحياة وقدرات تجديدية. على سبيل المثال، تدعم منافذ الخلايا الجذعية المتخصصة التي تم إنشاؤها أثناء التكوين الجنيني النمو المستمر للنظام البصري بأكمله، سواء في العين أو الدماغ. يضمن النمو المنسق بين الشبكية والتكتوم البصري رسم خرائط دقيقة للشبكية مع إضافة خلايا عصبية جديدة في العينين والدماغ. لمعالجة ما إذا كانت محاور الشبكية توفر معلومات حاسمة لتنظيم سلوكيات الخلايا الجذعية التكتالية والسلف مثل البقاء على قيد الحياة والانتشار و / أو التمايز ، من الضروري أن تكون قادرا على مقارنة الفصوص التكتالية المعصبة والمتوترة داخل نفس الحيوان وعبر الحيوانات. 
الاستئصال الجراحي لعين واحدة من الزرد اليرقي الحي تليها مراقبة التكتوم البصري يحقق هذا الهدف. يوضح الفيديو المصاحب كيفية تخدير اليرقات ، وشحذ إبر التنغستن كهربائيا ، واستخدامها لإزالة عين واحدة. ويوضح بعد ذلك كيفية تشريح الأدمغة من يرقات الزرد الثابتة. وأخيرا، يقدم الفيديو لمحة عامة عن بروتوكول الكيمياء النسيجية المناعية وعرضا توضيحيا لكيفية تركيب الأجنة الملطخة في الأغاروز منخفض درجة الانصهار للفحص المجهري.

للتأكد مما إذا كانت إزالة العين قد اكتملت وتقييم كيفية تغير التكتوم البصري ، تم إجراء العمليات الجراحية في سلالة Tg[atoh7: RFP] ، والتي تضع علامات على جميع RGCs مع RFP مستهدف بالغشاء ، وبالتالي ، جميع المحاور التي تظهر من شبكية العين وتشكل العصب البصري24. على الرغم من أن استخدام هذه ...

Watch this Scientific Journal Video about Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System at JoVE.com

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

يشرح المقال كيفية إزالة العينين جراحيا من يرقات الزرد الحية كخطوة أولى نحو التحقيق في كيفية تأثير مدخلات الشبكية على نمو التكتوم البصري وتطوره. بالإضافة إلى ذلك ، توفر المقالة معلومات حول تخدير اليرقات وتثبيتها وتشريح الدماغ ، تليها الكيمياء النسيجية المناعية والتصوير البؤري.

إزالة العين في يرقات الزرد الحية لفحص النمو والتطور المعتمد على التعصيب للنظام البصري

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

لذا فإن مختبري مهتم بفهم كيفية نمو العين والدماغ معا. تسمح لنا هذه التقنية بدراسة كيفية تأثير مدخلات الشبكية على نمو الدماغ وتطوره. يسمح لنا الاستئصال الجراحي لعين واحدة من الزرد اليرقي الحي ، متبوعا بمراقبة التكتوم البصري بمقارنة الفصوص التكتالية المعصبة والمشوهة داخل نفس الحيوان وعبر الحيوانات.إن الجمع بين هذه التقنية والأساليب الجزيئية الحديثة يمكن أن يعطي نظرة جديدة على الآليات الكامنة وراء التطور العصبي والتجديد والانحطاط. للبدء ، قم بتوصيل أسلاك الكاثود والأنود بمصدر الطاقة. قم بتوصيل مشبك التمساح في نهاية سلك الكاثود بمشبك ورق مستقيم جزئيا وأدخل مشبك الورق في محلول هيدروكسيد البوتاسيوم ، مع إرفاقه بجانب الجرة.نعلق مشبك التمساح من سلك الأنود على عنق حامل الإبرة. حول الطاقة إلى حوالي 20 فولت واغمس سلك التنغستن في محلول هيدروكسيد البوتاسيوم ، واسحب السلك من المحلول بزاوية لشحذ السلك كهربائيا إلى طرف دقيق. تحقق من طرف الإبرة تحت المجهر التشريحي للتأكد من أنها حادة بما فيه الكفاية.ينتج طرف إبرة المنحنى عندما يتم ثني الإبرة الحادة عن طريق لمسها بلطف إلى طبق Petri. في يوم الجراحة ، استخدم ماصة مراعي زجاجية واسعة التجويف لنقل 10 إلى 15 يرقات إلى طبق بتري 35 ملم مملوء ب E3 الطازج. أضف ثلاث إلى خمس قطرات من المخدر إلى اليرقات. لتحديد ما إذا كانت اليرقات مخدرة بشكل كاف ، ابحث عن نقص استجابة اللمس.أضف قطرتين إلى ثلاث قطرات أخرى من المخدر إذا كانت اليرقات لا تزال تستجيب للمس بعد ثلاث دقائق وتعيد تقييمها. لشل حركة اليرقة للجراحة ، خذ يرقة واحدة إلى ماصة مراعي زجاجية ضيقة التجويف مع كمية صغيرة فقط من E3. بعد ذلك ، تناول ما يقرب من 200 ميكرولتر من نقطة الانصهار المنخفضة بنسبة 1٪ أو أغاروز LMP في الماصة التي تحتوي على اليرقة واخلطها لضمان تعليق اليرقة في أغاروز LMP. ضع غطاء طبق بتري 35 ملم مواجها تحت المجهر التشريحي ، ثم رش اليرقة والأغاروز على غطاء طبق بتري رأسا على عقب.انشر الأغاروز بحيث تكون اليرقة في وسط القطرة. باستخدام إبرة التنغستن الباهتة ، قم بمناورة اليرقة بسرعة ولكن بلطف بحيث تكون جانبية مع توجيه عين واحدة لأعلى. انتظر عدة دقائق حتى يتم تعيين الأغاروز.بعد حافة مدار العين ، استخدم طرف إبرة التنغستن الدقيقة التي تم شحذها كهربائيا لاختراق الجلد حول العين. ثم حرك حافة الإبرة تحت العين من الجانب الصدغي البطني للعين. استخدم الضغط المتحكم فيه لتحرير العين من المقبس.استمر في الضغط على العين ظهريا وأماميا مع جانب الإبرة ، وفي النهاية قم بتقطيع العصب البصري وإطلاق العين. بدلا من ذلك ، يمكنك استخدام ملقط جراحي دقيق جدا لإزالة العين عن طريق قرص العصب البصري ودفع العين من الإنسي إلى الجانبي. بعد إزالة العين بنجاح ، قم بتغطية الأغاروز بمحلول MMR ، وحرر كل يرقة من الأغاروز عن طريق تنظيف إبرة التنغستن بلطف حول رأسها ثم حول جسمها ، مع تثبيت غطاء طبق بتري بالملقط.بعد العمليات الجراحية ، ضع اليرقة في محلول MMR المكمل بالمضادات الحيوية حتى اليوم التالي ، ثم أعد اليرقة إلى E3 وقم بإعادتها حتى نقطة نهاية التجربة. بعد تخدير اليرقة نهائيا ، قم بإصلاحها بنسبة 4٪ paraformaldehyde. اليرقات الثابتة في قطرات PBS على لوحة واقية من الختم تحت مجهر تشريح.قم بتأمينها أفقيا عن طريق وضع اثنين من دبابيس التنغستن من خلال notochord مع دبوس واحد خلفي إلى المنطقة المصطبغة التي تغطي منطقة AGM وآخر يتماشى مع نهاية امتداد صفار البيض. قم بإزالة العين بإبرة التنغستن الحادة والملقط الدقيق. في بعض الأحيان يكون من الممكن كز الإبرة من خلال الفك إلى الجانب الآخر وإزالة العين الأخرى.استخدم إبرة التنغستن للخدش من الجانب الصدغي إلى الجانب البطني من الأذن. في نفس الإجراء أثناء الحركة ، أحضر الإبرة الخلفية إلى الفك واسحبها بلطف إلى الأمام حتى تتم إزالة الأذن والفك. قم بإزالة العين والأذن الأخرى عن طريق دس الإبرة عبر الفك.استخدم الملقط لسحب الأعضاء البطنية وصفار البيض المتبقي. أخيرا ، قم بعمل شق ضحل في جلد الجمجمة الظهرية بالقرب من التقاطع بين الدماغ الخلفي والحبل الشوكي. ارفع الجلد باستخدام الملقط واسحبه أماميا وحول الدماغ الدماغي.إزالة أي الأنسجة المتبقية مع ملقط. قم بفك اليرقة ونقلها إلى PBS إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 ملليلتر. قم بتأمين شريحة حجرية في غطاء طبق بتري 100 ملم مع شحوم فراغية.انقل اليرقة الملطخة بالمناعة والمعالجة إلى صفيحة بئر أو شريحة اكتئاب لعرضها باستخدام مجهر تشريح. قم بتركيب اليرقة على الشريحة الحجرية في أعمدة أغاروز LMP بنسبة 1٪. باستخدام كوب بعد الماصة الخاصة بك ، ضع يرقة واحدة على الشريحة الحجرية ، وترسب أقل قدر ممكن من PBS.قم بتغطية اليرقة بأغاروز LMP المذاب والدافئ بنسبة 1٪ باستخدام نفس الماصة. ماصة LMP agarose في عمود ثم وضع اليرقة بشكل متماثل قدر الإمكان مع السطح الظهري مرئية. بعد إزالة العين ، لوحظ تنكس تدريجي للمحاور العصبية للشبكية في neuropil التكتوم البصري.وبحلول يومين بعد الجراحة، أظهرت المحاور المحورية المسماة ب RFP علامات مميزة للانحطاط الواليري السريع، مثل التخبط والتشظي. لوحظت بوصلة إيجابية RFP داخل وخارج neuropil على الجانب الأيمن من التكتوم كما هو موضح في الأسهم. وبحلول أربعة أيام بعد الجراحة، انخفضت المحاور المجزأة والحطام المحوري المسمى RFP بشكل كبير في الفص التكتالي الأيمن، مما يشير إلى إزالة سريعة نسبيا للمحاور العصبية المحتضرة والمتدهورة.تم الكشف عن الدماغ عن طريق تشريح العينين والفك والأذنين وقلنسوة الجلد والأنسجة الضامة. من الناحية المثالية ، يبقى الدماغ سليما أثناء هذا الإجراء. ومع ذلك ، من المحتمل أن تكون أجزاء من الدماغ الأمامي ، وخاصة المصباح الشمي ، قد تضررت أو تمت إزالتها بالكامل عند إزالة غطاء الجمجمة من الجلد أو الفك.علاوة على ذلك ، في بعض الأحيان يتم تقطيع الحافة الجانبية للتكتوم عند ثقب الجلد أو قرصه لسحبه من الدماغ. لا توجد عينتان متطابقتان. لذلك يجب أن تكون قادرا على إجراء تعديلات دقيقة من خلال إزالة العين وتشريح الدماغ حسب الحاجة.المرضى والأدوات الحادة ضرورية للنجاح. يمكن متابعة هذه التقنية بنهج خلوية وجزيئية ، مثل تصوير الخلايا الحية في الجسم الحي أو تسلسل الحمض النووي الريبي لاكتساب رؤى جديدة حول الآليات الجزيئية والخلوية لنمو التكتوم البصري وتطوره.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

قياس الاستقرار البروتين المتواجد في الحي اسماك الزرد الأجنة عن طريق الإسفار تسوس بعد Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

باستخدام ورقة ضوء مضان المجهري لصورة التنمية الزرد العين

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

طرق لفحص الليمفاوية الغدة وHemocytes في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

تصوير مرور الوقت فوتون متعددة لتصور التنمية في الوقت الحقيقي: التصور لترحيل الخلايا العصبية كريست في الأجنة الزرد

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

فوتوكونفيرسيون خلية واحدة في معيشة سليمة الزرد

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

التهجين الكامل في الموقع في أجنة حمار وحشي وأنبوب تشكيل اساي في iPSC-ECs لدراسة دور Endoglin في التنمية الوعائية

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

كامل جبل المناعة الكيمياء في الأجنة حمار وحشي واليرقات

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...