Name: eye removal in living zebrafish larvae to examine innervation-dependent growth and development of the visual system
Uploaded: 2022-02-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System at JoVE.com

この研究のための資金は、主にリードカレッジからKLCへのスタートアップ資金、OLHへのヘレンスタッフォードリサーチフェローシップ資金、およびYKへのリードカレッジサイエンスリサーチフェローシップによって支えられました。このプロジェクトは、Wellcome Trust Studentship(2009-2014)の支援を受けたHRとのコラボレーションとして、Steve Wilsonの研究室で始まりました。このプロジェクトに関する最初の議論をしてくれたMáté Varga、Steve Wilson、およびWilson研究室の他のメンバーに感謝し、特にKLCにアガロースに胚をマウントし、ゼブラフィッシュの脳解剖を行う方法を最初に教えたFlorencia CavodeassiとKate Edwardsに感謝します。また、タングステン針研ぎ装置の組み立てに協力してくれたグレタ・グローバーとジェイ・ユーイングにも感謝します。

この論文の方法は、リードカレッジとユニバーシティカレッジロンドンの施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインと承認に従って実施されました。この研究で使用されたゼブラフィッシュ株の詳細については、 材料表 を参照してください。
1. 材料と工具を準備する
<ol><li>解決策を作る。<ol>
<li>60倍ストック(300 mM NaCl、10.2 mM KCl、20 mM CaCl ...

<ol>
	<li>Butler, A. B., Hodos, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+tectum.">Optic tectum.</a> Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , 311-340 (2005).</li><li>Cang, J., Feldheim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+mechanisms+of+topographic+map+formation+and+alignment.">Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment.</a> Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).</li><li>Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+circuits+of+visual+perception+and+cognition+through+the+superior+colliculus.">Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus.</a> Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).</li><li>Burrill, J. D., Easter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+retinofugal+projections+in+the+embryonic+and+larval+zebrafish+(Brachydanio+rerio).">Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio).</a> The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).</li><li>Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System Available from: <a target="_blank" href="https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/">https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/</a> (2021)</li><li>Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System Available from: <a target="_blank" href="https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/">https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/</a> (2021)</li><li>Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continued+growth+and+circuit+building+in+the+anamniote+visual+system.">Continued growth and circuit building in the anamniote visual system.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).</li><li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish.">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).</li><li>Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+has+a+specific+influence+on+optic+nerve+and+tectum+development+in+the+blind+cavefish+Astyanax.">The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax.</a> Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).</li><li>White, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+study+of+the+relationship+between+the+size+of+the+eye+and+the+size+of+the+optic+tectum+in+the+brain+of+the+developing+teleost,+Fundulus+heteroclitus.">An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus.</a> Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).</li><li>Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+growth+of+the+optic+tectum+in+goldfish.+II.+Modulation+of+cell+proliferation+by+retinal+fiber+input.">Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input.</a> The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).</li><li>Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+nerve+input-dependent+regulation+of+neural+stem+cell+proliferation+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish.">Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).</li><li>Hall, Z. J., Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+experience+facilitates+BDNF-dependent+adaptive+recruitment+of+new+neurons+in+the+postembryonic+optic+tectum.">Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marc's+modified+Ringer's+(MMR)+(10X,+pH+7.4).">Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4).</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li><li>Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+dissection+of+zebrafish+brain+development.">Anatomical dissection of zebrafish brain development.</a> Brain Development. 1082, 197-214 (2014).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>. ZFIN Tricaine recipe Available from: <a target="_blank" href="https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE">https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</a> (2018)</li><li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues.">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028 (2010).</li><li>. ZFIN protocols Available from: <a target="_blank" href="https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview">https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview</a> (2021)</li><li>Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trov&#242;, L., Paquet, D., Godinho, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+subcellular+structures+in+the+living+zebrafish+embryo.">Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456 (2016).</li><li>ImageJ with batteries included. Fiji Available from: <a target="_blank" href="https://figi.sc/">https://figi.sc/</a> (2021)</li><li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins.">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).</li><li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo.">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).</li><li>Karlstrom, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mutations+affecting+retinotectal+axon+pathfinding.">Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding.</a> Development. 123 (1), 427-438 (1996).</li><li>Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+nerve+regeneration+in+larval+zebrafish+exhibits+spontaneous+capacity+for+retinotopic+but+not+tectum+specific+axon+targeting.">Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting.</a> PLOS ONE. 14 (6), 0218667 (2019).</li><li>Robles, E., Filosa, A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+lamination+of+retinal+axons+generates+multiple+parallel+input+pathways+in+the+tectum.">Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum.</a> Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).</li><li>Vargas, M. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+Is+Wallerian+degeneration+in+the+CNS+so+slow.">Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).</li><li>Hughes, A. N., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+phagocytose+myelin+sheaths+to+modify+developmental+myelination.">Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination.</a> Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).</li><li>de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+physiological+analysis+in+a+zebrafish+model+of+epilepsy.">Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837 (2021).</li><li>Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+external+medium+composition+on+membrane+water+permeability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos.">The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos.</a> Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).</li><li>Fredj, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+activity-dependent+competition+regulates+axon+arbor+maturation,+growth+arrest,+and+territory+in+the+retinotectal+projection.">Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection.</a> Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).</li><li>Alberio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-gated+potassium+channel+for+sustained+neuronal+inhibition.">A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition.</a> Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).</li><li>Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+genesis+requires+lakritz,+a+zebrafish+atonal+homolog.">Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog.</a> Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).</li><li>Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+activity-deprived+zebrafish+mutant+macho+reveals+an+essential+requirement+of+neuronal+activity+for+the+development+of+a+fine-grained+visuotopic+map.">Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).</li><li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astyanax+surface+and+cave+fish+morphs.">Astyanax surface and cave fish morphs.</a> EvoDevo. 11 (1), 14 (2020).</li><li>Sieger, D., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+studying+microglia:+The+first,+the+popular,+and+the+new.">Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new.</a> Glia. 61 (1), 3-9 (2013).</li><li>Svahn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ramified+microglia+from+early+macrophages+in+the+zebrafish+optic+tectum.">Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum.</a> Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).</li><li>Herzog, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+clearance+of+cellular+debris+by+microglia+limits+secondary+neuronal+cell+death+after+brain+injury+in+vivo.">Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo.</a> Development. 146 (9), (2019).</li><li>Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-imaging+of+astrocyte+morphogenesis+and+function+in+zebrafish+neural+circuits.">Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).</li></ol>

この論文で説明する技術は、ゼブラフィッシュにおける脊椎動物の視覚系発達を研究するための多くのアプローチの1つを示しています。他の研究者は、胚性網膜を解剖し、遺伝子発現解析19 を実行する方法、または視蓋骨30におけるニューロン活性を視覚化する方法を発表した。この論文は、差動網膜入力が視蓋内の細胞挙動にどのように影響するかを探?...

この方法の目的は、網膜入力がゼブラフィッシュ脳の視覚処理センターである視蓋骨の成長と発達にどのように影響するかを調べることです。片目を取り除いた後、視蓋の両側を比較することで、同一試料内のテクタル変化を観察・正規化することができ、複数の検体間での比較が可能となります。この技術と組み合わせた現代の分子アプローチは、視覚系の成長と発達、ならびに軸索の変性と再生の根底にあるメカニズムへの洞察をもたらすでしょう。
視覚、聴覚、体性感覚などの感覚系は、外部器官から情報を収集し、その情報を中枢神経系に中継し、中脳全体の外界の「マップ」を生成します1,2。視覚は、多くの魚を含むほぼすべての脊椎動物にとって支配的な感覚様式です。眼の神経組織である網膜は、網膜の投影ニューロンである視受容体、双極性細胞、網膜神経節細胞(RGC)を主体とする神経回路で情報を収集します。RGCは長い軸索を持ち、網膜の内面を横切って視神経頭に向かい、そこで脳を魅了して一緒に移動し、最終的に背側中脳の視覚処理センターで終わる。この構造は、魚類や他の哺乳類以外の脊椎動物では視蓋骨と呼ばれ、哺乳類の優れた丘陵地帯と相同である3。
視蓋骨は、背側中脳における両側対称の多層構造である。ゼブラフィッシュおよび他のほとんどの魚類では、視蓋の各葉は対側眼からのみ視覚入力を受け取るため、左視神経は右眼房で終了し、右視神経は左眼球4で終了する(図1)。哺乳類の対応物である上甲骨と同様に、オプティックテクタムは視覚情報をオーディションや身体感覚などの他の感覚入力と統合し、視覚的注意の変化やサッケードなどの眼球運動を制御します1,5,6。しかし、哺乳類の上斜膜とは異なり、視蓋骨は、テクタル増殖ゾーン7と呼ばれるテクタルローブの内側および尾縁付近の特殊な幹細胞ニッチから新しいニューロンおよびグリアを連続的に生成する。視蓋および中枢神経系の他の領域における増殖性前駆細胞の維持は、部分的には、ゼブラフィッシュ8に文書化された顕著な再生能力に寄与する。
盲目または片目の魚の脳を調べた以前の研究は、視蓋の大きさがそれが受ける網膜神経支配の量に正比例することが明らかになった 9,10,11.初期胚発生で目が退化する成体の洞窟魚類では、オプティックテクタムは、近縁の、目の見える表面魚9のそれよりも著しく小さい。洞窟魚眼の変性は、胚発生時に内因性レンズを表面魚由来のレンズと交換することによって阻止することができる。これらの片目の洞窟魚が成体期まで飼育されると、神経支配されたテクタルローブは、非神経化されたテクタルローブ9よりも約10%多くの細胞を含む。同様に、同じ個体内で異なるサイズの目を生成するために化学的処置を用いて孵化した幼虫キリフィッシュにおいて、より神経支配されたテクタムの側面はより大きく、より多くのニューロン10を含んでいた。成体金魚における視神経圧潰実験からの証拠は、神経支配が増殖を促進し、神経支配が破壊されるとテクタル細胞増殖が減少することを示している11。
これらの古典的な研究を確認し、拡張して、いくつかの最近の報告は、神経支配に応答した増殖が、少なくとも部分的には、BDNF-TrkB経路12、13によって調節されることを示唆するデータを提供する。発達中の感覚系が損傷および軸索変性にどのように対処するか、どの細胞および分子シグナルが網膜入力が視蓋成長を調節することを可能にするか、これらのメカニズムがいつアクティブになるか、神経支配に関連した増殖および分化が網膜およびその標的組織が成長速度を調整し、正確な網膜トピックマッピングを確実にすることを可能にするかどうかなど、眼テクタムの成長および発達に関する多くの未解決の疑問が残っている。さらに、活動依存性の発達については、以下に説明するような外科的アプローチでゼブラフィッシュ視覚系を尋問することによって対処できるはるかに大きな質問がある。
神経活動、特に視覚入力からの神経活動が細胞の生存と増殖を変化させる細胞および分子のメカニズムを調べるために、記載されたアプローチは、個々のゼブラフィッシュ幼虫内の神経支配および脱神経化されたテクタルローブ(図1)を直接比較する。この方法は、視蓋におけるRGC軸索変性の文書化および有糸分裂細胞の数が神経支配と相関することを確認することを可能にする。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63509/63509fig01.jpg"> 図1:片側眼除去前後のゼブラフィッシュ幼虫のスケッチ 。 (A)解剖顕微鏡下で見た5 dpf幼虫の図面。各幼虫は、低融点アガロースに埋め込まれ、鋭い引っ掛けられた先端を有するタングステン針が上を向いて眼をすくい取るために使用される前に横方向に向けられる(この例では左目)。(B) Aに描かれた手術から生じた9dpf幼虫の背部図の図面。右目から高度に図式化された3つのRGC軸索のみが、左蓋葉のニューロンと脱魅惑的で連結していることが示されている。略語: dpf = 受精後日数;dps = 手術後の日数;RGC = 網膜神経節細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63509/63509fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment and supplies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breeding boxes</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high vacuum grease</td>
			<td>Sigma or equivalent supplier</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks (125 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>DWK Lifescience</td>
			<td>63A53 &#38; 63A53WT</td>
			<td>For pipetting embryos and larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides for microscopy</td>
			<td>VWR or equivalent supplier</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware including graduated bottles and graduated cylinders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making and storing solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-part epoxy resin</td>
			<td>ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent</td>
			<td>0.85 oz syringe</td>
			<td>https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.7 mL)</td>
			<td>VWR or equivalent supplier</td>
			<td>22234-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel plated pin holder (17 cm length)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>26018-17</td>
			<td>To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh tea strainer or equivalent</td>
			<td>Ali Express or equivalent</td>
			<td></td>
			<td>For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper clip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>Fischer Scientific or equivalent supplier</td>
			<td>50-190-0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mm</td>
			<td>Fischer Scientific or equivalent supplier</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette pump</td>
			<td>SP Bel-Art or equivalent</td>
			<td>F37898-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>909122</td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (variable voltage)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire (0.125 mm diameter)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>TGW0515</td>
			<td>Sharpen to remove eye and dissect larvae.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable temperature heat block</td>
			<td>The Lab Depot or equivalent supplier</td>
			<td>BSH1001 or BSH1002</td>
			<td>Set to 40-42 &#176;C ahead of experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wires with alligator clip leads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. 
			Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for surgeries and dissections:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Make 1% in embryo medium (E3) or Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374248</td>
			<td>For embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19210</td>
			<td>Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td>Dilute 1:100 in Marc&#39;s Modified Ringers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) tablets</td>
			<td>Diagnostic BioSystems</td>
			<td>DMR E404-01</td>
			<td>Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>100G #TRS1</td>
			<td>Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for immunohistochemistry:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI or ToPro3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1306 or T3605</td>
			<td>Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>A component of immunoblock buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td>Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50-062Z</td>
			<td>A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody to detect phosphohistone H3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td>Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)</td>
			<td>MBL International</td>
			<td>PM005</td>
			<td>Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (PK)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308-10MG</td>
			<td>Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 &#181;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Fiji)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop or GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available from the&#160; Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

eye removal in living zebrafish larvae to examine innervation-dependent growth and development of the visual system

ゼブラフィッシュは生涯にわたる顕著な成長と再生能力を示します。例えば、胚発生中に確立された特殊な幹細胞ニッチは、眼および脳の両方において、視覚系全体の継続的な成長をサポートする。網膜と視蓋の間の協調的な成長は、新しいニューロンが目と脳に追加されるにつれて、正確な網膜トピックマッピングを保証します。網膜軸索が、生存、増殖、および/または分化などの眼底幹および前駆細胞の挙動を調節するための重要な情報を提供するかどうかに対処するには、同じ動物内および動物間で神経支配および脱神経化されたテクタルローブを比較できることが必要である。 
生きている幼虫ゼブラフィッシュから片目を外科的に除去し、続いて視蓋骨を観察することで、この目標を達成します。付属のビデオは、幼虫を麻酔し、タングステン針を電気的に鋭くし、それらを使用して片目を除去する方法を示しています。次に、固定されたゼブラフィッシュ幼虫から脳を解剖する方法を示します。最後に、このビデオでは、免疫組織化学のプロトコルの概要と、顕微鏡検査のために染色された胚を低融点アガロースにマウントする方法のデモンストレーションを提供します。

眼球除去が完了したかどうかを確認し、視蓋がどのように変化するかを評価するために、すべてのRGCを膜標的RFPでラベル付けし、したがって網膜から突出して視神経を形成するすべての軸索24を有するTg[atoh7:RFP]株で手術を行った。この菌株を使用することは絶対に必要ではありませんが、視蓋神経ニューロピルにおける視神経末端の簡単な観察と可視化を可能にしま?...

Watch this Scientific Journal Video about Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System at JoVE.com

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

この記事では、網膜入力が視蓋の成長と発達にどのように影響するかを調査するための第一歩として、生きているゼブラフィッシュの幼虫から外科的に目を取り除く方法について説明します。さらに、この記事では、幼虫の麻酔、固定、および脳解剖に関する情報を提供し、続いて免疫組織化学および共焦点イメージングを行う。

生きているゼブラフィッシュ幼虫の眼球除去による神経支配依存性の成長と視覚系の発達を調べる

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

私の研究室では、目と脳がどのように一緒に成長するかを理解することに興味があります。この技術により、網膜入力が脳の成長と発達にどのように影響するかを研究することができます。生きている幼虫のゼブラフィッシュから片目を外科的に除去し、続いて視蓋骨を観察することで、同じ動物内および動物間で神経支配された蓋葉と脱神経化された蓋葉を比較することができます。この技術を現代の分子アプローチと組み合わせることで、神経の発達、再生、変性の根底にあるメカニズムに関する新しい洞察を得ることができます。まず、カソード線とアノード線を電源に接続します。陰極線の端にあるワニ歯クリップを部分的にまっすぐにしたクリップに取り付け、ペーパークリップを水酸化カリウム溶液に挿入して瓶の側面に取り付けます。陽極ワイヤーのアリゲータークリップをニードルホルダーの首に取り付けます。電源を約20ボルトに回し、タングステン線を水酸化カリウム溶液に浸し、ワイヤを溶液から斜めに引き出して、ワイヤを電気的に鋭くして微細な先端にします。解剖顕微鏡の下で針の先端をチェックして、十分に鋭いことを確認します。曲線の針先は、鋭利な針をペトリ皿にそっと触れて曲げたときに生じます。手術当日、広口径ガラス牧草地ピペットを使用して、10〜15匹の幼虫を新鮮なE3で満たされた35ミリメートルのペトリ皿に移します。幼虫に麻酔薬を3〜5滴加える。幼虫が適切に麻酔されているかどうかを判断するには、タッチ応答の欠如を探します。幼虫が3分後にまだ接触に反応し、再評価する場合は、麻酔薬をさらに2〜3滴加える。手術のために幼虫を固定化するには、少量のE3だけで1匹の幼虫を狭穴ガラス牧草地ピペットに入れます。次に、約200マイクロリットルの溶融した1%低融点またはLMPアガロースを幼虫を含むピペットに取り込み、幼虫がLMPアガロースに懸濁していることを確認するために混合する。解剖顕微鏡の下で35ミリメートルのペトリ皿の蓋を上向きに置き、幼虫とアガロースを逆さまのペトリ皿の蓋の上に噴き出します。幼虫が滴の中心になるようにアガロースを広げる。鈍いタングステン針を使用して、片目が上を向いて横になるように幼虫を素早く、しかし静かに操縦する。アガロースがセットされるまで数分待ちます。眼窩の端に続いて、細い電解的に研いだタングステン針の先端を使用して、目の周りの皮膚を突き刺します。次に、眼の側頭腹側から眼の下の針の縁をスライドさせる。制御された圧力を使用して、ソケットから目を離します。針の側面で眼を背側および前方に押し続け、最終的に視神経を切り裂いて眼を解放する。あるいは、非常に細かい外科用鉗子を使用して、視神経をつまみ、目を内側から側方に押し込むことによって、目を取り除くこともできます。脱眼が成功したら、MMR溶液でアガロースを覆い、鉗子でペトリ皿のふたを安定させながら、タングステン針を頭の周りに、次に体の周りに優しくブラッシングすることによって、各幼虫をアガロースから解放する。手術後、翌日まで抗生物質を添加したMMR溶液に幼虫を入れ、その後、幼虫をE3に戻し、実験の終点までそれらを飼育する。幼虫を末期麻酔した後、4%パラホルムアルデヒドで固定する。解剖顕微鏡下でシールガードプレート上のPBS液滴中に固定幼虫を懸濁させる。AGM領域を覆う色素沈着領域の後方に1本のピンを配置し、もう1本のピンを卵黄伸長の端に沿って、脊索を通して2本のタングステンピンを配置して、それらを横方向に固定する。鋭いタングステン針と細かい鉗子で目を取り除きます。時には、顎を通って反対側に針を突いて、もう一方の目を取り除くことが可能です。タングステン針を使用して、耳の側頭から腹側に傷をつけます。動いているのと同じ動作で、針を顎に後部持ってきて、耳と顎が取り除かれるまで静かに前方に引っ張ります。もう片方の目と耳は、針を顎に突き刺して取り除きます。鉗子を使用して腹側器官と残りの卵黄を引き出します。最後に、後脳と脊髄の接合部付近の背側頭蓋皮膚に浅い切開を行う。鉗子で皮膚を持ち上げ、それを前方および間脳の周りに引っ張る。鉗子で残りの組織を取り除きます。幼虫のピンを外し、PBSを1.5ミリリットルの微量遠心管に移す。真空グリースを入れた100ミリメートルのペトリ皿の蓋にチャンバー付きスライドを固定します。免疫染色および処理された幼虫をウェルプレートまたは窪みスライドに移し、解剖顕微鏡でそれらを見る。幼虫を1%LMPアガロースカラムのチャンバー付きスライドに取り付けます。ピペットの向こうのガラスを使用して、チャンバー付きスライドに1匹の幼虫を置き、PBSをできるだけ少なくします。同じピペットを使用して、溶けて温かい1%LMPアガロースで幼虫を覆います。LMPアガロースをカラムにピペットで刺し、背側表面が見えるようにできるだけ対称的に幼虫を配置します。眼球除去後、網膜軸索の進行性変性が視蓋ニューロピルにおいて観察された。術後2日までに、RFP標識軸索は、ブラビングおよび断片化などの急速なウォラー変性の特徴を示した。RFP陽性穿刺は、矢印で示すように、テクタムの右側のニューロピルの内側と外側の両方で認められた。術後4日までに、断片化された軸索およびRFP標識された軸索破片が右胸骨でかなり減少し、死にかけている軸索および退化する軸索の比較的迅速なクリアランスが示された。脳は、皮膚および結合組織の目、顎、耳、および頭蓋骨を解剖することによって露出した。理想的には、この手順の間、脳は無傷のままである。しかし、前脳の一部、特に嗅球は、皮膚または顎の頭蓋骨キャップを取り外したときに損傷を受けたか、完全に除去された可能性が高い。さらに、皮膚を突き刺したりつまんだりして脳から引き離すと、テクタムの横の棚がスライスされることがあります。同一のサンプルは 2 つとありません。したがって、必要に応じて、目の除去と脳の解剖を通じて微妙な適応を行うことができる必要があります。患者と鋭いツールは成功に不可欠です。この技術は、in vivo生細胞イメージングやRNAシーケンシングなどの細胞および分子アプローチでフォローアップし、光学テクタムの成長および発達の分子および細胞メカニズムに関する新しい洞察を得ることができます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

リンパ腺や血球中を調べるための方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

生きた蛙およびゼブラフィッシュの胚における低酸素の誘導

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...