Name: eye removal in living zebrafish larvae to examine innervation-dependent growth and development of the visual system
Uploaded: 2022-02-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System at JoVE.com

이 작업에 대한 기금은 주로 Reed College에서 KLC에 이르는 창업 기금, Helen Stafford Research Fellowship 기금에서 OLH로, Reed College Science Research Fellowship에서 YK에 지원되었습니다. 이 프로젝트는 Steve Wilson의 실험실에서 Wellcome Trust Studentship (2009-2014)의 지원을 받은 HR과의 협력으로 시작되었습니다. 이 프로젝트에 대한 초기 토론을 위해 Máté Varga, Steve Wilson 및 Wilson 연구소의 다른 구성원들에게 감사 드리며, 특히 KLC에 아가로스에 배아를 장착하고 제브라 피쉬 뇌 해부를 수행하는 방법을 처음으로 가르친 Florencia Cavodeassi와 Kate Edwards에게 감사드립니다. 우리는 또한 Greta Glover와 Jay Ewing에게 텅스텐 바늘 연마 장치를 조립하는 데 도움을 주신 것에 감사드립니다.

이 논문의 방법은 Reed College 및 University College London의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침과 승인에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 제브라피쉬 균주에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 재료 및 도구 준비
<ol><li>솔루션을 만드세요.<ol>
<li>60x 스톡(300 mM NaCl, 10.2 mM KCl, 20 mM CaCl2-이수화물, 및 20 mMMgCl2-육수화물)을 탈이온?...

<ol>
	<li>Butler, A. B., Hodos, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+tectum.">Optic tectum.</a> Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , 311-340 (2005).</li><li>Cang, J., Feldheim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+mechanisms+of+topographic+map+formation+and+alignment.">Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment.</a> Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).</li><li>Basso, M. A., Bickford, M. 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Fiji Available from: <a target="_blank" href="https://figi.sc/">https://figi.sc/</a> (2021)</li><li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins.">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).</li><li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo.">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).</li><li>Karlstrom, R. 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이 논문에 설명 된 기술은 제브라 피쉬에서 척추 동물 시각 시스템 개발을 연구하기위한 많은 접근법 중 하나를 보여줍니다. 다른 연구자들은 배아 망막을 해부하고 유전자 발현 분석19 를 수행하거나 광학 텍텀30에서 신경 활동을 시각화하는 방법을 발표했습니다. 이 논문은 차등 망막 입력이 광학 텍텀의 세포 행동에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 탐구하기위...

이 방법의 목표는 망막 입력이 제브라 피쉬 뇌의 시각 처리 센터 인 광학 텍텀의 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 조사하는 것입니다. 한쪽 눈을 제거한 다음 광학 텍텀의 양면을 비교함으로써 동일한 시편 내의 텍탈 변화를 관찰하고 표준화하여 여러 표본에서 비교할 수 있습니다. 이 기술과 결합 된 현대 분자 접근법은 시각적 시스템 성장 및 개발뿐만 아니라 축삭 변성 및 재생의 기초가되는 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 것입니다.
시각, 청각 및 신체 감각 - 감각 시스템은 외부 기관으로부터 정보를 수집하고 그 정보를 중추 신경계로 전달하여 중뇌 1,2에 걸쳐 외부 세계의 "지도"를 생성합니다. 시력은 많은 물고기를 포함한 거의 모든 척추 동물에게 지배적 인 감각 양식입니다. 눈의 신경 조직인 망막은 주로 광수용체, 양극성 세포, 망막의 돌출부 뉴런인 망막 신경절 세포(RGCs)로 구성된 뉴런 회로로 정보를 수집합니다. RGC는 망막의 내부 표면을 가로 질러 시신경 머리로가는 길을 찾는 긴 축삭을 가지고 있으며, 뇌를 통해 매혹되고 함께 여행하며 궁극적으로 등쪽 중뇌의 시각 처리 센터에서 끝납니다. 이 구조는 물고기 및 다른 비 포유류 척추 동물에서 광학 텍텀이라고하며 포유류3에서 우수한 콜리큘러스와 상동성입니다.
광학 텍텀은 등쪽 중뇌의 양측 대칭 다층 구조입니다. 제브라피쉬와 대부분의 다른 물고기에서, 시신경의 각 엽은 대측 눈으로부터 시각 입력만을 수신하여 좌측 시신경이 우측 지골로브에서 종결되고 우측 시신경이 좌측 지골엽(4)에서 종결된다(그림 1). 포유류와 마찬가지로 우수한 콜리큘러스인 광학 텍텀은 오디션과 소마토센세이션을 포함한 다른 감각 입력과 시각 정보를 통합하여 사케이드 1,5,6과 같은 시각적 관심과 안구 움직임의 변화를 제어합니다. 그러나, 포유류의 우수한 콜리큘러스와는 달리, 광학 텍텀은 텍탈 증식 구역7이라고 불리는 텍탈 로브의 내측 및 꼬리 가장자리 근처의 특수 줄기 세포 틈새 시장에서 지속적으로 새로운 뉴런과 글리아교를 생성합니다. 시신경 텍텀 및 중추 신경계의 다른 영역에서 증식성 전구 인자의 유지는 부분적으로 제브라피쉬8에 문서화 된 놀라운 재생 능력에 기여합니다.
맹인 또는 한쪽 눈의 물고기의 두뇌를 조사한 이전 연구에 따르면 광학 텍텀 크기는9,10,11을받는 망막 신경의 양에 직접적으로 비례한다는 것이 밝혀졌습니다. 초기 배아 발생시 눈이 퇴화하는 성인 동굴 물고기에서 광학 텍텀은 밀접하게 관련된, 관찰 된 표면 물고기의 그것보다 눈에 띄게 작습니다9. 동굴 물고기 눈 변성은 배아 발생 동안 내인성 렌즈를 표면 물고기의 렌즈로 대체함으로써 차단 될 수 있습니다. 이 한쪽 눈의 동굴 물고기가 성인기까지 자랄 때, 신경 과민 지체 엽은 비 신경 수축 엽9보다 약 10 % 더 많은 세포를 포함합니다. 마찬가지로, 동일한 개체 내에서 다른 크기의 눈을 생성하기 위해 화학 처리와 함께 배양 된 애벌레 킬리 피쉬에서, 더 많은 신경을 가진 텍텀의 측면은 더 크고 더 많은 뉴런(10)을 포함했다. 성인 금붕어에서 시신경 분쇄 실험의 증거는 신경이 증식을 촉진한다는 것을 나타내며, 신경이 파괴되었을 때 지각 세포 증식이 감소합니다11.
이러한 고전적 연구를 확인하고 확장하면서, 최근의 몇몇 보고서는 신경과민에 대한 반응의 증식이 BDNF-TrkB 경로12,13에 의해 적어도 부분적으로 조절된다는 것을 암시하는 데이터를 제공한다. 발달하는 감각 시스템이 손상과 축삭 변성에 어떻게 대처하는지, 세포 및 분자 신호가 망막 입력을 가능하게 하여 광학 텍텀 성장을 조절할 수 있는지, 이러한 메커니즘이 활성화될 때, 신경 연결된 증식 및 분화가 망막과 표적 조직이 성장 속도를 조정하고 정확한 망막 토픽 매핑을 보장할 수 있는지 여부 등 광학 텍텀의 성장과 발달에 관한 많은 열린 질문이 남아 있습니다. 또한, 아래에 설명 된 것과 같은 외과 적 접근법으로 제브라 피쉬 시각 시스템을 심문함으로써 해결할 수있는 활동 의존적 발달에 관한 훨씬 더 큰 질문이 있습니다.
신경 활동, 특히 시각적 입력으로부터 세포 생존 및 증식을 변화시키는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하기 위해 설명 된 접근법은 개별 제브라 피쉬 유충 내의 신경 및 탈질 된 텍탈 엽 (그림 1)을 직접 비교합니다. 이 방법은 광학 구조체에서 RGC 축삭 변성에 대한 문서화와 유사분열 세포의 수가 신경과민과 상관관계가 있음을 확인할 수 있게 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63509/63509fig01.jpg"> 그림 1 : 일방적 인 눈 제거 전후의 제브라 피쉬 유충의 스케치. (A) 해부 현미경으로 볼 때 5 dpf 유충의 그림. 각 유충은 저융점 아가로스에 내장되어 있으며 날카로운 후크 팁이있는 텅스텐 바늘 앞에 옆으로 향하게되어 눈을 위로 향하게합니다 (이 예에서는 왼쪽 눈). (B) A에 묘사 된 수술로 인한 9 dpf 유충의 등쪽 뷰의 그림. 오른쪽 눈에서 고도로 개략화 된 RGC 축삭 돌기는 왼쪽 지체 엽의 뉴런과 수축하고 연결하는 것으로 나타났습니다. 약어 : dpf = 수정 후 일; dps = 수술 후 일수; RGC = 망막 신경절 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63509/63509fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment and supplies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breeding boxes</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high vacuum grease</td>
			<td>Sigma or equivalent supplier</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks (125 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>DWK Lifescience</td>
			<td>63A53 &#38; 63A53WT</td>
			<td>For pipetting embryos and larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides for microscopy</td>
			<td>VWR or equivalent supplier</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware including graduated bottles and graduated cylinders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making and storing solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-part epoxy resin</td>
			<td>ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent</td>
			<td>0.85 oz syringe</td>
			<td>https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.7 mL)</td>
			<td>VWR or equivalent supplier</td>
			<td>22234-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel plated pin holder (17 cm length)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>26018-17</td>
			<td>To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh tea strainer or equivalent</td>
			<td>Ali Express or equivalent</td>
			<td></td>
			<td>For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper clip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>Fischer Scientific or equivalent supplier</td>
			<td>50-190-0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mm</td>
			<td>Fischer Scientific or equivalent supplier</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette pump</td>
			<td>SP Bel-Art or equivalent</td>
			<td>F37898-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>909122</td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (variable voltage)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire (0.125 mm diameter)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>TGW0515</td>
			<td>Sharpen to remove eye and dissect larvae.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable temperature heat block</td>
			<td>The Lab Depot or equivalent supplier</td>
			<td>BSH1001 or BSH1002</td>
			<td>Set to 40-42 &#176;C ahead of experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wires with alligator clip leads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. 
			Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for surgeries and dissections:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Make 1% in embryo medium (E3) or Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374248</td>
			<td>For embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19210</td>
			<td>Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td>Dilute 1:100 in Marc&#39;s Modified Ringers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) tablets</td>
			<td>Diagnostic BioSystems</td>
			<td>DMR E404-01</td>
			<td>Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>100G #TRS1</td>
			<td>Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for immunohistochemistry:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI or ToPro3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1306 or T3605</td>
			<td>Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>A component of immunoblock buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td>Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50-062Z</td>
			<td>A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody to detect phosphohistone H3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td>Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)</td>
			<td>MBL International</td>
			<td>PM005</td>
			<td>Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (PK)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308-10MG</td>
			<td>Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 &#181;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Fiji)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop or GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available from the&#160; Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

eye removal in living zebrafish larvae to examine innervation-dependent growth and development of the visual system

제브라피쉬는 놀라운 평생 성장과 재생 능력을 발휘합니다. 예를 들어, 배아 발생 중에 확립 된 특수 줄기 세포 틈새 시장은 눈과 뇌 모두에서 전체 시각 시스템의 지속적인 성장을 지원합니다. 망막과 광학 텍텀 사이의 조정 된 성장은 눈과 뇌에 새로운 뉴런이 추가됨에 따라 정확한 망막 토픽 매핑을 보장합니다. 망막 축삭이 생존, 증식 및/또는 분화와 같은 지각 줄기 및 전구 세포 행동을 조절하는 데 중요한 정보를 제공하는지 여부를 해결하기 위해서는 동일한 동물 내의 신경질과 탈핵된 지체 엽을 비교할 수 있어야 합니다. 
살아있는 애벌레 제브라 피쉬에서 한쪽 눈을 외과 적으로 제거한 다음 광학 텍텀을 관찰하면이 목표를 달성합니다. 첨부 된 비디오는 애벌레를 마취하고, 전해로 텅스텐 바늘을 날카롭게하고, 한쪽 눈을 제거하는 데 사용하는 방법을 보여줍니다. 다음으로 고정 된 제브라 피쉬 애벌레에서 뇌를 해부하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 비디오는 면역 조직 화학을위한 프로토콜에 대한 개요와 현미경 검사를 위해 저융점 아가로스에 염색 된 배아를 장착하는 방법에 대한 데모를 제공합니다.

눈 제거가 완료되었는지 여부를 확인하고 시신경 텍텀이 어떻게 변하는지를 평가하기 위해, 모든 RGC를 막 표적 RFP로 라벨링하는 Tg[atoh7:RFP] 균주에서 수술을 수행했으며, 따라서 망막으로부터 투사되어 시신경을 형성하는 모든 축삭기(24)를 형성한다. 이 균주를 사용하는 것이 절대적으로 필요한 것은 아니지만, 시신경 텍텀 뉴로필에서 시신경 테르미니를 직접 관찰하고 ?...

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Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

이 기사는 망막 입력이 광학 텍텀의 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기위한 첫 번째 단계로 살아있는 제브라 피쉬 유충에서 눈을 외과 적으로 제거하는 방법을 설명합니다. 또한이 기사는 애벌레 마취, 고정 및 뇌 해부에 대한 정보를 제공하고 면역 조직 화학 및 공초점 이미징을 제공합니다.

살아있는 제브라 피쉬 유충의 눈 제거는 시각 시스템의 신경 의존적 인 성장과 발달을 조사합니다.

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

그래서 제 연구실은 눈과 뇌가 어떻게 함께 성장하는지 이해하는 데 관심이 있습니다. 이 기술을 통해 망막 입력이 뇌 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 연구 할 수 있습니다. 살아있는 애벌레 제브라 피쉬에서 한쪽 눈을 외과 적으로 제거한 다음 광학 텍텀을 관찰하면 동일한 동물과 동물 전체에서 신경질과 탈질 된 지체 엽을 비교할 수 있습니다.이 기술을 현대 분자 접근법과 결합하면 신경 발달, 재생 및 퇴행의 기초가되는 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다. 시작하려면 음극과 양극 전선을 전원 공급 장치에 연결하십시오. 음극선 끝의 악어 클립을 부분적으로 곧게 펴는 종이 클립에 부착하고 종이 클립을 수산화 칼륨 용액에 삽입하여 항아리 측면에 부착하십시오.양극 와이어의 악어 클립을 바늘 홀더의 목에 부착하십시오. 전원을 약 20V로 돌리고 텅스텐 와이어를 수산화 칼륨 용액에 담그고 와이어를 용액에서 비스듬히 당겨 와이어를 미세한 팁으로 전해로 날카롭게하십시오. 해부 현미경으로 바늘 끝을 확인하여 충분히 날카로운지 확인하십시오.곡선 바늘 팁은 날카로운 바늘이 페트리 접시에 부드럽게 닿아 구부러질 때 발생합니다. 수술 당일에는 넓은 보어 유리 목초지 피펫을 사용하여 10 ~ 15 마리의 유충을 신선한 E3로 채워진 35 밀리미터 페트리 접시로 옮깁니다. 애벌레에 마취제 세 다섯 방울을 넣으십시오. 유충이 적절하게 마취되었는지 확인하려면 접촉 반응이 부족한지 확인하십시오.유충이 세 분 후에도 여전히 만지기에 반응하고 재평가되는 경우 마취제를 두 세 방울 더 넣으십시오. 수술을 위해 유충을 고정시키려면 유충 한 마리를 소량의 E3만으로 좁은 보어 유리 목초지 피펫으로 가져 가십시오. 다음으로, 약 200 마이크로리터의 용융된 1%저융점 또는 LMP 아가로스 유충을 함유하는 피펫에 넣고 혼합하여 유충이 LMP 아가로스 내에 현탁되도록 한다. 해부 현미경 아래에 35 밀리미터 페트리 접시의 뚜껑을 올려 놓은 다음 유충과 아가로스를 거꾸로 된 페트리 접시 뚜껑에 쏟아 붓습니다.애벌레가 방울의 중심에 있도록 아가로스를 퍼뜨립니다. 둔한 텅스텐 바늘을 사용하여 유충을 빠르고 부드럽게 조종하여 한쪽 눈이 위쪽을 향하게하여 측면이되도록하십시오. 아가로스가 설정될 때까지 몇 분 정도 기다립니다.눈 궤도의 가장자리를 따라 미세하게 전해로 날카롭게 된 텅스텐 바늘의 끝을 사용하여 눈 주위의 피부를 관통하십시오. 그런 다음 눈의 측두엽 - 복부 쪽에서 눈 밑의 바늘 가장자리를 밀어 넣습니다. 제어된 압력을 사용하여 소켓에서 눈을 떼어냅니다.바늘 옆으로 눈을 등쪽과 앞쪽으로 계속 누르고 결국 시신경을 통해 슬라이스하고 눈을 풀어줍니다. 또는 매우 미세한 수술 포셉을 사용하여 시신경을 꼬집고 눈을 내측에서 옆으로 밀어 눈을 제거 할 수 있습니다. 성공적인 눈 제거 후, MMR 용액으로 아가로스를 덮고, 텅스텐 바늘을 머리 주위와 몸 주위를 부드럽게 닦아서 각 유충을 해방시키고 포셉으로 페트리 접시 뚜껑을 안정화시킵니다.수술 후 다음 날까지 항생제가 보충 된 MMR 용액에 유충을 넣은 다음 유충을 E3로 돌려 보내고 실험이 끝날 때까지 되돌립니다. 유충이 말기 마취 된 후 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하십시오. 해부 현미경으로 밀봉 가드 플레이트 상의 PBS 액적에 고정된 유충을 현탁시킨다.노토코드를 통해 두 개의 텅스텐 핀을 AGM 영역을 덮고 다른 핀을 AGM 영역을 덮는 착색 된 영역에 후방으로 배치하고 다른 핀을 노른자 연장의 끝과 일치시켜 측면으로 고정하십시오. 날카로운 텅스텐 바늘과 미세한 포셉으로 눈을 제거하십시오. 때로는 바늘을 턱을 통해 반대쪽으로 찌르고 다른 쪽 눈을 제거 할 수 있습니다.텅스텐 바늘을 사용하여 귀의 측두엽에서 복부 쪽으로 긁으십시오. 움직이는 것과 같은 동작으로 바늘 후방을 턱으로 가져 와서 귀와 턱이 제거 될 때까지 부드럽게 앞쪽으로 당깁니다. 턱을 통해 바늘을 찌르고 다른 눈과 귀를 제거하십시오.포셉을 사용하여 복부 장기와 남아있는 노른자를 꺼냅니다. 마지막으로, 뒷 뇌와 척수 사이의 교차점 근처의 등쪽 두개골 피부에 얕은 절개를하십시오. 포셉으로 피부를 들어 올리고 전방과 텔렌스팔론 주위를 당깁니다.포셉으로 남아있는 조직을 제거하십시오. 유충을 핀을 풀고 PBS로 옮겨 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 챔버 슬라이드를 진공 그리스로 100mm 페트리 접시의 뚜껑에 고정시킵니다.면역 염색되고 가공 된 유충을 우물 플레이트 또는 우울증 슬라이드로 옮겨 해부 현미경으로 봅니다. 유충을 1 % LMP 아가 로즈 컬럼의 챔버 슬라이드에 장착하십시오. 피펫을 지나 유리를 사용하여 챔버 슬라이드에 유충 한 마리를 올려 놓고 가능한 한 적은 PBS를 증착하십시오.동일한 피펫을 사용하여 녹이고 따뜻한 1 % LMP 아가로오스로 유충을 덮으십시오. LMP 아가로스를 컬럼에 피펫 한 다음 유충을 등쪽 표면이 보이는 가능한 한 대칭으로 배치합니다. 눈 제거 후, 망막 축색돌기의 진행성 변성이 광학 텍텀 뉴로필에서 관찰되었다.수술 후 이틀 후, RFP 라벨이 붙은 축삭은 블래빙과 분열과 같은 빠른 Wallerian 변성의 특징을 나타 냈습니다. RFP 양성 누자는 화살표로 표시된 바와 같이 텍텀의 오른쪽에있는 뉴로필 내외에서 모두 기록되었습니다. 수술 후 나흘 후, 우측 지각 엽에서 파편화된 축삭돌기와 RFP 라벨이 붙은 축삭 파편이 상당히 감소하여 죽어가는 축삭돌기의 비교적 빠른 제거를 나타냅니다.뇌는 피부와 결합 조직의 눈, 턱, 귀 및 두개골 뚜껑을 해부하여 노출되었습니다. 이상적으로, 뇌는이 과정에서 손상되지 않은 상태로 남아 있습니다. 그러나 앞뇌의 일부, 특히 후각 전구는 피부 또는 턱의 두개골 뚜껑이 제거되었을 때 손상되거나 완전히 제거되었을 가능성이 큽니다.또한, 때로는 텍텀의 측면 선반이 피부를 관통하거나 꼬집어 뇌에서 떼어 낼 때 슬라이스됩니다. 두 샘플이 동일하지 않습니다. 따라서 필요에 따라 눈 제거와 뇌 해부를 통해 미묘한 적응을 할 수 있어야합니다.환자와 날카로운 도구는 성공을 위해 필수적입니다. 이 기술은 생체 내 살아있는 세포 이미징 또는 RNA 시퀀싱과 같은 세포 및 분자 접근법을 따라 광학 텍텀 성장 및 개발의 분자 및 세포 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

살아있는 개구리와 Zebrafish 태아의 저산소증 유도

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...