Name: eye removal in living zebrafish larvae to examine innervation-dependent growth and development of the visual system
Uploaded: 2022-02-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System at JoVE.com

O financiamento para este trabalho foi apoiado principalmente por fundos inativos da Reed College para a KLC, fundos da Helen Stafford Research Fellowship para a OLH, e uma Reed College Science Research Fellowship para yk. Este projeto começou no laboratório de Steve Wilson como uma colaboração com a HR, que foi apoiada por uma Wellcome Trust Studentship (2009-2014). Agradecemos a Máté Varga, Steve Wilson e outros membros do laboratório Wilson pelas discussões iniciais sobre este projeto, e agradecemos especialmente a Florencia Cavodeassi e Kate Edwards, que foram as primeiras a ensinar a KLC como montar embriões em agarose e realizar dissecções cerebrais de zebrafish. Agradecemos também a Greta Glover e Jay Ewing pela ajuda na montagem do nosso dispositivo de afiação de agulha de tungstênio.

Os métodos deste artigo foram conduzidos de acordo com as diretrizes e aprovação dos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Reed College e university College London. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre as cepas de zebrafish utilizadas neste estudo.
1. Prepare materiais e ferramentas
<ol><li>Faça soluções.<ol>
<li>Faça o embrião médio (E314) diluindo um estoque de 60x (300 mM NaCl, 10,2 mM...

<ol>
	<li>Butler, A. B., Hodos, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+tectum.">Optic tectum.</a> Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , 311-340 (2005).</li><li>Cang, J., Feldheim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+mechanisms+of+topographic+map+formation+and+alignment.">Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment.</a> Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).</li><li>Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+circuits+of+visual+perception+and+cognition+through+the+superior+colliculus.">Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus.</a> Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).</li><li>Burrill, J. D., Easter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+retinofugal+projections+in+the+embryonic+and+larval+zebrafish+(Brachydanio+rerio).">Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio).</a> The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).</li><li>Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System Available from: <a target="_blank" href="https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/">https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/</a> (2021)</li><li>Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System Available from: <a target="_blank" href="https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/">https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/</a> (2021)</li><li>Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continued+growth+and+circuit+building+in+the+anamniote+visual+system.">Continued growth and circuit building in the anamniote visual system.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).</li><li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish.">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).</li><li>Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+has+a+specific+influence+on+optic+nerve+and+tectum+development+in+the+blind+cavefish+Astyanax.">The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax.</a> Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).</li><li>White, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+study+of+the+relationship+between+the+size+of+the+eye+and+the+size+of+the+optic+tectum+in+the+brain+of+the+developing+teleost,+Fundulus+heteroclitus.">An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus.</a> Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).</li><li>Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+growth+of+the+optic+tectum+in+goldfish.+II.+Modulation+of+cell+proliferation+by+retinal+fiber+input.">Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input.</a> The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).</li><li>Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+nerve+input-dependent+regulation+of+neural+stem+cell+proliferation+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish.">Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).</li><li>Hall, Z. J., Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+experience+facilitates+BDNF-dependent+adaptive+recruitment+of+new+neurons+in+the+postembryonic+optic+tectum.">Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marc's+modified+Ringer's+(MMR)+(10X,+pH+7.4).">Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4).</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li><li>Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+dissection+of+zebrafish+brain+development.">Anatomical dissection of zebrafish brain development.</a> Brain Development. 1082, 197-214 (2014).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>. ZFIN Tricaine recipe Available from: <a target="_blank" href="https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE">https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</a> (2018)</li><li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues.">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028 (2010).</li><li>. ZFIN protocols Available from: <a target="_blank" href="https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview">https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview</a> (2021)</li><li>Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trov&#242;, L., Paquet, D., Godinho, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+subcellular+structures+in+the+living+zebrafish+embryo.">Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456 (2016).</li><li>ImageJ with batteries included. Fiji Available from: <a target="_blank" href="https://figi.sc/">https://figi.sc/</a> (2021)</li><li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins.">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).</li><li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo.">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).</li><li>Karlstrom, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mutations+affecting+retinotectal+axon+pathfinding.">Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding.</a> Development. 123 (1), 427-438 (1996).</li><li>Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+nerve+regeneration+in+larval+zebrafish+exhibits+spontaneous+capacity+for+retinotopic+but+not+tectum+specific+axon+targeting.">Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting.</a> PLOS ONE. 14 (6), 0218667 (2019).</li><li>Robles, E., Filosa, A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+lamination+of+retinal+axons+generates+multiple+parallel+input+pathways+in+the+tectum.">Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum.</a> Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).</li><li>Vargas, M. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+Is+Wallerian+degeneration+in+the+CNS+so+slow.">Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).</li><li>Hughes, A. N., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+phagocytose+myelin+sheaths+to+modify+developmental+myelination.">Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination.</a> Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).</li><li>de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+physiological+analysis+in+a+zebrafish+model+of+epilepsy.">Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837 (2021).</li><li>Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+external+medium+composition+on+membrane+water+permeability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos.">The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos.</a> Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).</li><li>Fredj, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+activity-dependent+competition+regulates+axon+arbor+maturation,+growth+arrest,+and+territory+in+the+retinotectal+projection.">Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection.</a> Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).</li><li>Alberio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-gated+potassium+channel+for+sustained+neuronal+inhibition.">A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition.</a> Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).</li><li>Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+genesis+requires+lakritz,+a+zebrafish+atonal+homolog.">Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog.</a> Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).</li><li>Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+activity-deprived+zebrafish+mutant+macho+reveals+an+essential+requirement+of+neuronal+activity+for+the+development+of+a+fine-grained+visuotopic+map.">Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).</li><li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astyanax+surface+and+cave+fish+morphs.">Astyanax surface and cave fish morphs.</a> EvoDevo. 11 (1), 14 (2020).</li><li>Sieger, D., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+studying+microglia:+The+first,+the+popular,+and+the+new.">Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new.</a> Glia. 61 (1), 3-9 (2013).</li><li>Svahn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ramified+microglia+from+early+macrophages+in+the+zebrafish+optic+tectum.">Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum.</a> Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).</li><li>Herzog, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+clearance+of+cellular+debris+by+microglia+limits+secondary+neuronal+cell+death+after+brain+injury+in+vivo.">Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo.</a> Development. 146 (9), (2019).</li><li>Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-imaging+of+astrocyte+morphogenesis+and+function+in+zebrafish+neural+circuits.">Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).</li></ol>

As técnicas descritas neste artigo ilustram uma das muitas abordagens para estudar o desenvolvimento de sistemas visuais de vertebrados em zebrafish. Outros pesquisadores publicaram métodos para dissecar a retina embrionária e realizar análises de expressão genética19 ou visualizar a atividade neuronal no tectumóptico 30. Este artigo fornece uma abordagem para explorar como a entrada diferencial da retina pode influenciar os comportamentos celulares no tectum óptico...

O objetivo deste método é investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico, o centro de processamento visual no cérebro de zebrafish. Removendo um olho e, em seguida, comparando os dois lados do tectum óptico, alterações tectal dentro do mesmo espécime podem ser observadas e normalizadas, permitindo a comparação entre vários espécimes. Abordagens moleculares modernas combinadas com esta técnica produzirão insights sobre os mecanismos subjacentes ao crescimento e desenvolvimento do sistema visual, bem como a degeneração e regeneração axonal.
Sistemas sensoriais - visuais, auditivos e somatosensoriais - coletam informações de órgãos externos e retransmitem essas informações para o sistema nervoso central, gerando "mapas" do mundo externo em todo o cérebro médio 1,2. A visão é a modalidade sensorial dominante para quase todos os vertebrados, incluindo muitos peixes. A retina, o tecido neural no olho, reúne informações com um circuito neuronal composto principalmente por fotorreceptores, células bipolares e células gânglios da retina (RGCs), os neurônios de projeção da retina. Os RGCs têm longos axônios que encontram seu caminho através da superfície interna da retina até a cabeça do nervo óptico, onde eles fasciculam e viajam juntos através do cérebro, terminando no centro de processamento visual no cérebro dorsal. Esta estrutura é chamada de tectum óptico em peixes e outros vertebrados não-mamíferos e é homóloga ao colegiado superior em mamíferos3.
O tectum óptico é uma estrutura multicamadas bilateralmente simétrica no cérebro médio dorsal. Em zebrafish e na maioria dos outros peixes, cada lóbulo do tectum óptico recebe entrada visual apenas do olho contralateral, de modo que o nervo óptico esquerdo termina no lobo tectal direito e o nervo óptico direito termina no lobo tectal esquerdo4 (Figura 1). Assim como sua contraparte mamífera, o collículo superior, o tectum óptico integra informações visuais com outras entradas sensoriais, incluindo audição e somatosensação, controlando mudanças na atenção visual e movimentos oculares, como saccades 1,5,6. No entanto, ao contrário do colículo superior mamífero, o tectum óptico gera continuamente novos neurônios e glia a partir de um nicho especializado de células-tronco perto das bordas medial e caudal dos lobos tectais chamado zona de proliferação tectal7. A manutenção de progenitores proliferativos no tecto óptico e em outras regiões do sistema nervoso central contribui, em parte, para a notável capacidade regenerativa documentada no zebrafish8.
Trabalhos anteriores examinando os cérebros de peixes cegos ou caolho revelaram que o tamanho do tectum óptico é diretamente proporcional à quantidade de inervação da retina que recebe 9,10,11. Em peixes de cavernas adultos, cujos olhos degeneram em embriogênese precoce, o tectum óptico é visivelmente menor do que o de peixes de superfície9 intimamente relacionados. A degeneração dos olhos dos peixes das cavernas pode ser bloqueada substituindo a lente endógena por uma lente de um peixe superficial durante a embriogênese. Quando esses peixes de caverna de um olho só são criados até a idade adulta, o lobo tectal inervatado contém aproximadamente 10% mais células do que o lobo tectal não inervado9. Da mesma forma, em killifish larval que foram incubados com tratamentos químicos para gerar olhos de diferentes tamanhos dentro do mesmo indivíduo, o lado do tectum com mais inervação foi maior e continha mais neurônios10. Evidências de experimentos de esmagamento de nervo óptico em peixes-dourados adultos indicam que a inervação promove a proliferação, com a proliferação de células tectais diminuindo quando a inervação foi interrompida11.
Confirmando e ampliando esses estudos clássicos, vários relatórios recentes fornecem dados sugerindo que a proliferação em resposta à inervação é modulada, pelo menos em parte, pela via BDNF-TrkB12,13. Muitas questões abertas sobre o crescimento e desenvolvimento do tectum óptico permanecem, incluindo como um sistema sensorial em desenvolvimento lida com lesões e degeneração do axônio, que os sinais celulares e moleculares permitem a entrada da retina para regular o crescimento do tectum óptico, quando esses mecanismos se tornam ativos, e se a proliferação e diferenciação ligadas à invasão permitem que a retina e seu tecido alvo coordenem as taxas de crescimento e garantam um mapeamento retinotópico preciso. Além disso, há questões muito maiores sobre o desenvolvimento dependente da atividade que podem ser abordadas interrogando o sistema visual de zebrafish com abordagens cirúrgicas como a descrita abaixo.
Para investigar os mecanismos celulares e moleculares pelos quais a atividade neural, especificamente a partir da entrada visual, altera a sobrevivência e a proliferação celular, a abordagem descrita compara diretamente os lobos tectal invatados e denervados (Figura 1) dentro de larvas individuais de zebrafish. Este método permite a documentação da degeneração do axônio RGC no tectum óptico e a confirmação de que o número de células mitóticas se correlaciona com a inervação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63509/63509fig01.jpg"> Figura 1: Esboços de larvas de zebrafish antes e depois da remoção unilateral dos olhos. (A) Desenho de 5 larvas dpf vistas sob um microscópio dissecador. Cada larva é embutida em agarose de ponto de derretimento baixo e orientada lateralmente antes que uma agulha de tungstênio com uma ponta afiada e ligada seja usada para colher o olho voltado para cima (olho esquerdo neste exemplo). (B) Desenho da visão dorsal de uma larva de 9 dpf resultante da cirurgia retratada em A. Apenas três axônios RGC altamente esquematizados do olho direito são mostrados desfigurando e conectando-se com neurônios no lobo tectal esquerdo. Abreviaturas: dpf = dias pós fertilização; dps = dias após a cirurgia; RGC = células gânglios de retina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63509/63509fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment and supplies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breeding boxes</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high vacuum grease</td>
			<td>Sigma or equivalent supplier</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks (125 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>DWK Lifescience</td>
			<td>63A53 &#38; 63A53WT</td>
			<td>For pipetting embryos and larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides for microscopy</td>
			<td>VWR or equivalent supplier</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware including graduated bottles and graduated cylinders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making and storing solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-part epoxy resin</td>
			<td>ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent</td>
			<td>0.85 oz syringe</td>
			<td>https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.7 mL)</td>
			<td>VWR or equivalent supplier</td>
			<td>22234-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel plated pin holder (17 cm length)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>26018-17</td>
			<td>To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh tea strainer or equivalent</td>
			<td>Ali Express or equivalent</td>
			<td></td>
			<td>For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper clip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>Fischer Scientific or equivalent supplier</td>
			<td>50-190-0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mm</td>
			<td>Fischer Scientific or equivalent supplier</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette pump</td>
			<td>SP Bel-Art or equivalent</td>
			<td>F37898-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>909122</td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (variable voltage)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire (0.125 mm diameter)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>TGW0515</td>
			<td>Sharpen to remove eye and dissect larvae.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable temperature heat block</td>
			<td>The Lab Depot or equivalent supplier</td>
			<td>BSH1001 or BSH1002</td>
			<td>Set to 40-42 &#176;C ahead of experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wires with alligator clip leads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. 
			Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for surgeries and dissections:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Make 1% in embryo medium (E3) or Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374248</td>
			<td>For embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19210</td>
			<td>Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td>Dilute 1:100 in Marc&#39;s Modified Ringers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) tablets</td>
			<td>Diagnostic BioSystems</td>
			<td>DMR E404-01</td>
			<td>Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>100G #TRS1</td>
			<td>Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for immunohistochemistry:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI or ToPro3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1306 or T3605</td>
			<td>Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>A component of immunoblock buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td>Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50-062Z</td>
			<td>A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody to detect phosphohistone H3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td>Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)</td>
			<td>MBL International</td>
			<td>PM005</td>
			<td>Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (PK)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308-10MG</td>
			<td>Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 &#181;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Fiji)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop or GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available from the&#160; Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

eye removal in living zebrafish larvae to examine innervation-dependent growth and development of the visual system

Os zebrafish exibem notável crescimento ao longo da vida e habilidades regenerativas. Por exemplo, nichos especializados de células-tronco estabelecidos durante a embriogênese suportam o crescimento contínuo de todo o sistema visual, tanto no olho quanto no cérebro. O crescimento coordenado entre a retina e o tectum óptico garante um mapeamento retinotópico preciso à medida que novos neurônios são adicionados nos olhos e no cérebro. Para abordar se os axônios da retina fornecem informações cruciais para a regulação de comportamentos tectal e células progenitoras, como sobrevivência, proliferação e/ou diferenciação, é necessário ser capaz de comparar lóbulos tectal inervados e denervados dentro do mesmo animal e entre animais. 
A remoção cirúrgica de um olho de zebrafish larval vivo seguida da observação do tectum óptico atinge esse objetivo. O vídeo que acompanha demonstra como anestesiar larvas, afiar eleticamente agulhas de tungstênio e usá-las para remover um olho. Em seguida, mostra como dissecar cérebros de larvas de zebrafish fixas. Finalmente, o vídeo fornece uma visão geral do protocolo de imunohistoquímica e uma demonstração de como montar embriões manchados em agarose de ponto de baixa fusão para microscopia.

Para confirmar se a remoção dos olhos foi completa e avaliar como o tectum óptico muda, foram realizadas cirurgias na cepa Tg[atoh7:RFP], que rotula todas as RGCs com um RFP direcionado à membrana e, assim, todos os axônios que projetam a partir da retina e formam o nervo óptico24. Embora o uso dessa cepa não seja absolutamente necessário, permite a observação e visualização direta do nervo óptico termini no neuropil tectum óptico. Outras abordagens para rotular o nervo ópt...

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Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

O artigo explica como remover cirurgicamente os olhos das larvas vivas de zebrafish como o primeiro passo para investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico. Além disso, o artigo fornece informações sobre anestesia larval, fixação e dissecção cerebral, seguida de imunohistoquímica e imagem confocal.

Remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Então meu laboratório está interessado em entender como o olho e o cérebro crescem juntos. Essa técnica nos permite estudar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do cérebro. A remoção cirúrgica de um olho do zebrafish larval vivo, seguida da observação do tectum óptico, permite comparar lobos tectal inervados e denervados dentro do mesmo animal e em animais.Combinar essa técnica com abordagens moleculares modernas pode dar uma nova visão sobre mecanismos subjacentes ao desenvolvimento neural, regeneração e degeneração. Para começar, conecte os fios de cátodo e ânodo à fonte de alimentação. Conecte o clipe de jacaré na extremidade do fio do cátodo a um clipe de papel parcialmente endireitado e insira o clipe de papel na solução de hidróxido de potássio, prendendo-o ao lado do frasco.Coloque o clipe do jacaré do fio ânodo no pescoço do suporte da agulha. Gire a energia para aproximadamente 20 volts e mergulhe o fio de tungstênio na solução de hidróxido de potássio, puxando o fio para fora da solução em um ângulo para afiar eleticamente o fio em uma ponta fina. Verifique a ponta da agulha sob o microscópio de dissecação para garantir que ela esteja afiada o suficiente.A ponta da agulha curva resulta quando a agulha afiada é dobrada tocando-a suavemente na placa de Petri. No dia da cirurgia, use uma pipeta de pastagem de vidro de furo largo para transferir de 10 a 15 larvas para uma placa de Petri de 35 milímetros cheia de E3 fresca. Adicione três a cinco gotas de anestésico à larva. Para determinar se as larvas estão adequadamente anestesiadas, procure a falta de resposta ao toque.Adicione mais duas a três gotas do anestésico se as larvas ainda responderem ao toque após três minutos e reavaliar. Para imobilizar a larva para cirurgia, leve uma larva para cima em uma pipeta de pastagem de vidro com apenas uma pequena quantidade de E3. Em seguida, pegue aproximadamente 200 microliters de ponto de fusão derretido 1% baixo ou LMP agarose na pipeta contendo a larva e misture para garantir que a larva seja suspensa na agarose LMP. Coloque a tampa de uma placa de Petri de 35 milímetros virada sob o microscópio dissecando, em seguida, esguiche a larva e a agarose sobre a tampa da placa de Petri de cabeça para baixo.Espalhe a agarose para que a larva esteja no centro da queda. Usando uma agulha de tungstênio maçante, manobrar rapidamente, mas suavemente, a larva para que fique lateral com um olho voltado para cima. Espere vários minutos para a agarose definir.Seguindo a borda da órbita dos olhos, use a ponta de uma fina agulha de tungstênio eleticamente afiada para perfurar a pele ao redor do olho. Em seguida, deslize a borda da agulha sob o olho do lado temporal-ventral do olho. Use pressão controlada para soltar o olho da tomada.Continue pressionando o olho dorsalmente e anteriormente com o lado da agulha, eventualmente cortando através do nervo óptico e liberando o olho. Alternativamente, você pode usar fórceps cirúrgicos muito finos para remover o olho, beliscando o nervo óptico e empurrando o olho de medial para lateral. Após uma remoção bem sucedida do olho, cubra a agarose com solução MMR, liberte cada larva da agarose escovando suavemente uma agulha de tungstênio em torno de sua cabeça e, em seguida, em torno de seu corpo, enquanto estabiliza a tampa da placa de Petri com fórceps.Após as cirurgias, coloque a larva na solução mmr complementada com antibióticos até o dia seguinte, depois devolva a larva para a E3 e elare as até o ponto final do experimento. Depois que a larva for anestesiada terminalmente, fixe-as com 4% de paraformaldeído. Suspenda as larvas fixas em gotículas PBS em uma placa de vedação sob um microscópio dissecando.Fixe-os lateralmente colocando dois pinos de tungstênio através do notochord com um pino posterior à área pigmentada cobrindo a região AGM e outro em linha com a extremidade da extensão da gema. Remova o olho com uma agulha de tungstênio afiada e fórceps finos. Às vezes é possível cutucar a agulha através da mandíbula para o lado oposto e remover o outro olho.Use a agulha de tungstênio para coçar do temporal para o lado ventral da orelha. Na mesma ação em movimento, leve a agulha posterior à mandíbula e puxe suavemente anteriormente até que a orelha e a mandíbula sejam removidas. Remova o outro olho e orelha cutucando a agulha através da mandíbula.Use fórceps para retirar os órgãos ventrais e a gema restante. Finalmente, faça uma incisão rasa na pele craniana dorsal perto da junção entre o cérebro traseiro e a medula espinhal. Levante a pele com os fórceps e puxe-a anteriormente e ao redor do telencephalon.Remova qualquer tecido restante com fórceps. Despreeça a larva e transfira para PBS em tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro. Fixar um deslizamento de câmara na tampa de uma placa de Petri de 100 milímetros com graxa de vácuo.Transfira a larva imunossu detida e processada para uma placa de poço ou deslizamento de depressão para vê-las com um microscópio dissecando. Monte a larva no escorregador de câmara em colunas de agarose de 1%LMP. Usando um copo além da pipeta, coloque uma larva no escorregador de câmara, depositando o mínimo de PBS possível.Cubra a larva com agarose derretida e quente de 1%LMP usando a mesma pipeta. Pipeta o LMP surgiu em uma coluna e, em seguida, posicionar a larva tão simetricamente quanto possível com a superfície dorsal visível. Após a remoção dos olhos, observou-se degeneração progressiva dos axônios de retina no neuropil tectum óptico.Em dois dias após a cirurgia, os axônios rotulados pela RFP exibiram marcas de rápida degeneração walleriana, como blabbing e fragmentação. Os punctas positivos rfp foram notados dentro e fora do neuropil no lado direito do tectum, conforme indicado pelas setas. Em quatro dias após a cirurgia, axônios fragmentados e detritos axonais rotulados por RFP foram consideravelmente reduzidos no lobo tectal direito, indicando uma liberação relativamente rápida dos axônios moribundos e degenerados.O cérebro foi exposto dissecando os olhos, mandíbula, orelhas e crânio da pele e tecidos conjuntivos. Idealmente, o cérebro permanece intacto durante este procedimento. No entanto, partes do cérebro da frente, particularmente a lâmpada olfativa, foram provavelmente danificadas ou completamente removidas quando a tampa do crânio da pele ou mandíbula foi removida.Além disso, às vezes a borda lateral do tectum é cortada ao perfurar ou beliscar a pele para retirá-la do cérebro. Nenhuma amostra é idêntica. Então você precisa ser capaz de fazer adaptações sutis através da remoção dos olhos e dissecção cerebral conforme necessário.Pacientes e ferramentas afiadas são essenciais para o sucesso. Essa técnica pode ser acompanhada de abordagens celulares e moleculares, como a imagem de células vivas in vivo ou sequenciamento de RNA para obter novas percepções sobre os mecanismos moleculares e celulares do crescimento e desenvolvimento do tectum óptico.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Usando folha de luz microscopia de fluorescência para Imagem Desenvolvimento Zebrafish Eye

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Métodos para examinar a linfa Gland e Hemócitos em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...