Name: eye removal in living zebrafish larvae to examine innervation-dependent growth and development of the visual system
Uploaded: 2022-02-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System at JoVE.com

El financiamiento para este trabajo fue apoyado principalmente por fondos de inicio de Reed College a KLC, fondos de Helen Stafford Research Fellowship a OLH y una beca de investigación científica de Reed College a YK. Este proyecto comenzó en el laboratorio de Steve Wilson como una colaboración con Recursos Humanos, quien fue apoyado por un Wellcome Trust Studentship (2009-2014). Agradecemos a Máté Varga, Steve Wilson y otros miembros del laboratorio Wilson por las discusiones iniciales sobre este proyecto, y agradecemos especialmente a Florencia Cavodeassi y Kate Edwards, quienes fueron las primeras en enseñar a KLC cómo montar embriones en agarosa y realizar disecciones cerebrales de pez cebra. También agradecemos a Greta Glover y Jay Ewing por su ayuda con el montaje de nuestro dispositivo de afilado con aguja de tungsteno.

Los métodos en este documento se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas y la aprobación de los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Reed College y University College London. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre las cepas de pez cebra utilizadas en este estudio.
1. Preparar materiales y herramientas
<ol><li>Hacer soluciones.<ol>
<li>Hacer embrión medio (E314) diluyendo una cepa de 60x (3...

<ol>
	<li>Butler, A. B., Hodos, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+tectum.">Optic tectum.</a> Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , 311-340 (2005).</li><li>Cang, J., Feldheim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+mechanisms+of+topographic+map+formation+and+alignment.">Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment.</a> Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).</li><li>Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+circuits+of+visual+perception+and+cognition+through+the+superior+colliculus.">Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus.</a> Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).</li><li>Burrill, J. D., Easter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+retinofugal+projections+in+the+embryonic+and+larval+zebrafish+(Brachydanio+rerio).">Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio).</a> The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).</li><li>Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System Available from: <a target="_blank" href="https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/">https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/</a> (2021)</li><li>Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System Available from: <a target="_blank" href="https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/">https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/</a> (2021)</li><li>Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continued+growth+and+circuit+building+in+the+anamniote+visual+system.">Continued growth and circuit building in the anamniote visual system.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).</li><li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish.">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).</li><li>Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+has+a+specific+influence+on+optic+nerve+and+tectum+development+in+the+blind+cavefish+Astyanax.">The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax.</a> Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).</li><li>White, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+study+of+the+relationship+between+the+size+of+the+eye+and+the+size+of+the+optic+tectum+in+the+brain+of+the+developing+teleost,+Fundulus+heteroclitus.">An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus.</a> Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).</li><li>Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+growth+of+the+optic+tectum+in+goldfish.+II.+Modulation+of+cell+proliferation+by+retinal+fiber+input.">Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input.</a> The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).</li><li>Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+nerve+input-dependent+regulation+of+neural+stem+cell+proliferation+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish.">Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).</li><li>Hall, Z. J., Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+experience+facilitates+BDNF-dependent+adaptive+recruitment+of+new+neurons+in+the+postembryonic+optic+tectum.">Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marc's+modified+Ringer's+(MMR)+(10X,+pH+7.4).">Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4).</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li><li>Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+dissection+of+zebrafish+brain+development.">Anatomical dissection of zebrafish brain development.</a> Brain Development. 1082, 197-214 (2014).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>. ZFIN Tricaine recipe Available from: <a target="_blank" href="https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE">https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</a> (2018)</li><li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues.">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028 (2010).</li><li>. ZFIN protocols Available from: <a target="_blank" href="https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview">https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview</a> (2021)</li><li>Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trov&#242;, L., Paquet, D., Godinho, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+subcellular+structures+in+the+living+zebrafish+embryo.">Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456 (2016).</li><li>ImageJ with batteries included. Fiji Available from: <a target="_blank" href="https://figi.sc/">https://figi.sc/</a> (2021)</li><li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins.">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).</li><li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo.">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).</li><li>Karlstrom, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mutations+affecting+retinotectal+axon+pathfinding.">Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding.</a> Development. 123 (1), 427-438 (1996).</li><li>Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+nerve+regeneration+in+larval+zebrafish+exhibits+spontaneous+capacity+for+retinotopic+but+not+tectum+specific+axon+targeting.">Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting.</a> PLOS ONE. 14 (6), 0218667 (2019).</li><li>Robles, E., Filosa, A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+lamination+of+retinal+axons+generates+multiple+parallel+input+pathways+in+the+tectum.">Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum.</a> Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).</li><li>Vargas, M. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+Is+Wallerian+degeneration+in+the+CNS+so+slow.">Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).</li><li>Hughes, A. N., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+phagocytose+myelin+sheaths+to+modify+developmental+myelination.">Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination.</a> Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).</li><li>de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+physiological+analysis+in+a+zebrafish+model+of+epilepsy.">Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837 (2021).</li><li>Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+external+medium+composition+on+membrane+water+permeability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos.">The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos.</a> Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).</li><li>Fredj, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+activity-dependent+competition+regulates+axon+arbor+maturation,+growth+arrest,+and+territory+in+the+retinotectal+projection.">Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection.</a> Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).</li><li>Alberio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-gated+potassium+channel+for+sustained+neuronal+inhibition.">A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition.</a> Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).</li><li>Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+genesis+requires+lakritz,+a+zebrafish+atonal+homolog.">Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog.</a> Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).</li><li>Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+activity-deprived+zebrafish+mutant+macho+reveals+an+essential+requirement+of+neuronal+activity+for+the+development+of+a+fine-grained+visuotopic+map.">Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).</li><li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astyanax+surface+and+cave+fish+morphs.">Astyanax surface and cave fish morphs.</a> EvoDevo. 11 (1), 14 (2020).</li><li>Sieger, D., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+studying+microglia:+The+first,+the+popular,+and+the+new.">Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new.</a> Glia. 61 (1), 3-9 (2013).</li><li>Svahn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ramified+microglia+from+early+macrophages+in+the+zebrafish+optic+tectum.">Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum.</a> Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).</li><li>Herzog, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+clearance+of+cellular+debris+by+microglia+limits+secondary+neuronal+cell+death+after+brain+injury+in+vivo.">Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo.</a> Development. 146 (9), (2019).</li><li>Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-imaging+of+astrocyte+morphogenesis+and+function+in+zebrafish+neural+circuits.">Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).</li></ol>

Las técnicas descritas en este artículo ilustran uno de los muchos enfoques para estudiar el desarrollo del sistema visual de vertebrados en el pez cebra. Otros investigadores han publicado métodos para diseccionar la retina embrionaria y realizar análisis de expresión génica19 o visualizar la actividad neuronal en el tectum óptico30. Este artículo proporciona un enfoque para explorar cómo la entrada diferencial de la retina puede influir en los comportamientos cel...

El objetivo de este método es investigar cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del tectum óptico, el centro de procesamiento visual en el cerebro del pez cebra. Al extraer un ojo y luego comparar los dos lados del tectum óptico, se pueden observar y normalizar los cambios técnicos dentro de la misma muestra, lo que permite la comparación entre múltiples muestras. Los enfoques moleculares modernos combinados con esta técnica proporcionarán información sobre los mecanismos subyacentes al crecimiento y desarrollo del sistema visual, así como a la degeneración y regeneración axonal.
Los sistemas sensoriales (visual, auditivo y somatosensorial) recopilan información de los órganos externos y transmiten esa información al sistema nervioso central, generando "mapas" del mundo externo a través delmesencéfalo 1,2. La visión es la modalidad sensorial dominante para casi todos los vertebrados, incluidos muchos peces. La retina, el tejido neural en el ojo, recopila información con un circuito neuronal que consiste principalmente en fotorreceptores, células bipolares y células ganglionares de la retina (RGC), las neuronas de proyección de la retina. Los RGC tienen axones largos que encuentran su camino a través de la superficie interna de la retina hasta la cabeza del nervio óptico, donde fasciculan y viajan juntos a través del cerebro, terminando finalmente en el centro de procesamiento visual en el mesencéfalo dorsal. Esta estructura se denomina tectum óptico en peces y otros vertebrados no mamíferos y es homóloga al colículo superior en mamíferos3.
El tectum óptico es una estructura multicapa bilateralmente simétrica en el mesencéfalo dorsal. En el pez cebra y la mayoría de los otros peces, cada lóbulo del tectum óptico recibe información visual únicamente del ojo contralateral, de modo que el nervio óptico izquierdo termina en el lóbulo tectal derecho y el nervio óptico derecho termina en el lóbulo tecttal izquierdo4 (Figura 1). Al igual que su contraparte en mamíferos, el colículo superior, el tectum óptico integra la información visual con otras entradas sensoriales, incluyendo la audición y la somatosensación, controlando los cambios en la atención visual y los movimientos oculares como las sacadas 1,5,6. Sin embargo, a diferencia del colículo superior de los mamíferos, el tectum óptico genera continuamente nuevas neuronas y glía a partir de un nicho especializado de células madre cerca de los bordes medial y caudal de los lóbulos tectales llamado zona de proliferacióntectal 7. El mantenimiento de progenitores proliferativos en el tectum óptico y otras regiones del sistema nervioso central contribuye, en parte, a la notable capacidad regenerativa documentada en el pez cebra8.
Trabajos previos que examinaron los cerebros de peces ciegos o tuertos revelaron que el tamaño del tectum óptico es directamente proporcional a la cantidad de inervación retiniana que recibe 9,10,11. En los peces de cueva adultos, cuyos ojos degeneran en la embriogénesis temprana, el tectum óptico es notablemente más pequeño que el de los peces de superficie avistados estrechamente relacionados9. La degeneración del ojo de pez de cueva se puede bloquear reemplazando la lente endógena con una lente de un pez de superficie durante la embriogénesis. Cuando estos peces de cueva tuertos se crían hasta la edad adulta, el lóbulo tectal inervado contiene aproximadamente un 10% más de células que el lóbulo tectal no inervado9. Del mismo modo, en los killifish larvales que fueron incubados con tratamientos químicos para generar ojos de diferentes tamaños dentro del mismo individuo, el lado del tectum con más inervación era más grande y contenía más neuronas10. La evidencia de los experimentos de aplastamiento del nervio óptico en peces de colores adultos indica que la inervación promueve la proliferación, con la proliferación de células tectales disminuyendo cuando se interrumpió la inervación11.
Confirmando y extendiendo estos estudios clásicos, varios informes recientes proporcionan datos que sugieren que la proliferación en respuesta a la inervación está modulada, al menos en parte, por la vía BDNF-TrkB12,13. Quedan muchas preguntas abiertas sobre el crecimiento y desarrollo del tectum óptico, incluida la forma en que un sistema sensorial en desarrollo hace frente a las lesiones y la degeneración del axón, qué señales celulares y moleculares permiten que la entrada de la retina regule el crecimiento del tectum óptico, cuándo estos mecanismos se activan y si la proliferación y la diferenciación vinculadas a la inervación permiten que la retina y su tejido objetivo coordinen las tasas de crecimiento y garanticen un mapeo retinotópico preciso. Además, hay preguntas mucho más grandes sobre el desarrollo dependiente de la actividad que se pueden abordar interrogando el sistema visual del pez cebra con enfoques quirúrgicos como el que se describe a continuación.
Para investigar los mecanismos celulares y moleculares por los cuales la actividad neuronal, específicamente a partir de la entrada visual, altera la supervivencia y proliferación celular, el enfoque descrito compara directamente los lóbulos tectales inervados y denervados (Figura 1) dentro de larvas individuales de pez cebra. Este método permite la documentación de la degeneración del axón RGC en el tectum óptico y la confirmación de que el número de células mitóticas se correlaciona con la inervación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63509/63509fig01.jpg"> Figura 1: Bocetos de larvas de pez cebra antes y después de la extracción unilateral del ojo. (A) Dibujo de larvas de 5 dpf vistas bajo un microscopio de disección. Cada larva está incrustada en agarosa de bajo punto de fusión y orientada lateralmente antes de que se use una aguja de tungsteno con una punta afilada y enganchada para sacar el ojo hacia arriba (ojo izquierdo en este ejemplo). (B) Dibujo de la vista dorsal de una larva de 9 dpf resultante de la cirugía representada en A. Solo tres axones RGC altamente esquematizados del ojo derecho se muestran desfasciculando y conectando con neuronas en el lóbulo tectal izquierdo. Abreviaturas: dpf = días después de la fertilización; dps = días después de la cirugía; RGC = células ganglionares de la retina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63509/63509fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment and supplies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breeding boxes</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high vacuum grease</td>
			<td>Sigma or equivalent supplier</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks (125 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>DWK Lifescience</td>
			<td>63A53 &#38; 63A53WT</td>
			<td>For pipetting embryos and larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides for microscopy</td>
			<td>VWR or equivalent supplier</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware including graduated bottles and graduated cylinders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making and storing solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-part epoxy resin</td>
			<td>ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent</td>
			<td>0.85 oz syringe</td>
			<td>https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.7 mL)</td>
			<td>VWR or equivalent supplier</td>
			<td>22234-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel plated pin holder (17 cm length)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>26018-17</td>
			<td>To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh tea strainer or equivalent</td>
			<td>Ali Express or equivalent</td>
			<td></td>
			<td>For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper clip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>Fischer Scientific or equivalent supplier</td>
			<td>50-190-0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mm</td>
			<td>Fischer Scientific or equivalent supplier</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette pump</td>
			<td>SP Bel-Art or equivalent</td>
			<td>F37898-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>909122</td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (variable voltage)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire (0.125 mm diameter)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>TGW0515</td>
			<td>Sharpen to remove eye and dissect larvae.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable temperature heat block</td>
			<td>The Lab Depot or equivalent supplier</td>
			<td>BSH1001 or BSH1002</td>
			<td>Set to 40-42 &#176;C ahead of experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wires with alligator clip leads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. 
			Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for surgeries and dissections:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Make 1% in embryo medium (E3) or Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374248</td>
			<td>For embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19210</td>
			<td>Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td>Dilute 1:100 in Marc&#39;s Modified Ringers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) tablets</td>
			<td>Diagnostic BioSystems</td>
			<td>DMR E404-01</td>
			<td>Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>100G #TRS1</td>
			<td>Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for immunohistochemistry:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI or ToPro3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1306 or T3605</td>
			<td>Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>A component of immunoblock buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td>Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50-062Z</td>
			<td>A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody to detect phosphohistone H3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td>Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)</td>
			<td>MBL International</td>
			<td>PM005</td>
			<td>Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (PK)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308-10MG</td>
			<td>Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 &#181;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Fiji)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop or GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available from the&#160; Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

eye removal in living zebrafish larvae to examine innervation-dependent growth and development of the visual system

El pez cebra exhibe un notable crecimiento de por vida y habilidades regenerativas. Por ejemplo, los nichos especializados de células madre establecidos durante la embriogénesis apoyan el crecimiento continuo de todo el sistema visual, tanto en el ojo como en el cerebro. El crecimiento coordinado entre la retina y el tectum óptico garantiza un mapeo retinotópico preciso a medida que se agregan nuevas neuronas en los ojos y el cerebro. Para abordar si los axones de la retina proporcionan información crucial para regular los comportamientos de las células madre y progenitoras tectales, como la supervivencia, la proliferación y / o la diferenciación, es necesario poder comparar los lóbulos tectales inervados y denervados dentro del mismo animal y entre animales. 
La extirpación quirúrgica de un ojo del pez cebra larval vivo seguida de la observación del tectum óptico logra este objetivo. El video que lo acompaña muestra cómo anestesiar larvas, afilar electrolíticamente agujas de tungsteno y usarlas para extirpar un ojo. A continuación, muestra cómo diseccionar cerebros de larvas fijas de pez cebra. Finalmente, el video proporciona una visión general del protocolo para la inmunohistoquímica y una demostración de cómo montar embriones teñidos en agarosa de bajo punto de fusión para microscopía.

Para confirmar si la extirpación ocular fue completa y evaluar cómo cambia el tectum óptico, se realizaron cirugías en la cepa Tg[atoh7:RFP], que marca todas las RGC con una RFP dirigida a la membrana y, por lo tanto, todos los axones que se proyectan desde la retina y forman el nervio óptico24. Aunque el uso de esta cepa no es absolutamente necesario, permite la observación y visualización directa del nervio óptico termini en el tectum neuropil óptico. Otros enfoques para etique...

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Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

El artículo explica cómo extirpar quirúrgicamente los ojos de las larvas vivas de pez cebra como el primer paso hacia la investigación de cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del tectum óptico. Además, el artículo proporciona información sobre la anestesia larvaria, la fijación y la disección cerebral, seguida de inmunohistoquímica e imágenes confocales.

Extirpación de ojos en larvas vivas de pez cebra para examinar el crecimiento dependiente de la inervación y el desarrollo del sistema visual

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Así que mi laboratorio está interesado en entender cómo el ojo y el cerebro crecen juntos. Esta técnica nos permite estudiar cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del cerebro. La extirpación quirúrgica de un ojo del pez cebra larval vivo, seguida de la observación del tectum óptico, nos permite comparar lóbulos tectales inervados y denervados dentro del mismo animal y entre animales.La combinación de esta técnica con enfoques moleculares modernos puede dar una nueva visión de los mecanismos subyacentes al desarrollo neuronal, la regeneración y la degeneración. Para comenzar, conecte los cables de cátodo y ánodo a la fuente de alimentación. Coloque el clip de cocodrilo en el extremo del alambre del cátodo a un clip parcialmente enderezado e inserte el clip en la solución de hidróxido de potasio, uniéndolo al costado del frasco.Conecte el clip de cocodrilo del alambre del ánodo al cuello del soporte de la aguja. Gire la potencia a aproximadamente 20 voltios y sumerja el cable de tungsteno en la solución de hidróxido de potasio, sacando el cable de la solución en ángulo para afilar electrolíticamente el cable en una punta fina. Revise la punta de la aguja debajo del microscopio de disección para asegurarse de que sea lo suficientemente afilada.La punta de la aguja curva se produce cuando la aguja afilada se dobla tocándola suavemente en la placa de Petri. El día de la cirugía, use una pipeta de pasto de vidrio de diámetro ancho para transferir de 10 a 15 larvas a una placa de Petri de 35 milímetros llena de E3 fresco. Agregue de tres a cinco gotas de anestésico a la larva. Para determinar si las larvas están adecuadamente anestesiadas, busque la falta de respuesta táctil.Agregue dos o tres gotas más del anestésico si las larvas aún responden al tacto después de tres minutos y vuelva a evaluar. Para inmovilizar la larva para la cirugía, lleve una larva a una pipeta de pasto de vidrio de diámetro estrecho con solo una pequeña cantidad de E3. A continuación, tome aproximadamente 200 microlitros de punto de fusión fundido al 1% bajo o agarosa LMP en la pipeta que contiene la larva y mezcle para asegurarse de que la larva esté suspendida en la agarosa LMP. Coloque la tapa de una placa de Petri de 35 milímetros boca arriba bajo el microscopio de disección, luego rocíe la larva y la agarosa sobre la tapa de la placa de Petri al revés.Extienda la agarosa para que la larva esté en el centro de la gota. Usando una aguja de tungsteno opaca, maniobre rápida pero suavemente la larva para que quede lateral con un ojo hacia arriba. Espere varios minutos para que la agarosa se establezca.Siguiendo el borde de la órbita del ojo, use la punta de una aguja de tungsteno fina y afilada electrolíticamente para perforar la piel alrededor del ojo. Luego deslice el borde de la aguja debajo del ojo desde el lado temporal-ventral del ojo. Use presión controlada para liberar el ojo de la cuenca.Siga presionando el ojo dorsal y anteriormente con el lado de la aguja, eventualmente cortando a través del nervio óptico y liberando el ojo. Alternativamente, puede usar fórceps quirúrgicos muy finos para extirpar el ojo pellizcando el nervio óptico y empujando el ojo de medial a lateral. Después de la extracción exitosa del ojo, cubra la agarosa con solución MMR, libere a cada larva de la agarosa cepillando suavemente una aguja de tungsteno alrededor de su cabeza y luego alrededor de su cuerpo, mientras estabiliza la tapa de la placa de Petri con fórceps.Después de las cirugías, coloque la larva en una solución MMR suplementada con antibióticos hasta el día siguiente, luego devuelva la larva al E3 y recuévala hasta el punto final del experimento. Después de que las larvas se anestesian terminalmente, fíjelas con paraformaldehído al 4%. Suspenda las larvas fijas en gotas de PBS en una placa de protección de sellos bajo un microscopio de disección.Asegúrelos lateralmente colocando dos pasadores de tungsteno a través de la notocorda con un pasador posterior al área pigmentada que cubre la región AGM y otro en línea con el extremo de la extensión de la yema. Retire el ojo con una aguja de tungsteno afilada y fórceps finos. A veces es posible pasar la aguja a través de la mandíbula hasta el lado opuesto y extraer el otro ojo.Use la aguja de tungsteno para rascarse desde el lado temporal hasta el ventral de la oreja. En la misma acción en movimiento, lleve la aguja hacia atrás de la mandíbula y tire suavemente hacia arriba hasta que se retiren la oreja y la mandíbula. Extraiga el otro ojo y la oreja metiendo la aguja a través de la mandíbula.Use fórceps para extraer los órganos ventrales y la yema restante. Finalmente, haga una incisión poco profunda en la piel craneal dorsal cerca de la unión entre el cerebro posterior y la médula espinal. Levante la piel con las pinzas y tire de ella hacia arriba y alrededor del telencéfalo.Retire cualquier tejido restante con fórceps. Desancle la larva y transfiérala a PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Asegure un portaobjetos con cámara en la tapa de una placa de Petri de 100 milímetros con grasa al vacío.Transfiera la larva inmunoteñida y procesada a una placa de pozo o portaobjetos de depresión para verlas con un microscopio de disección. Monte la larva en el portaobjetos con cámara en columnas de agarosa 1%LMP. Usando un vaso más allá de su pipeta, coloque una larva en el portaobjetos con cámara, depositando la menor cantidad de PBS posible.Cubra la larva con agarosa 1%LMP derretida y tibia con la misma pipeta. Pipetear la agarosa LMP en una columna y luego colocar la larva lo más simétricamente posible con la superficie dorsal visible. Después de la extirpación ocular, se observó degeneración progresiva de los axones de la retina en el tectum neuropil óptico.A los dos días después de la cirugía, los axones etiquetados con RFP exhibieron características distintivas de la rápida degeneración walleriana, como balbuceos y fragmentación. Se observaron puncta positivos de RFP tanto dentro como fuera del neuropil en el lado derecho del tectum como lo indican las flechas. A los cuatro días después de la cirugía, los axones fragmentados y los restos axonales marcados con RFP se redujeron considerablemente en el lóbulo tecttal derecho, lo que indica una eliminación relativamente rápida de los axones moribundos y degenerativos.El cerebro fue expuesto diseccionando los ojos, la mandíbula, las orejas y la escutelaria de la piel y los tejidos conectivos. Idealmente, el cerebro permanece intacto durante este procedimiento. Sin embargo, partes del cerebro anterior, particularmente el bulbo olfativo, probablemente se dañaron o se eliminaron por completo cuando se eliminó la tapa del cráneo de la piel o la mandíbula.Además, a veces la cornisa lateral del tectum se corta al perforar o pellizcar la piel para sacarla del cerebro. No hay dos muestras idénticas. Por lo tanto, debe poder hacer adaptaciones sutiles a través de la extirpación de los ojos y la disección cerebral según sea necesario.Los pacientes y las herramientas afiladas son esenciales para el éxito. Esta técnica puede ser seguida con enfoques celulares y moleculares, como imágenes de células vivas in vivo o secuenciación de ARN para obtener nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares y celulares del crecimiento y desarrollo del tectum óptico.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Utilización de hojas de luz de microscopía de fluorescencia a la imagen de ojo de pez cebra Desarrollo

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Métodos para examinar los nódulos linfáticos y en los hemocitos<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Inducción de la hipoxia en los sapos vivos y los embriones de pez cebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Sola célula Photoconversion en pez cebra intacto de la vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...