Name: eye removal in living zebrafish larvae to examine innervation-dependent growth and development of the visual system
Uploaded: 2022-02-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System at JoVE.com

Bu çalışmanın finansmanı öncelikle Reed College'dan KLC'ye, Helen Stafford Research Fellowship fonlarından OLH'ye ve Reed College Science Research Fellowship'ten YK'ya başlangıç fonları ile desteklendi. Bu proje, Steve Wilson'ın laboratuvarında, Wellcome Trust Studentship (2009-2014) tarafından desteklenen İK ile işbirliği içinde başladı. Máté Varga, Steve Wilson ve Wilson laboratuvarının diğer üyelerine bu proje hakkındaki ilk tartışmalar için teşekkür ediyoruz ve özellikle KLC'ye agarozda embriyoların nasıl monte edileceğini ve zebra balığı beyin diseksiyonlarının nasıl yapılacağını öğreten ilk Florencia Cavodeassi ve Kate Edwards'a teşekkür ediyoruz. Ayrıca Greta Glover ve Jay Ewing'e tungsten iğne bileme cihazımızın montajında yardımcı oldukları için teşekkür ederiz.

Bu makaledeki yöntemler, Reed College ve University College London'ın Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitelerinin kılavuzlarına ve onayına uygun olarak yürütülmüştür. Bu çalışmada kullanılan zebra balığı suşları hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Malzeme ve araçlar hazırlayın
<ol><li>Çözümler üretin.<ol>
<li>60x'lik bir stoğu (300 mM NaCl, 10.2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-dihidrat ve 20 mM MgCl2-hekzah...

<ol>
	<li>Butler, A. B., Hodos, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+tectum.">Optic tectum.</a> Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , 311-340 (2005).</li><li>Cang, J., Feldheim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+mechanisms+of+topographic+map+formation+and+alignment.">Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment.</a> Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).</li><li>Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+circuits+of+visual+perception+and+cognition+through+the+superior+colliculus.">Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus.</a> Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).</li><li>Burrill, J. D., Easter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+retinofugal+projections+in+the+embryonic+and+larval+zebrafish+(Brachydanio+rerio).">Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio).</a> The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).</li><li>Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System Available from: <a target="_blank" href="https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/">https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/</a> (2021)</li><li>Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System Available from: <a target="_blank" href="https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/">https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/</a> (2021)</li><li>Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continued+growth+and+circuit+building+in+the+anamniote+visual+system.">Continued growth and circuit building in the anamniote visual system.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).</li><li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish.">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).</li><li>Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+has+a+specific+influence+on+optic+nerve+and+tectum+development+in+the+blind+cavefish+Astyanax.">The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax.</a> Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).</li><li>White, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+study+of+the+relationship+between+the+size+of+the+eye+and+the+size+of+the+optic+tectum+in+the+brain+of+the+developing+teleost,+Fundulus+heteroclitus.">An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus.</a> Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).</li><li>Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+growth+of+the+optic+tectum+in+goldfish.+II.+Modulation+of+cell+proliferation+by+retinal+fiber+input.">Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input.</a> The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).</li><li>Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+nerve+input-dependent+regulation+of+neural+stem+cell+proliferation+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish.">Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).</li><li>Hall, Z. J., Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+experience+facilitates+BDNF-dependent+adaptive+recruitment+of+new+neurons+in+the+postembryonic+optic+tectum.">Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marc's+modified+Ringer's+(MMR)+(10X,+pH+7.4).">Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4).</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li><li>Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+dissection+of+zebrafish+brain+development.">Anatomical dissection of zebrafish brain development.</a> Brain Development. 1082, 197-214 (2014).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>. ZFIN Tricaine recipe Available from: <a target="_blank" href="https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE">https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</a> (2018)</li><li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues.">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028 (2010).</li><li>. ZFIN protocols Available from: <a target="_blank" href="https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview">https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview</a> (2021)</li><li>Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trov&#242;, L., Paquet, D., Godinho, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+subcellular+structures+in+the+living+zebrafish+embryo.">Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456 (2016).</li><li>ImageJ with batteries included. Fiji Available from: <a target="_blank" href="https://figi.sc/">https://figi.sc/</a> (2021)</li><li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins.">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).</li><li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo.">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).</li><li>Karlstrom, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mutations+affecting+retinotectal+axon+pathfinding.">Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding.</a> Development. 123 (1), 427-438 (1996).</li><li>Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+nerve+regeneration+in+larval+zebrafish+exhibits+spontaneous+capacity+for+retinotopic+but+not+tectum+specific+axon+targeting.">Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting.</a> PLOS ONE. 14 (6), 0218667 (2019).</li><li>Robles, E., Filosa, A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+lamination+of+retinal+axons+generates+multiple+parallel+input+pathways+in+the+tectum.">Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum.</a> Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).</li><li>Vargas, M. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+Is+Wallerian+degeneration+in+the+CNS+so+slow.">Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).</li><li>Hughes, A. N., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+phagocytose+myelin+sheaths+to+modify+developmental+myelination.">Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination.</a> Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).</li><li>de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+physiological+analysis+in+a+zebrafish+model+of+epilepsy.">Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837 (2021).</li><li>Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+external+medium+composition+on+membrane+water+permeability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos.">The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos.</a> Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).</li><li>Fredj, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+activity-dependent+competition+regulates+axon+arbor+maturation,+growth+arrest,+and+territory+in+the+retinotectal+projection.">Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection.</a> Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).</li><li>Alberio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-gated+potassium+channel+for+sustained+neuronal+inhibition.">A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition.</a> Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).</li><li>Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+genesis+requires+lakritz,+a+zebrafish+atonal+homolog.">Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog.</a> Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).</li><li>Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+activity-deprived+zebrafish+mutant+macho+reveals+an+essential+requirement+of+neuronal+activity+for+the+development+of+a+fine-grained+visuotopic+map.">Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).</li><li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astyanax+surface+and+cave+fish+morphs.">Astyanax surface and cave fish morphs.</a> EvoDevo. 11 (1), 14 (2020).</li><li>Sieger, D., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+studying+microglia:+The+first,+the+popular,+and+the+new.">Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new.</a> Glia. 61 (1), 3-9 (2013).</li><li>Svahn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ramified+microglia+from+early+macrophages+in+the+zebrafish+optic+tectum.">Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum.</a> Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).</li><li>Herzog, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+clearance+of+cellular+debris+by+microglia+limits+secondary+neuronal+cell+death+after+brain+injury+in+vivo.">Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo.</a> Development. 146 (9), (2019).</li><li>Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-imaging+of+astrocyte+morphogenesis+and+function+in+zebrafish+neural+circuits.">Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).</li></ol>

Bu makalede açıklanan teknikler, zebra balıklarında omurgalı görsel sistem gelişimini incelemek için birçok yaklaşımdan birini göstermektedir. Diğer araştırmacılar, embriyonik retinayı incelemek ve gen ekspresyon analizleri yapmak için yöntemler yayınladılar19 veya optik tektum30'daki nöronal aktiviteyi görselleştirdiler. Bu makale, diferansiyel retinal girdinin optik tektumdaki hücre davranışlarını nasıl etkileyebileceğini araştırmak için ...

Bu yöntemin amacı, retinal girdinin zebra balığı beynindeki görsel işlem merkezi olan optik tektumun büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini araştırmaktır. Bir gözün çıkarılması ve ardından optik tektumun iki tarafının karşılaştırılmasıyla, aynı numunedeki tektal değişiklikler gözlemlenebilir ve normalleştirilebilir, böylece birden fazla örnek arasında karşılaştırma yapılabilir. Bu teknikle birleştirilen modern moleküler yaklaşımlar, görsel sistem büyümesi ve gelişiminin altında yatan mekanizmaların yanı sıra aksonal dejenerasyon ve rejenerasyon hakkında fikir verecektir.
Duyusal sistemler - görsel, işitsel ve somatosensoriyel - dış organlardan bilgi toplar ve bu bilgiyi merkezi sinir sistemine iletir, orta beyindeki dış dünyanın "haritalarını" oluşturur 1,2. Görme, birçok balık da dahil olmak üzere neredeyse tüm omurgalılar için baskın duyusal modalitedir. Gözdeki nöral doku olan retina, öncelikle retinanın projeksiyon nöronları olan fotoreseptörler, bipolar hücreler ve retinal ganglion hücrelerinden (RGC'ler) oluşan nöronal bir devre ile bilgi toplar. RGC'ler, retinanın iç yüzeyinden optik sinir kafasına giden yolu bulan uzun aksonlara sahiptir, burada beyinde büyülenir ve birlikte hareket ederler, sonuçta dorsal orta beyindeki görsel işlem merkezinde sona ererler. Bu yapıya balıklarda ve diğer memeli olmayan omurgalılarda optik tektum denir ve memelilerdeki üstün kollikulusa homologdur3.
Optik tektum, dorsal orta beyinde bilateral simetrik çok katmanlı bir yapıdır. Zebra balıklarında ve diğer balıkların çoğunda, optik tektumun her bir lobu yalnızca kontralateral gözden görsel girdi alır, böylece sol optik sinir sağ tektal lobda sona erer ve sağ optik sinir sol tektallobda sona erer 4 (Şekil 1). Memeli meslektaşı olan üstün kollikulus gibi, optik tektum da görsel bilgiyi seçmeler ve somatosensation dahil olmak üzere diğer duyusal girdilerle bütünleştirir, görsel dikkatteki kaymaları ve sakkadlar 1,5,6 gibi göz hareketlerini kontrol eder. Bununla birlikte, memeli superior kollikulusundan farklı olarak, optik tektum, tektal proliferasyon bölgesi7 olarak adlandırılan tektal lobların medial ve kaudal kenarlarının yakınındaki özel bir kök hücre nişinden sürekli olarak yeni nöronlar ve glia üretir. Optik tektumda ve merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerinde proliferatif progenitörlerin bakımı, kısmen, zebra balığı8'de belgelenen olağanüstü rejeneratif kapasiteye katkıda bulunur.
Kör veya tek gözlü balıkların beyinlerini inceleyen önceki çalışmalar, optik tektum büyüklüğünün aldığı retinal innervasyon miktarıile doğru orantılı olduğunu ortaya koymuştur 9,10,11. Gözleri erken embriyogenezde dejenere olan yetişkin mağara balıklarında, optik tektum, yakından ilişkili, gören yüzey balıklarından belirgin şekilde daha küçüktür9. Mağara balık gözü dejenerasyonu, embriyogenez sırasında endojen lensin yüzey balığından bir mercekle değiştirilmesiyle engellenebilir. Bu tek gözlü mağara balıkları yetişkinliğe yetiştirildiğinde, innerve tektal lob, innerve edilmemiş tektal lobdan yaklaşık% 10 daha fazla hücre içerir9. Benzer şekilde, aynı birey içinde farklı boyutlarda gözler üretmek için kimyasal işlemlerle inkübe edilen larva killifish'te, tektumun daha fazla innervasyona sahip tarafı daha büyüktü ve daha fazla nöron içeriyordu10. Yetişkin akvaryum balıklarında optik sinir ezme deneylerinden elde edilen kanıtlar, innervasyonun proliferasyonu desteklediğini, innervasyon bozulduğunda tektal hücre proliferasyonunun azaldığını göstermektedir11.
Bu klasik çalışmaları doğrulayan ve genişleten birkaç yeni rapor, innervasyona yanıt olarak proliferasyonun, en azından kısmen, BDNF-TrkB yolu12,13 tarafından modüle edildiğini gösteren veriler sunmaktadır. Gelişmekte olan bir duyusal sistemin yaralanma ve akson dejenerasyonu ile nasıl başa çıktığı, hangi hücresel ve moleküler sinyallerin retina girişinin optik tektum büyümesini düzenlemesini sağladığı, bu mekanizmaların ne zaman aktif hale geldiği ve innervasyona bağlı proliferasyon ve farklılaşmanın retina ve hedef dokusunun büyüme oranlarını koordine etmesini ve doğru retinotopik haritalamayı sağlamasını sağlayıp sağlamadığı da dahil olmak üzere optik tektum büyümesi ve gelişimi hakkında birçok açık soru devam etmektedir. Ek olarak, zebra balığı görsel sistemini aşağıda tarif edilenler gibi cerrahi yaklaşımlarla sorgulayarak ele alınabilecek aktiviteye bağlı gelişim hakkında çok daha büyük sorular vardır.
Nöral aktivitenin, özellikle görsel girdiden, hücre sağkalımını ve proliferasyonunu değiştirdiği hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için, tarif edilen yaklaşım, bireysel zebra balığı larvaları içindeki innerve ve denervated tektal lobları (Şekil 1) doğrudan karşılaştırmaktadır. Bu yöntem, optik tektumdaki RGC akson dejenerasyonunun belgelenmesine ve mitotik hücrelerin sayısının innervasyon ile ilişkili olduğunun doğrulanmasına izin verir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63509/63509fig01.jpg"> Şekil 1: Zebra balığı larvalarının tek taraflı göz çıkarılmasından önce ve sonra çizikleri . (A) Diseksiyon mikroskobu altında görüldüğü gibi 5 dpf larvasının çizimi. Her larva, düşük erime noktalı agaroza gömülür ve gözü yukarı bakacak şekilde çıkarmak için keskin, kancalı bir ucu olan bir tungsten iğnesi kullanılmadan önce yanal olarak yönlendirilir (bu örnekte sol göz). (B) A'da tasvir edilen ameliyattan kaynaklanan 9 dpf larvanın dorsal görünümünün çizilmesi. Sağ gözden sadece üç yüksek şematize RGC aksonunun defasciculating olduğu ve sol tektal lobdaki nöronlarla bağlandığı gösterilmiştir. Kısaltmalar: dpf = döllenmeden sonraki günler; dps = ameliyat sonrası günler; RGC = retinal ganglion hücreleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63509/63509fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment and supplies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breeding boxes</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning high vacuum grease</td>
			<td>Sigma or equivalent supplier</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks (125 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>DWK Lifescience</td>
			<td>63A53 &#38; 63A53WT</td>
			<td>For pipetting embryos and larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides for microscopy</td>
			<td>VWR or equivalent supplier</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware including graduated bottles and graduated cylinders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making and storing solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-part epoxy resin</td>
			<td>ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent</td>
			<td>0.85 oz syringe</td>
			<td>https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.7 mL)</td>
			<td>VWR or equivalent supplier</td>
			<td>22234-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel plated pin holder (17 cm length)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>26018-17</td>
			<td>To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh tea strainer or equivalent</td>
			<td>Ali Express or equivalent</td>
			<td></td>
			<td>For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper clip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>Fischer Scientific or equivalent supplier</td>
			<td>50-190-0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mm</td>
			<td>Fischer Scientific or equivalent supplier</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette pump</td>
			<td>SP Bel-Art or equivalent</td>
			<td>F37898-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>909122</td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (variable voltage)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire (0.125 mm diameter)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>TGW0515</td>
			<td>Sharpen to remove eye and dissect larvae.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable temperature heat block</td>
			<td>The Lab Depot or equivalent supplier</td>
			<td>BSH1001 or BSH1002</td>
			<td>Set to 40-42 &#176;C ahead of experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wires with alligator clip leads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tungsten needle sharpening device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. 
			Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for surgeries and dissections:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Make 1% in embryo medium (E3) or Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374248</td>
			<td>For embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19210</td>
			<td>Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td>Dilute 1:100 in Marc&#39;s Modified Ringers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) tablets</td>
			<td>Diagnostic BioSystems</td>
			<td>DMR E404-01</td>
			<td>Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For Marc&#39;s Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>100G #TRS1</td>
			<td>Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for immunohistochemistry:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI or ToPro3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1306 or T3605</td>
			<td>Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>A component of immunoblock buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td>Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50-062Z</td>
			<td>A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody to detect phosphohistone H3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td>Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)</td>
			<td>MBL International</td>
			<td>PM005</td>
			<td>Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (PK)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308-10MG</td>
			<td>Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 &#181;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Fiji)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop or GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available from the&#160; Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

eye removal in living zebrafish larvae to examine innervation-dependent growth and development of the visual system

Zebra balığı, yaşam boyu olağanüstü büyüme ve rejeneratif yetenekler sergiler. Örneğin, embriyogenez sırasında kurulan özel kök hücre nişleri, hem gözde hem de beyinde tüm görsel sistemin sürekli büyümesini destekler. Retina ve optik tektum arasındaki koordineli büyüme, gözlere ve beyne yeni nöronlar eklendikçe doğru retinotopik haritalamayı sağlar. Retinal aksonların hayatta kalma, proliferasyon ve / veya farklılaşma gibi tektal kök ve progenitör hücre davranışlarını düzenlemek için önemli bilgiler sağlayıp sağlamadığını ele almak için, aynı hayvan içindeki ve hayvanlar arasındaki innerve ve denervated tektal lobları karşılaştırabilmek gerekir. 
Canlı larva zebra balığından bir gözün cerrahi olarak çıkarılması ve ardından optik tektumun gözlemlenmesi bu amaca ulaşır. Eşlik eden video, larvaların nasıl anestezi altına alınacağını, tungsten iğnelerinin elektrolitik olarak keskinleştirileceğini ve bir gözü çıkarmak için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Daha sonra beyinlerin sabit zebra balığı larvalarından nasıl disseke edileceğini gösterir. Son olarak, video immünohistokimya protokolüne genel bir bakış ve mikroskopi için düşük erime noktalı agarozda boyalı embriyoların nasıl monte edileceğine dair bir gösteri sunmaktadır.

Göz çıkarmanın tamamlanıp tamamlanmadığını doğrulamak ve optik tektumun nasıl değiştiğini değerlendirmek için, tüm RGC'leri membran hedefli bir RFP ile etiketleyen Tg [atoh7: RFP] suşunda ameliyatlar yapıldı ve böylece retinadan yansıyan ve optik sinir24'ü oluşturan tüm aksonlar yapıldı. Bu suşun kullanılması kesinlikle gerekli olmasa da, optik tektum nöropilindeki optik sinir termininin doğrudan gözlemlenmesini ve görselleştirilmesini sağlar. Lipofilik...

Watch this Scientific Journal Video about Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System at JoVE.com

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Makale, retinal girdinin optik tektum büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini araştırmaya yönelik ilk adım olarak canlı zebra balığı larvalarından gözlerin cerrahi olarak nasıl çıkarılacağını açıklamaktadır. Ek olarak, makale larva anesteziizasyonu, fiksasyon ve beyin diseksiyonu, ardından immünohistokimya ve konfokal görüntüleme hakkında bilgi vermektedir.

Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Bu yüzden laboratuvarım göz ve beynin birlikte nasıl büyüdüğünü anlamakla ilgileniyor. Bu teknik, retinal girdinin beyin büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini incelememizi sağlar. Bir gözün canlı larva zebra balığından cerrahi olarak çıkarılması, ardından optik tektumun gözlemlenmesi, aynı hayvan içindeki ve hayvanlar arasındaki innerve ve denervated tektal lobları karşılaştırmamızı sağlar.Bu tekniği modern moleküler yaklaşımlarla birleştirmek, nöral gelişim, rejenerasyon ve dejenerasyonun altında yatan mekanizmalar hakkında yeni bilgiler verebilir. Başlamak için, katot ve anot tellerini güç kaynağına bağlayın. Katot telinin ucundaki timsah klipsini kısmen düzleştirilmiş bir ataşa takın ve ataşı kavanozun yanına takarak potasyum hidroksit çözeltisine yerleştirin.Anot telinin timsah klipsini iğne tutucunun boynuna takın. Gücü yaklaşık 20 volta çevirin ve tungsten telini potasyum hidroksit çözeltisine batırın, teli elektrolitik olarak ince bir uca keskinleştirmek için teli çözeltiden bir açıyla çekin. Yeterince keskin olduğundan emin olmak için iğnenin ucunu diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin.Eğri iğne ucu, keskin iğne Petri kabına hafifçe dokunularak büküldüğünde ortaya çıkar. Ameliyat gününde, 10 ila 15 larvayı taze E3 ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarmak için geniş delikli bir cam mera pipeti kullanın. Larvaya üç ila beş damla anestezik ekleyin. Larvaların yeterince uyuşturulup uyuşturulmadığını belirlemek için, dokunma yanıtı eksikliğini arayın.Larvalar üç dakika sonra dokunmaya hala duyarlıysa iki ila üç damla daha anestezik ekleyin ve yeniden değerlendirin. Larvaları ameliyat için hareketsiz hale getirmek için, bir larvayı sadece az miktarda E3 içeren dar delikli bir cam mera pipetine alın. Daha sonra, larvayı içeren pipete yaklaşık 200 mikrolitre erimiş% 1 düşük erime noktası veya LMP agarozu alın ve larvaların LMP agarozunda asılı kalmasını sağlamak için karıştırın. 35 milimetrelik bir Petri kabının kapağını disseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin, ardından larva ve agarozu baş aşağı Petri kabı kapağına fışkırtın.Agarozu larva damlanın merkezinde olacak şekilde yayın. Donuk bir tungsten iğnesi kullanarak, larvaları hızlı ama nazikçe manevra yapın, böylece bir gözü yukarı bakacak şekilde yanal olur. Agarozun ayarlanması için birkaç dakika bekleyin.Göz yörüngesinin kenarını takiben, göz çevresindeki cildi delmek için ince elektrolitik olarak keskinleştirilmiş bir tungsten iğnesinin ucunu kullanın. Daha sonra iğnenin kenarını gözün altından gözün zamansal-ventral tarafından kaydırın. Gözü soketten çıkarmak için kontrollü basınç kullanın.Gözü iğnenin yan tarafıyla dorsal ve ön olarak bastırmaya devam edin, sonunda optik sinirden dilimleyin ve gözü serbest bırakın. Alternatif olarak, optik siniri sıkıştırarak ve gözü medialden laterale iterek gözü çıkarmak için çok ince cerrahi forseps kullanabilirsiniz. Başarılı bir göz çıkarılmasından sonra, agarozu MMR çözeltisi ile örtün, Petri kabı kapağını forsepslerle stabilize ederken, başlarının etrafına ve daha sonra vücutlarının etrafına bir tungsten iğnesini hafifçe fırçalayarak her larvayı agarozdan serbest bırakın.Ameliyatlardan sonra, larvaları ertesi güne kadar antibiyotiklerle desteklenmiş MMR çözeltisine yerleştirin, ardından larvaları E3'e geri döndürün ve deneyin son noktasına kadar geri getirin. Larvalar ölümcül anestezi uygulandıktan sonra,% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. PBS damlacıklarındaki sabit larvaları, diseksiyon mikroskobu altında bir sızdırmazlık plakası üzerinde askıya alın.İki tungsten pimi notokorddan geçirerek, bir pim arka tarafını AGM bölgesini kaplayan pigmentli alana ve diğeri yumurta sarısı uzantısının sonuna uygun olarak yerleştirerek yanal olarak sabitleyin. Gözü keskin bir tungsten iğne ve ince forseps ile çıkarın. Bazen iğneyi çene içinden karşı tarafa sokmak ve diğer gözü çıkarmak mümkündür.Zamansaldan kulağın ventral tarafına çizmek için tungsten iğnesini kullanın. Hareket halindeki aynı eylemde, iğneyi arka tarafa çeneye getirin ve kulak ve çene çıkarılana kadar yavaşça önden çekin. İğneyi çeneden geçirerek diğer gözü ve kulağı çıkarın.Ventral organları ve kalan yumurta sarısını çıkarmak için forseps kullanın. Son olarak, arka beyin ve omurilik arasındaki kavşağın yakınındaki dorsal kraniyal deride sığ bir kesi yapın. Cildi forseps ile kaldırın ve önden ve telensefalonun etrafına çekin.Forseps ile kalan dokuları çıkarın. Larvaları çıkarın ve PBS'ye 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Odacıklı bir sürgüyü vakum gresi ile 100 milimetrelik Petri kabının kapağına sabitleyin.İmmün boyalı ve işlenmiş larvaları, diseksiyon mikroskobu ile görüntülemek için bir kuyu plakasına veya depresyon slaytına aktarın. Larvaları odacıklı slayta% 1 LMP agaroz sütunlarına monte edin. Pipetinizin yanından geçen bir bardak kullanarak, odacıklı slayda bir larva koyun ve mümkün olduğunca az PBS biriktirin.Larvaları aynı pipeti kullanarak erimiş ve sıcak% 1 LMP agarozu ile örtün. LMP'yi pipet bir sütuna agaroz eder ve ardından larvayı dorsal yüzey görünür olacak şekilde mümkün olduğunca simetrik olarak konumlandırır. Göz çıkarılmasından sonra optik tektum nöropilinde retinal aksonların progresif dejenerasyonu gözlendi.Ameliyattan iki gün sonra, RFP etiketli aksonlar, blabbing ve parçalanma gibi hızlı Wallerian dejenerasyonunun özelliklerini sergiledi. RFP pozitif punkta, oklarla gösterildiği gibi tektumun sağ tarafındaki nöropilin hem içinde hem de dışında kaydedildi. Ameliyattan dört gün sonra, parçalanmış aksonlar ve RFP etiketli aksonal enkaz, sağ tektal lobda önemli ölçüde azaldı, bu da ölmekte olan ve dejenere olan aksonların nispeten hızlı bir şekilde temizlendiğini gösterdi.Beyin, gözleri, çeneyi, kulakları ve cildin ve bağ dokularının kafatası kapağını parçalara ayırarak açığa çıkarıldı. İdeal olarak, beyin bu prosedür sırasında bozulmadan kalır. Bununla birlikte, ön beynin parçaları, özellikle koku alma ampulü, cildin veya çenenin kafatası kapağı çıkarıldığında muhtemelen hasar görmüş veya tamamen çıkarılmıştır.Dahası, bazen tektumun yanal çıkıntısı, beyni çıkarmak için cildi delerken veya sıkıştırırken dilimlenir. Hiçbir örnek aynı değildir. Bu nedenle, gerektiğinde göz çıkarma ve beyin diseksiyonu yoluyla ince adaptasyonlar yapabilmeniz gerekir.Hastalar ve keskin aletler başarı için şarttır. Bu teknik, optik tektum büyümesi ve gelişiminin moleküler ve hücresel mekanizmaları hakkında yeni bilgiler edinmek için in vivo canlı hücre görüntüleme veya RNA dizilimi gibi hücresel ve moleküler yaklaşımlarla takip edilebilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Kurbağa ve Zebra balığı Embriyolarında Hipoksinin İndüklenmesi

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...