Name: isolation of mouse primary microglia by magnetic-activated cell sorting in animal models of demyelination
Uploaded: 2022-04-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination at JoVE.com

Undersøgelsen blev støttet af Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06).

Alle dyreforsøg er blevet godkendt af Institute of Animal Care Committee of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Kina.
1. Materialer
<ol><li>Forbered følgende løsninger, inden du begynder protokollen.<ol>
<li>Forbered belastningsbufferen ved at tilsætte føtalt kvægserum (FBS, 2%) til fosfatbufret saltvand (PBS).</li>
		<li>Tilsæt neutralt rødt (NR) farvestof (sidste 1%) til PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered følgende løsninger ve...

<ol>
	<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages.">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain.">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li><li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer+V+cortical+neurons+require+microglial+support+for+survival+during+postnatal+development.">Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).</li><li>Cunningham, C. L., Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+regulate+the+number+of+neural+precursor+cells+in+the+developing+cerebral+cortex.">Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).</li><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration.">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li><li>Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+microglial+subset+in+development,+aging,+and+disease:+Lessons+from+transcriptomic+studies.">Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).</li><li>Y&#305;ld&#305;zhan, K., Naz&#305;ro&#287;lu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+its+role+in+neurodegenerative+diseases.">Microglia and its role in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).</li><li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/brain+macrophages+as+central+drivers+of+brain+tumor+pathobiology.">Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+the+brain:+Complementary+partners+in+development+and+disease.">Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).</li><li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+dynamics+during+human+brain+development.">Microglial dynamics during human brain development.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).</li><li>Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era.">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li><li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+microglia:+isolation,+culturing,+and+selected+applications.">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2010).</li><li>Yildizhan, K., Naziroglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+depletion+and+parkinsonian+neurotoxin+MPP(+)-induced+TRPM2+channel+activation+play+central+roles+in+oxidative+cytotoxicity+and+inflammation+in+microglia.">Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia.</a> Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+microglia.">Isolation and culture of microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia.">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li><li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain.">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).</li><li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye.">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li><li>Sahel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+synaptic+connectivity+of+oligodendrocyte+precursor+cells+following+demyelination.">Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).</li><li>Schroeter, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+brain-all+cells:+A+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+CNS-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice.">One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 651 (2021).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing.">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).</li><li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+sequencing+reveals+glial+specific+responses+to+tissue+processing+&amp;+enzymatic+dissociation+in+mice+and+humans.">Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing &amp; enzymatic dissociation in mice and humans.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+applications+of+magnetic+cell+sorting+to+analyze+cell-type+specific+gene+and+protein+expression+in+the+central+nervous+system.">Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system.</a> PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+analysis+reveals+quiescent+microglia+isolation+methods+from+postnatal+mouse+brains+and+limitations+of+BV2+cells.">RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).</li></ol>

Protokollen foreslår en metode til at isolere microglia omkring demyeliniserende læsioner, som kan hjælpe med at studere de funktionelle egenskaber ved microglia i inflammatoriske demyeliniserende sygdomme. Microglia fanget ved hjælp af CD11b perler udviser høj renhed og levedygtighed. Kritiske trin i protokollen inkluderer præcis lokalisering af foci og optimal mikroglial oprensning. I protokoltrin 2.1 er det nødvendigt at injicere NR-opløsningen 2 timer, før musen ofres for at sikre, at læsionerne kan vises n...

Microglia stammer fra æggeblomme-sac forfædre, som når den embryonale hjerne meget tidligt og deltager i udviklingen af CNS 1,2. For eksempel er de involveret i synaptisk beskæring3 og regulering af aksonal vækst4. De udskiller faktorer, der fremmer neuronal overlevelse og hjælper neuronal lokalisering5. Samtidig er de involveret i at fjerne unormale celler og apoptotiske celler for at sikre normal hjerneudvikling6. Derudover overvåger mikroglia som de immunkompetente celler i hjernen kontinuerligt hjernens parenkym for at rydde døde celler, dysfunktionelle synapser og cellulært affald7. Det er blevet påvist, at mikroglial aktivering spiller en vigtig rolle i en række sygdomme, herunder inflammatoriske demyeliniserende sygdomme, neurodegenerative sygdomme og hjernetumorer. Aktiveret mikroglia i multipel sklerose (MS) bidrager til differentieringen af oligodendrocytprækursorceller (OPC'er) og regenerering af myelin ved at opsluge myelinaffald8.
I Alzheimers sygdom (AD) aktiverer akkumulering af amyloid beta (Aβ) microglia, som påvirker de fagocytiske og inflammatoriske funktioner i microglia9. Aktiveret mikroglia i gliomvævet, kaldet gliom-associeret microglia (GAM), kan regulere udviklingen af gliom og i sidste ende påvirke prognosen hos patienter10. Aktiveringen ændrer dybt det mikrogliale transkriptom, hvilket resulterer i morfologiske ændringer, ekspression af immunreceptorer, øget fagocytisk aktivitet og forbedret cytokinsekretion11. Der er forskellige undergrupper af aktiveret mikroglia i neurodegenerative sygdomme såsom sygdomsrescieret microglia (DAM), aktiveret respons microglia (ARM) og mikroglial neurodegenerativ fænotype (MGnD)8.
Tilsvarende eksisterer flere dynamiske funktionelle undergrupper af microglia også sammen i hjernen i inflammatoriske demyeliniserende sygdomme12. Forståelse af heterogeniteten mellem forskellige undergrupper af microglia er afgørende for at undersøge patogenesen af inflammatoriske demyeliniserende sygdomme og for at finde deres potentielle terapeutiske strategier. Heterogeniteten af microglia afhænger hovedsageligt af den molekylære specificitet8. Det er vigtigt at beskrive de molekylære ændringer af microglia nøjagtigt til undersøgelsen af heterogeniteten. Fremskridt inden for enkeltcellet RNA-sekventeringsteknologi (RNA-seq) har gjort det muligt at identificere de molekylære egenskaber ved aktiveret mikroglia under patologiske tilstande13. Derfor er evnen til at isolere cellepopulationer afgørende for yderligere undersøgelse af disse målceller under specifikke forhold.
Undersøgelser udført for at forstå mikroglias egenskaber og funktioner er normalt in vitro-undersøgelser, da det har vist sig, at et stort antal primære mikroglia kan fremstilles og dyrkes fra museungehjerner (1-3 dage gamle), som fastgøres til kulturkolberne og vokser på plastoverfladen med andre blandede gliaceller. Derefter kan ren mikroglia isoleres baseret på den forskellige klæbeevne af blandede gliaceller14,15. Denne metode kan dog kun isolere mikroglia fra den perinatale hjerne og tager flere uger. Potentielle variabler i cellekultur kan påvirke mikrogliale egenskaber såsom molekylær ekspression16. Desuden kan mikroglia isoleret ved disse metoder kun deltage i in vitro-forsøg ved at simulere betingelserne for CNS-sygdomme og kan ikke repræsentere mikroglias egenskaber og funktioner in vivo-sygdomstilstande. Derfor er det nødvendigt at udvikle metoder til isolering af mikroglia fra den voksne musehjerne.
Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og magnetisk adskillelse er to meget anvendte metoder, selvom de har deres egne forskellige begrænsninger 16,17,18,19. Deres respektive fordele og ulemper vil blive kontrasteret i diskussionsafsnittet. Modningen af MACS-teknologien giver mulighed for hurtigt at rense celler. Huang et al. har udviklet en bekvem metode til at mærke demyeliniserende læsioner i hjerner20. Ved at kombinere disse to tekniske tilgange foreslår vi en hurtig og effektiv søjleformet CD11b magnetisk separationsprotokol, der giver en trinvis beskrivelse for at isolere mikroglia omkring demyeliniserende læsioner i voksne musehjerner og bevare mikroglias molekylære egenskaber. De fokale demyeliniserende læsioner var forårsaget af stereotaktisk injektion af 2 μL lysolecithinopløsning (1% LPC i 0,9% NaCl) i corpus callosum 3 dage før start af protokollen21. Denne protokol lægger grundlaget for at udføre det næste trin i in vitro-eksperimenter. Desuden sparer denne protokol tid og forbliver mulig til udbredt anvendelse i forskellige eksperimenter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT001015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>SJA Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) Beads, human and mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>BOSTER</td>
			<td>PYG0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1013690025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoCyte Flow Cytometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>A system consisting of various parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoExpress</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1.4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>BOSTER</td>
			<td>PYG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>MshOt</td>
			<td>MZ62</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse primary microglia by magnetic-activated cell sorting in animal models of demyelination

Microglia, de bosiddende medfødte immunceller i hjernen, er de primære respondere på betændelse eller skade i centralnervesystemet (CNS). Microglia kan opdeles i hviletilstand og aktiveret tilstand og kan hurtigt ændre tilstand som reaktion på hjernens mikromiljø. Microglia vil blive aktiveret under forskellige patologiske tilstande og udvise forskellige fænotyper. Derudover er der mange forskellige undergrupper af aktiveret mikroglia og stor heterogenitet mellem forskellige undergrupper. Heterogeniteten afhænger hovedsageligt af mikroglias molekylære specificitet. Undersøgelser har afsløret, at microglia vil blive aktiveret og spille en vigtig rolle i den patologiske proces med inflammatorisk demyelination. For bedre at forstå mikroglias egenskaber ved inflammatoriske demyeliniserende sygdomme som multipel sklerose og neuromyelitis optica spektrumforstyrrelse foreslår vi en perilesionel primær mikroglial sorteringsprotokol. Denne protokol anvender søjleformet magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) til at opnå stærkt oprenset primær mikroglia og bevare de molekylære egenskaber ved microglia for at undersøge de potentielle virkninger af microglia i inflammatoriske demyeliniserende sygdomme.

Microglia isoleret ved hjælp af CD11b perler har høj renhed Mikrogliale celler omkring læsionerne i demyelinationsmusemodeller blev isoleret ved hjælp af ovennævnte protokol og testet ved flowcytometri. Celler er fluorescerende mærket med CD11b-fluorescein isothiocyanat (FITC) og CD45-allophycocyanin (APC) for at bestemme mikroglia i flowcytometri i henhold til producentens anvisninger. Der er flere litteraturer, der viser, at CD11b- og CD45-antistoffer er nok til at kontrollere renheden af isol...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination at JoVE.com

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Her præsenterer vi en protokol til at isolere og rense primær mikroglia i dyremodeller af demyeliniserende sygdomme ved hjælp af søjleformet magnetisk aktiveret cellesortering.

Isolering af musens primære mikroglia ved magnetisk aktiveret cellesortering i dyremodeller af demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Denne protokol hjælper med at isolere microglia fra de mikrodissekterede demyelinationslæsioner i den voksne musehjerne for at studere de mikrogliale egenskaber in vivo. Denne teknik sparer tid og har lavere krav til både eksperimenter og udstyr. Denne metode hjælper med at isolere mikroglia fra dyrets hjerne, især de mikrodissekerede væv i forskellige sygdomstilstande.Begynd med at mikrodissektere læsionerne mærket med neutralt farvestof omkring corpus callosum under et stereomikroskop. Centrifugering af det dissekerede væv ved 300 gange g i 30 sekunder for at opsamle prøven i bunden af røret. Forvarm enzym bland en og enzym bland to til 37 grader Celsius i en inkubator.Derefter tilsættes 1.950 mikroliter forvarmet enzym bland en til en prøve, og fordøjes i en inkubator ved 37 grader Celsius i fem minutter. Tilsæt 30 mikroliter forvarmet enzym bland to, og bland forsigtigt. Efter fordøjelsen tilsættes fire milliliter kold PBS til røret og rystes forsigtigt.Centrifugering af vævsprøverne ved 300 gange g i 10 minutter ved fire grader Celsius, og aspirer supernatanten langsomt og fuldstændigt. Resuspend cellepillen forsigtigt med 1.550 mikroliter kold PBS. Tilsæt 450 mikroliter af den kolde opløsning til fjernelse af snavs, og bland dem godt.Brug en pipette på 1.000 mikroliter til at overlejre blandingen meget langsomt og forsigtigt med to milliliter kold PBS. Centrifuger blandingen, og kig derefter efter de tre lag. Brug en pipette på 1.000 mikroliter til fuldstændigt at aspirere de to øverste lag, og fyld røret op til fem milliliter med koldbelastningsbuffer.Vend forsigtigt røret tre gange. Derefter, efter centrifugering og aspiration af supernatanten, skal du genanvende cellepillen med 90 mikroliter belastningsbuffer og tilsætte 10 mikroliter CD11b-perler. Bland godt, og inkuber i 15 minutter ved fire grader Celsius.Efter inkubationen tilsættes en milliliter af belastningsbufferen og vaskes cellerne ved forsigtigt at pipettere væsken op og ned med en 1.000 mikroliter pipette. Centrifuger cellerne ved 300 gange g i 10 minutter ved fire grader Celsius, og aspirer supernatanten helt for at fjerne de ubundne perler. Resuspend cellerne i 500 mikroliter af belastningsbufferen, og placer MS-kolonnen med dens separator for positiv selektion i magnetfeltet.Skyl søjlen med 500 mikroliter belastningsbufferen for at beskytte cellerne og sikre effektiviteten af magnetisk sortering baseret på producentens protokol. Påfør cellesuspensionen på MS-kolonnen, og kassér gennemstrømningen, der indeholder de umærkede celler. Tilsæt 500 mikroliter af indlæsningsbufferen for at vaske søjlen, og fjern den fra separatoren.Anbring søjlen på et 15 ml centrifugerør, og tilsæt en milliliter af belastningsbufferen i kolonnen. Til sidst skal du skubbe stemplet til bunden af søjlen for at skylle de magnetisk mærkede celler ud. En skematisk repræsentation af gating-strategien, der anvendes i flowcytometrianalyse af mikroglia isoleret fra demyelinationslæsioner hos voksne mus før og efter den magnetisk aktiverede cellesortering, er vist her.De grafiske billeder repræsenterer den fremadrettede scatterhøjde og sidespredningshøjden til valg af celler, fremadspredningsområde og fremadrettet scatterhøjde til valg af enkeltceller og CD11b-FITC og CD45-APC til valg af myeloide celler og microglia. Andelen af microglia er steget markant efter den magnetisk aktiverede cellesortering. Det grafiske billede repræsenterer den gating-strategi, der anvendes i flowcytometrianalyse for levende og døde enkeltceller efter den magnetisk aktiverede cellesortering.Her er 7-aminoactinomycin D og sidespredningshøjde blevet brugt til at vælge de levende celler. Mens du forsøger denne procedure, skal du huske at mikrodissektere de demyeliniserende læsioner under et stereomikroskop baseret på de neutrale røde markeringer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Olfaktoriske Analyser for musemodeller for neurodegenerativ sygdom

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Hurtig og Raffineret CD11b Magnetisk Isolering af Primary Mikroglia med Enhanced Renhed og Alsidighed

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering og Isolation af musen primære mikroglia ved tæthed Gradient centrifugering

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Hurtig og specifik Immunomagnetic Isolation af musen primære Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Celle-baserede analyse at studere antistof-medieret Tau Clearance af mikroglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Primær cellekultur af renset GABAergic eller Glutamatergic neuroner etableret gennem fluorescens-aktiveret celle sortering

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolering af region-specifikke mikroglia fra en voksen mus hjerne halvkugle for dyb single-celle RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...