Name: isolation of mouse primary microglia by magnetic-activated cell sorting in animal models of demyelination
Uploaded: 2022-04-05T14:00:00
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この研究は、同済病院(HUST)優秀若手科学者財団(助成金番号2020YQ06)の支援を受けた。

すべての動物の手順は、同済医科大学の動物ケア委員会研究所、華中科技大学、中国によって承認されています。
1. 素材
<ol><li>プロトコルを開始する前に、次の解決策を準備します。<ol>
<li>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にウシ胎児血清(FBS、2%)を加えてローディングバッファーを調製する。</li>
		<li>ニュートラルレッド(NR)色素(最終1%)をPBSに加える。</li>
	</ol>
<...

<ol>
	<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages.">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain.">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li><li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer+V+cortical+neurons+require+microglial+support+for+survival+during+postnatal+development.">Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).</li><li>Cunningham, C. L., Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+regulate+the+number+of+neural+precursor+cells+in+the+developing+cerebral+cortex.">Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).</li><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration.">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li><li>Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+microglial+subset+in+development,+aging,+and+disease:+Lessons+from+transcriptomic+studies.">Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).</li><li>Y&#305;ld&#305;zhan, K., Naz&#305;ro&#287;lu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+its+role+in+neurodegenerative+diseases.">Microglia and its role in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).</li><li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/brain+macrophages+as+central+drivers+of+brain+tumor+pathobiology.">Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+the+brain:+Complementary+partners+in+development+and+disease.">Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).</li><li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+dynamics+during+human+brain+development.">Microglial dynamics during human brain development.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).</li><li>Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era.">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li><li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+microglia:+isolation,+culturing,+and+selected+applications.">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2010).</li><li>Yildizhan, K., Naziroglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+depletion+and+parkinsonian+neurotoxin+MPP(+)-induced+TRPM2+channel+activation+play+central+roles+in+oxidative+cytotoxicity+and+inflammation+in+microglia.">Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia.</a> Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+microglia.">Isolation and culture of microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia.">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li><li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain.">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).</li><li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye.">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li><li>Sahel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+synaptic+connectivity+of+oligodendrocyte+precursor+cells+following+demyelination.">Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).</li><li>Schroeter, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+brain-all+cells:+A+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+CNS-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice.">One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 651 (2021).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing.">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).</li><li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+sequencing+reveals+glial+specific+responses+to+tissue+processing+&amp;+enzymatic+dissociation+in+mice+and+humans.">Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing &amp; enzymatic dissociation in mice and humans.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+applications+of+magnetic+cell+sorting+to+analyze+cell-type+specific+gene+and+protein+expression+in+the+central+nervous+system.">Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system.</a> PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+analysis+reveals+quiescent+microglia+isolation+methods+from+postnatal+mouse+brains+and+limitations+of+BV2+cells.">RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).</li></ol>

このプロトコルは、脱髄病変の周囲のミクログリアを単離する方法を提案しており、これは炎症性脱髄疾患におけるミクログリアの機能的特徴の研究に役立つ可能性がある。CD11bビーズを用いて捕捉されたミクログリアは、高純度および生存率を示す。プロトコルの重要なステップには、病巣の正確な局在化と最適なミクログリア精製が含まれます。プロトコルステップ2.1では、病変を正確?...

ミクログリアは卵黄 - 嚢前駆細胞に由来し、非常に早期に胚性脳に到達し、CNS 1,2の発達に関与する。例えば、彼らはシナプス剪定3と軸索成長4の調節に関与しています。それらはニューロンの生存を促進し、ニューロンの局在化を助ける因子を分泌する5。同時に、異常な細胞やアポトーシス細胞の除去に関与し、正常な脳の発達を確保しています6。さらに、脳の免疫コンピテント細胞として、ミクログリアは脳実質を継続的に監視し、死細胞、機能不全シナプス、および細胞破片を除去する7。ミクログリアの活性化は、炎症性脱髄疾患、神経変性疾患、脳腫瘍など、さまざまな疾患において重要な役割を果たしていることが実証されています。多発性硬化症(MS)における活性化ミクログリアは、希突起膠細胞前駆細胞(OPC)の分化およびミエリン破片8を包み込むことによってミエリンの再生に寄与する。
アルツハイマー病(AD)では、アミロイドベータ(Aβ)の蓄積がミクログリアを活性化し、ミクログリアの貪食および炎症機能に影響を及ぼす9。グリオーマ関連ミクログリア(GAM)と呼ばれるグリオーマ組織中の活性化ミクログリアは、グリオーマの進行を調節し、最終的に患者の予後に影響を与える可能性がある10。この活性化はミクログリアトランスクリプトームを深く変化させ、形態学的変化、免疫受容体の発現、貪食活性の増加、およびサイトカイン分泌の増強をもたらす11。疾患関連ミクログリア(DAM)、活性化応答ミクログリア(ARM)、およびミクログリア神経変性表現型(MGnD)などの神経変性疾患における活性化ミクログリアの異なるサブセットが存在する8。
同様に、ミクログリアの複数の動的機能サブセットも、炎症性脱髄疾患12において脳内に共存する。ミクログリアの異なるサブセット間の不均一性を理解することは、炎症性脱髄疾患の病因を調査し、それらの潜在的な治療戦略を見つけるために不可欠である。ミクログリアの不均一性は、主に分子特異性8に依存する。ミクログリアの分子変化を正確に記述することは、不均一性の研究に不可欠である。単一細胞RNAシーケンシング(RNA-seq)技術の進歩により、病理学的状態における活性化ミクログリアの分子特性の同定が可能になった13。したがって、細胞集団を単離する能力は、特定の条件下でこれらの標的細胞をさらに調査するために重要である。
ミクログリアの特徴と機能を理解するために行われる研究は、培養フラスコに付着し、他の混合グリア細胞と共にプラスチック表面上で増殖するマウスの子犬脳(1〜3日齢)から多数の初代ミクログリアを調製および培養できることが見出されているので、通常 、インビトロ 研究である。続いて、純粋なミクログリアは、混合グリア細胞14、15の異なる接着性に基づいて単離され得る。しかし、この方法は周産期脳からミクログリアを単離することしかできず、数週間かかる。細胞培養における潜在的な変数は、分子発現16などのミクログリア特性に影響を与え得る。さらに、これらの方法で単離されたミクログリアは、CNS疾患の状態をシミュレートすることによってのみ インビトロ 実験に参加することができ、 in vivo 疾患状態におけるミクログリアの特徴および機能を表すことができない。したがって、成体マウスの脳からミクログリアを単離する方法を開発する必要がある。
蛍光活性化細胞選別(FACS)と磁気分離は、広く使用されている2つの方法ですが、それぞれ異なる制限があります16,17,18,19。それぞれの長所と短所は、議論のセクションで対比されます。MACS技術の成熟は、細胞を迅速に精製する可能性を提供する。Huangらは、脳内の脱髄病変を標識する便利な方法を開発した20。これら2つの技術的アプローチを組み合わせることで、我々は迅速かつ効率的な柱状CD11b磁気分離プロトコルを提案し、成体マウス脳の脱髄病変の周りのミクログリアを単離し、ミクログリアの分子特性を保存するための段階的な説明を提供する。局所脱髄病変は、プロトコル21を開始する3日前に脳梁に2μLのリゾレシチン溶液(0.9%NaCl中の1%LPC)を定位注射することによって引き起こされた。このプロトコルは、インビトロ実験で次のステップを実行するための基礎を築きます。さらに、このプロトコルは時間を節約し、さまざまな実験で広く使用するために実現可能です。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT001015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>SJA Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) Beads, human and mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>BOSTER</td>
			<td>PYG0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1013690025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoCyte Flow Cytometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>A system consisting of various parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoExpress</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1.4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>BOSTER</td>
			<td>PYG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>MshOt</td>
			<td>MZ62</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse primary microglia by magnetic-activated cell sorting in animal models of demyelination

ミクログリアは、脳内の常在する自然免疫細胞であり、中枢神経系(CNS)の炎症または傷害に対する主要な応答因子である。ミクログリアは安静状態と活性化状態に分けることができ、脳の微小環境に応じて急速に状態を変化させることができる。ミクログリアは、異なる病理学的条件下で活性化され、異なる表現型を示す。さらに、活性化ミクログリアの多くの異なるサブグループおよび異なるサブグループ間の大きな不均一性が存在する。不均一性は、主にミクログリアの分子特異性に依存する。研究は、ミクログリアが活性化され、炎症性脱髄の病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことを明らかにした。多発性硬化症や神経脊髄炎視神経スペクトラム障害などの炎症性脱髄疾患におけるミクログリアの特徴をよりよく理解するために、我々は病変周囲一次ミクログリア選別プロトコルを提案する。このプロトコルは、柱状磁気活性化細胞選別(MACS)を利用して高度に精製された原発性ミクログリアを取得し、ミクログリアの分子特性を保存して、炎症性脱髄疾患におけるミクログリアの潜在的な影響を調査する。

CD11bビーズを用いて単離されたミクログリアは高純度である 脱髄マウスモデルにおける病変の周囲のミクログリア細胞を、上述のプロトコールを用いて単離し、フローサイトメトリーによって試験した。細胞をCD11b-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)およびCD45-アロフィコシアニン(APC)で蛍光標識し、製造業者の指示に従ってフローサイトメトリーでミクログリアを決定す?...

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Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

ここでは、柱状磁気活性化細胞選別を利用して、脱髄疾患の動物モデルにおける原発性ミクログリアを単離および精製するためのプロトコルを提示する。

脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

このプロトコールは、成体マウス脳の微小解剖脱髄病変からミクログリアを単離し、インビボでのミクログリア特性を研究するのに役立つ。この技術は時間を節約し、実験者と機器の両方にとってより低い要件を持っています。この方法は、動物の脳、特に様々な疾患状態の微小解剖組織からミクログリアを単離するのに役立つ。まず、脳梁の周囲の中性色素によって標識された病変を実体顕微鏡下で微小解剖することから始める。解剖した組織を300倍gで30秒間遠心分離し、チューブの底部でサンプルを回収した。インキュベーター内で酵素ミックス1つと酵素ミックス2つを摂氏37度に予熱します。次いで、1,950マイクロリットルの予熱酵素を加え、1対1のサンプルを混合し、摂氏37度のインキュベーターで5分間消化する。予熱した酵素ミックス2種を30マイクロリットル加え、穏やかに混合する。消化後、4ミリリットルの冷たいPBSをチューブに加え、静かに振る。組織サンプルを300倍gで4°Cで10分間遠心分離し、上清をゆっくりと完全に吸引する。細胞ペレットを1,550マイクロリットルの冷たいPBSで穏やかに再懸濁する。破片除去のために450マイクロリットルの冷たい溶液を加え、それらをよく混ぜる。1,000マイクロリットルのピペットを使用して、混合物を非常にゆっくりと、そして2ミリリットルの冷たいPBSで穏やかに重ねます。混合物を遠心分離し、3つの層を探す。1,000マイクロリットルのピペットを使用して最上層2本を完全に吸引し、チューブを最大5ミリリットルのコールドローディングバッファーで満たします。チューブを3回静かに反転させます。次に、遠心分離および上清の吸引後、細胞ペレットを90マイクロリットルのローディングバッファーで再懸濁し、10マイクロリットルのCD11bビーズを加える。よく混ぜ、摂氏4度で15分間インキュベートします。インキュベーション後、1ミリリットルのローディングバッファーを加え、1,000マイクロリットルのピペットで液体を上下に穏やかにピペッティングして細胞を洗浄します。細胞を摂氏4度で10分間、300倍gで遠心分離し、上清を完全に吸引して未結合ビーズを除去した。細胞を500マイクロリットルのローディングバッファーに再懸濁し、MSカラムとその分離器を磁場中に正の選択のために置きます。カラムを 500 マイクロリットルのローディングバッファーですすぎ、細胞を保護し、メーカーのプロトコルに基づく磁気選別効率を確保します。細胞懸濁液をMSカラムに塗布し、非標識細胞を含むフロースルーを破棄する。500マイクロリットルのローディングバッファーを加えてカラムを洗浄し、分離器から取り出します。カラムを 15 ミリリットルの遠沈管に置き、1 ミリリットルのローディングバッファーをカラムに加えます。最後に、プランジャーをカラムの底部に押し込んで、磁気標識された細胞を洗い流します。磁気活性化細胞選別の前後の成体マウスの脱髄病変から単離されたミクログリアのフローサイトメトリー分析において使用されるゲーティング戦略の概略図がここに示されている。グラフィカル画像は、細胞を選択するための前方散乱高さおよび側方散乱高さ、単一細胞を選択するための前方散乱面積および前方散乱高さ、ならびに骨髄系細胞およびミクログリアを選択するためのCD11b−FITCおよびCD45−APCを表す。ミクログリアの割合は、磁気活性化細胞選別後に有意に増加した。グラフィカルな画像は、磁気活性化細胞選別後の生細胞および死細胞のフローサイトメトリー分析で使用されるゲーティング戦略を表しています。ここで、7-アミノアクチノマイシンD及び側方散乱高さは、生細胞を選択するために用いられている。この手順を試みている間は、中性赤色のマーキングに基づいて実体顕微鏡下で脱髄病変を正確に微小解剖することを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

脳室周囲白質軟化症のマウスモデル

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoで</em神経炎症のモデルのマウスミクログリアの>イメージング

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

神経変性疾患のマウスモデルのための嗅覚アッセイ

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

タウの抗体を介したミクログリアによってクリアランスを勉強するセルベースのアッセイ

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

蛍光活性化細胞選別により確立された精製 GABAergic または Glutamatergic ニューロンの初代細胞培養

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...