Name: isolation of mouse primary microglia by magnetic-activated cell sorting in animal models of demyelination
Uploaded: 2022-04-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination at JoVE.com

Studien ble støttet av Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06).

Alle dyreprosedyrene er godkjent av Institute of Animal Care Committee ved Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Kina.
1. Materialer
<ol><li>Klargjør følgende løsninger før du starter protokollen.<ol>
<li>Forbered lastebufferen ved å tilsette foster bovint serum (FBS, 2%) til fosfatbufret saltvann (PBS).</li>
		<li>Tilsett nøytral rød (NR) fargestoff (endelig 1%) til PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered følgende løsninger ved hjelp a...

<ol>
	<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages.">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain.">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li><li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer+V+cortical+neurons+require+microglial+support+for+survival+during+postnatal+development.">Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).</li><li>Cunningham, C. L., Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+regulate+the+number+of+neural+precursor+cells+in+the+developing+cerebral+cortex.">Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).</li><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration.">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li><li>Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+microglial+subset+in+development,+aging,+and+disease:+Lessons+from+transcriptomic+studies.">Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).</li><li>Y&#305;ld&#305;zhan, K., Naz&#305;ro&#287;lu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+its+role+in+neurodegenerative+diseases.">Microglia and its role in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).</li><li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/brain+macrophages+as+central+drivers+of+brain+tumor+pathobiology.">Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+the+brain:+Complementary+partners+in+development+and+disease.">Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).</li><li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+dynamics+during+human+brain+development.">Microglial dynamics during human brain development.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).</li><li>Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era.">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li><li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+microglia:+isolation,+culturing,+and+selected+applications.">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2010).</li><li>Yildizhan, K., Naziroglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+depletion+and+parkinsonian+neurotoxin+MPP(+)-induced+TRPM2+channel+activation+play+central+roles+in+oxidative+cytotoxicity+and+inflammation+in+microglia.">Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia.</a> Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+microglia.">Isolation and culture of microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia.">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li><li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain.">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).</li><li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye.">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li><li>Sahel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+synaptic+connectivity+of+oligodendrocyte+precursor+cells+following+demyelination.">Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).</li><li>Schroeter, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+brain-all+cells:+A+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+CNS-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice.">One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 651 (2021).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing.">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).</li><li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+sequencing+reveals+glial+specific+responses+to+tissue+processing+&amp;+enzymatic+dissociation+in+mice+and+humans.">Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing &amp; enzymatic dissociation in mice and humans.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+applications+of+magnetic+cell+sorting+to+analyze+cell-type+specific+gene+and+protein+expression+in+the+central+nervous+system.">Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system.</a> PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+analysis+reveals+quiescent+microglia+isolation+methods+from+postnatal+mouse+brains+and+limitations+of+BV2+cells.">RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).</li></ol>

Protokollen foreslår en metode for å isolere mikroglia rundt de demyeliniserende lesjonene, noe som kan bidra til å studere de funksjonelle egenskapene til mikroglia i inflammatoriske demyeliniserende sykdommer. Mikroglia fanget ved hjelp av CD11b perler har høy renhet og levedyktighet. Kritiske trinn i protokollen inkluderer presis lokalisering av foci og optimal mikroglial rensing. I protokolltrinn 2.1 er det nødvendig å injisere NR-løsningen 2 timer før du ofrer musen for å sikre at lesjonene kan vises nøyak...

Mikroglia stammer fra eggeplomme-sac forfedre, som når den embryonale hjernen veldig tidlig og deltar i utviklingen av CNS 1,2. For eksempel er de involvert i synaptisk beskjæring3 og regulerer axonal vekst4. De utskiller faktorer som fremmer nevronal overlevelse og hjelper nevronal lokalisering5. Samtidig er de involvert i å fjerne unormale celler og apoptotiske celler for å sikre normal hjerneutvikling6. I tillegg, som de immun-kompetente cellene i hjernen, mikroglia kontinuerlig surveil hjernen parenchyma å fjerne døde celler, dysfunksjonelle synapser, og cellulære rusk7. Det har blitt demonstrert at mikroglial aktivering spiller en viktig rolle i en rekke sykdommer, inkludert inflammatoriske demyeliniserende sykdommer, nevrodegenerative sykdommer og hjernesvulster. Aktivert mikroglia ved multippel sklerose (MS) bidrar til differensiering av oligodendrocyttforløperceller (OPCer) og regenerering av myelin ved å oppsluke myelinrester8.
Ved Alzheimers sykdom (AD) aktiverer akkumulering av amyloid beta (Aβ) mikroglia, noe som påvirker fagocytiske og inflammatoriske funksjoner i mikroglia9. Aktivert mikroglia i gliomavevet, kalt glioma-assosiert mikroglia (GAM), kan regulere progresjonen av glioma og til slutt påvirke prognosen til pasienter10. Aktiveringen endrer dypt det mikrogliale transkripsjonssenteret, noe som resulterer i morfologiske endringer, uttrykk for immunreseptorer, økt fagocytisk aktivitet og forbedret cytokinsekresjon11. Det finnes forskjellige undergrupper av aktivert mikroglia ved nevrodegenerative sykdommer som sykdomsrelatert mikroglia (DAM), aktivert responsmikroglia (ARM) og mikroglial nevrodegenerativ fenotype (MGnD)8.
På samme måte sameksisterer flere dynamiske funksjonelle undergrupper av mikroglia også i hjernen i inflammatoriske demyeliniserende sykdommer12. Å forstå heterogeniteten mellom ulike undergrupper av mikroglia er avgjørende for å undersøke patogenesen av inflammatoriske demyeliniserende sykdommer og for å finne deres potensielle terapeutiske strategier. Heterogeniteten til mikroglia avhenger hovedsakelig av molekylær spesifisitet8. Det er viktig å beskrive molekylære endringer av mikroglia nøyaktig for studiet av heterogeniteten. Fremskritt innen encellet RNA-sekvenseringsteknologi (RNA-seq) har gjort det mulig å identifisere de molekylære egenskapene til aktivert mikroglia under patologiske forhold13. Derfor er evnen til å isolere cellepopulasjoner avgjørende for videre undersøkelse av disse målcellene under bestemte forhold.
Studier utført for å forstå egenskapene og funksjonene til mikroglia er vanligvis in vitro-studier, siden det har blitt funnet at et stort antall primære mikroglia kan tilberedes og dyrkes fra musevalphjerner (1-3 dager gamle), som festes til kulturflaskene og vokser på plastoverflaten med andre blandede glialceller. Deretter kan ren mikroglia isoleres basert på den forskjellige klebeevnen til blandede glialceller14,15. Denne metoden kan imidlertid bare isolere mikroglia fra perinatalhjernen og tar flere uker. Potensielle variabler i cellekulturen kan påvirke mikrogliale egenskaper som molekylært uttrykk16. Videre kan mikroglia isolert av disse metodene bare delta i in vitro-eksperimenter ved å simulere forholdene til CNS-sykdommer og kan ikke representere egenskapene og funksjonene til mikroglia i in vivo sykdomstilstander. Derfor er det nødvendig å utvikle metoder for å isolere mikroglia fra den voksne musehjernen.
Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og magnetisk separasjon er to mye brukte metoder, selv om de har sine egne forskjellige begrensninger 16,17,18,19. Deres respektive fordeler og ulemper vil bli kontrastert i diskusjonsdelen. Modningen av MACS-teknologi gir muligheten til raskt å rense celler. Huang et al. har utviklet en praktisk metode for å merke demyeliniserende lesjoner i hjernen20. Ved å kombinere disse to tekniske tilnærmingene foreslår vi en rask og effektiv kolonne CD11b magnetisk separasjonsprotokoll, som gir en trinnvis beskrivelse for å isolere mikroglia rundt demyeliniserende lesjoner i voksne musehjerner og bevare mikrogliaens molekylære egenskaper. Fokal demyelinerende lesjoner var forårsaket av stereotaktisk injeksjon av 2 μL lysolecitinoppløsning (1% LPC i 0,9% NaCl) i corpus callosum 3 dager før du starter protokollen21. Denne protokollen legger grunnlaget for å utføre neste trinn i in vitro-eksperimenter. Videre sparer denne protokollen tid og forblir mulig for utbredt bruk i ulike eksperimenter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT001015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>SJA Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) Beads, human and mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>BOSTER</td>
			<td>PYG0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1013690025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoCyte Flow Cytometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>A system consisting of various parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoExpress</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1.4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>BOSTER</td>
			<td>PYG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>MshOt</td>
			<td>MZ62</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse primary microglia by magnetic-activated cell sorting in animal models of demyelination

Mikroglia, de bosatte medfødte immuncellene i hjernen, er de primære responderne på betennelse eller skade i sentralnervesystemet (CNS). Mikroglia kan deles inn i hviletilstand og aktivert tilstand og kan raskt endre tilstand som svar på hjernens mikromiljø. Mikroglia vil bli aktivert under ulike patologiske forhold og vise forskjellige fenotyper. I tillegg er det mange forskjellige undergrupper av aktivert mikroglia og stor heterogenitet mellom forskjellige undergrupper. Heterogeniteten avhenger hovedsakelig av mikrogliaens molekylære spesifisitet. Studier har vist at mikroglia vil bli aktivert og spille en viktig rolle i den patologiske prosessen med inflammatorisk demyelinering. For bedre å forstå egenskapene til mikroglia i inflammatorisk demyeliniserende sykdommer som multippel sklerose og nevromyelittoptikkspektrumforstyrrelse, foreslår vi en perilesjonell primær mikroglial sorteringsprotokoll. Denne protokollen benytter kolonne magnetisk aktivert cellesortering (MACS) for å oppnå svært renset primærmikroglia og bevare mikrogliaens molekylære egenskaper for å undersøke de potensielle effektene av mikroglia i inflammatoriske demyeliniserende sykdommer.

Microglia isolert ved hjelp av CD11b perler har høy renhet Mikrogliale celler rundt lesjonene i demyelinasjonsmusmodeller ble isolert ved hjelp av ovennevnte protokoll og testet av strømningscytometri. Celler er fluorescerende merket med CD11b-fluorescein isothiocyanate (FITC) og CD45-allophycocyanin (APC) for å bestemme mikroglia i strømningscytometri i henhold til produsentens instruksjoner. Det er flere litteratur som viser at CD11b og CD45 antistoffer er nok til å se etter renheten av isolert...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination at JoVE.com

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Her presenterer vi en protokoll for å isolere og rense primærmikroglia i dyremodeller av demyeliniserende sykdommer, ved hjelp av kolonne magnetisk aktivert cellesortering.

Isolering av musens primære mikroglia ved magnetisk aktivert cellesortering i dyremodeller av demyelinering

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Denne protokollen bidrar til å isolere mikroglia fra de mikrodissekterte demyelinasjonslesjonene i den voksne musehjernen for å studere de mikrogliale egenskapene i vivo. Denne teknikken sparer tid og har lavere krav til både eksperimenter og utstyr. Denne metoden bidrar til å isolere mikroglia fra dyrets hjerne, spesielt de mikrodisserte vevene i ulike sykdomstilstander.Begynn med å mikroskopere lesjonene merket med nøytralt fargestoff rundt corpus callosum under et stereomikroskop. Sentrifuger det dissekerte vevet ved 300 ganger g i 30 sekunder for å samle prøven nederst på røret. Forvarm enzym bland en og enzym bland to til 37 grader Celsius i en inkubator.Tilsett deretter 1950 mikroliter for forvarmet enzymblanding en til en prøve, og fordøye i en inkubator ved 37 grader Celsius i fem minutter. Tilsett 30 mikroliter forvarmet enzymblanding to, og bland forsiktig. Etter fordøyelsen, tilsett fire milliliter kald PBS til røret, og rist forsiktig.Sentrifuger vevsprøvene ved 300 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius, og aspirer supernatanten sakte og helt. Resuspend cellepellet forsiktig med 1550 mikroliter kald PBS. Tilsett 450 mikroliter av den kalde løsningen for fjerning av rusk, og bland dem godt.Bruk en pipette på 1000 mikroliter til å legge blandingen svært sakte over, og forsiktig med to milliliter kald PBS. Sentrifuger blandingen, og se deretter etter de tre lagene. Bruk en pipette på 1000 mikroliter til å aspirere de to øverste lagene fullstendig, og fyll røret opptil fem milliliter med kaldlastebuffer.Snu røret forsiktig tre ganger. Deretter, etter sentrifugering og aspirasjon av supernatanten, resuspenderer cellepelleten med 90 mikroliter lastebuffer, og tilsett 10 mikroliter CD11b perler. Bland godt, og inkuber i 15 minutter ved fire grader Celsius.Etter inkubasjonen legger du til en milliliter av lastebufferen, og vask cellene ved å forsiktig pipette væsken opp og ned med en 1000-mikroliter pipette. Sentrifuger cellene ved 300 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius, og aspirer supernatanten helt for å fjerne de ubundne perlene. Resuspend cellene i 500 mikroliter av lastebufferen, og plasser MS-kolonnen med separatoren for positiv merking i magnetfeltet.Skyll kolonnen med 500 mikroliter av lastebufferen for å beskytte cellene og sikre effektiviteten til magnetisk sortering basert på produsentens protokoll. Bruk celleopphenget på MS-kolonnen, og forkast gjennomstrømningen som inneholder cellene uten etikett. Tilsett 500 mikroliter av lastebufferen for å vaske kolonnen, og fjern den fra separatoren.Plasser kolonnen på et sentrifugerør på 15 milliliter, og tilsett en milliliter av lastebufferen i kolonnen. Til slutt skyver du stempelet til bunnen av kolonnen for å skylle ut de magnetisk merkede cellene. En skjematisk representasjon av gating strategien som brukes i strømning cytometri analyse av mikroglia isolert fra demyelination lesjoner av voksne mus før og etter magnetisk aktivert celle sortering er vist her.De grafiske bildene representerer fremoverspredningshøyden og sidespredningshøyden for å merke celler, fremoverspredningsområde og fremoverspredningshøyde for merking av enkeltceller, og CD11b-FITC og CD45-APC for valg av myeloidceller og mikroglia. Andelen mikroglia har økt betydelig etter den magnetisk aktiverte cellesorteringen. Det grafiske bildet representerer gatingstrategien som brukes i strømningscytometrianalyse for levende og døde enkeltceller etter den magnetisk aktiverte cellesorteringen.Her har 7-aminoactinomycin D og sidespredningshøyde blitt brukt til å velge levende celler. Mens du prøver denne prosedyren, husk å nøyaktig mikrodissere de demyeliniserende lesjonene under et stereomikroskop basert på nøytrale røde markeringer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Olfactory Analyser for musemodeller av nevrodegenerativ sykdom

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Rask og raffinert CD11b Magnetic Isolering av Primary Microglia med Enhanced Purity og allsidighet

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering og isolering av musen primære Microglia av tetthet gradert sentrifugering

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Rask og spesifikk Immunomagnetic isolasjon av musen primære Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Cellebasert analysen å studere antistoff-mediert Tau godkjennes av Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Primær Cell kultur renset GABAergic eller Glutamatergic neurons etablert gjennom fluorescens-aktivert Cell sortering

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolering av region-spesifikke Mikroglia fra en voksen mus Brain halvkule for Deep single-celle RNA sekvensering

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...