Name: isolation of mouse primary microglia by magnetic-activated cell sorting in animal models of demyelination
Uploaded: 2022-04-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination at JoVE.com

Studien stöddes av Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Bidrag nr 2020YQ06).

Alla djurprocedurer har godkänts av Institute of Animal Care Committee of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Kina.
1. Material
<ol><li>Förbered följande lösningar innan du påbörjar protokollet.<ol>
<li>Förbered laddningsbufferten genom att tillsätta fetalt bovint serum (FBS, 2%) till fosfatbuffrad saltlösning (PBS).</li>
		<li>Tillsätt neutralt rött (NR) färgämne (slutligt 1%) till PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered följan...

<ol>
	<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages.">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain.">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li><li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer+V+cortical+neurons+require+microglial+support+for+survival+during+postnatal+development.">Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).</li><li>Cunningham, C. L., Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+regulate+the+number+of+neural+precursor+cells+in+the+developing+cerebral+cortex.">Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).</li><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration.">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li><li>Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+microglial+subset+in+development,+aging,+and+disease:+Lessons+from+transcriptomic+studies.">Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).</li><li>Y&#305;ld&#305;zhan, K., Naz&#305;ro&#287;lu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+its+role+in+neurodegenerative+diseases.">Microglia and its role in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).</li><li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/brain+macrophages+as+central+drivers+of+brain+tumor+pathobiology.">Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+the+brain:+Complementary+partners+in+development+and+disease.">Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).</li><li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+dynamics+during+human+brain+development.">Microglial dynamics during human brain development.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).</li><li>Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era.">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li><li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+microglia:+isolation,+culturing,+and+selected+applications.">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2010).</li><li>Yildizhan, K., Naziroglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+depletion+and+parkinsonian+neurotoxin+MPP(+)-induced+TRPM2+channel+activation+play+central+roles+in+oxidative+cytotoxicity+and+inflammation+in+microglia.">Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia.</a> Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+microglia.">Isolation and culture of microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia.">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li><li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain.">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).</li><li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye.">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li><li>Sahel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+synaptic+connectivity+of+oligodendrocyte+precursor+cells+following+demyelination.">Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).</li><li>Schroeter, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+brain-all+cells:+A+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+CNS-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice.">One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 651 (2021).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing.">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).</li><li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+sequencing+reveals+glial+specific+responses+to+tissue+processing+&amp;+enzymatic+dissociation+in+mice+and+humans.">Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing &amp; enzymatic dissociation in mice and humans.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+applications+of+magnetic+cell+sorting+to+analyze+cell-type+specific+gene+and+protein+expression+in+the+central+nervous+system.">Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system.</a> PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+analysis+reveals+quiescent+microglia+isolation+methods+from+postnatal+mouse+brains+and+limitations+of+BV2+cells.">RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).</li></ol>

Protokollet föreslår en metod för att isolera mikroglia runt de demyeliniserande lesionerna, vilket kan hjälpa till att studera de funktionella egenskaperna hos mikroglia vid inflammatoriska demyeliniserande sjukdomar. Microglia fångad med CD11b-pärlor uppvisar hög renhet och livskraft. Kritiska steg i protokollet inkluderar exakt lokalisering av foci och optimal mikroglial rening. I protokollsteg 2.1 är det nödvändigt att injicera NR-lösningen 2 timmar innan du offrar musen för att säkerställa att lesioner...

Microglia härstammar från äggulor, som når embryonhjärnan mycket tidigt och deltar i utvecklingen av CNS 1,2. Till exempel är de involverade i synaptisk beskärning3 och reglering av axonal tillväxt4. De utsöndrar faktorer som främjar neuronal överlevnad och hjälper neuronal lokalisering5. Samtidigt är de involverade i att ta bort onormala celler och apoptotiska celler för att säkerställa normal hjärnutveckling6. Dessutom, som de immunkompetenta cellerna i hjärnan, övervakar microglia kontinuerligt hjärnans parenkym för att rensa döda celler, dysfunktionella synapser och cellulärt skräp7. Det har visat sig att mikroglial aktivering spelar en viktig roll i en mängd olika sjukdomar, inklusive inflammatoriska demyeliniserande sjukdomar, neurodegenerativa sjukdomar och hjärntumörer. Aktiverad mikroglia vid multipel skleros (MS) bidrar till differentiering av oligodendrocytprekursorceller (OPC) och regenerering av myelin genom att uppsluka myelinskräp8.
Vid Alzheimers sjukdom (AD) aktiverar ackumulering av amyloid beta (Aβ) mikroglia, vilket påverkar de fagocytiska och inflammatoriska funktionerna hos microglia9. Aktiverad mikroglia i gliomvävnaden, kallad glioma-associerad microglia (GAM), kan reglera utvecklingen av gliom och i slutändan påverka prognosen för patienter10. Aktiveringen förändrar djupt det mikrogliala transkriptomet, vilket resulterar i morfologiska förändringar, uttryck av immunreceptorer, ökad fagocytisk aktivitet och förbättrad cytokinsekretion11. Det finns olika delmängder av aktiverad mikroglia vid neurodegenerativa sjukdomar såsom sjukdomsassocierad mikroglia (DAM), aktiverad responsmikroglia (ARM) och mikroglial neurodegenerativ fenotyp (MGnD)8.
På samma sätt samexisterar flera dynamiska funktionella delmängder av mikroglia också i hjärnan vid inflammatoriska demyeliniserande sjukdomar12. Att förstå heterogeniteten mellan olika delmängder av mikroglia är avgörande för att undersöka patogenesen av inflammatoriska demyeliniserande sjukdomar och för att hitta deras potentiella terapeutiska strategier. Heterogeniteten hos microglia beror huvudsakligen på molekylär specificitet8. Det är viktigt att beskriva de molekylära förändringarna av mikroglia exakt för studier av heterogeniteten. Framsteg inom encells RNA-sekvensering (RNA-seq) -teknik har möjliggjort identifiering av de molekylära egenskaperna hos aktiverad mikroglia vid patologiska tillstånd13. Därför är förmågan att isolera cellpopulationer avgörande för vidare undersökning av dessa målceller under specifika förhållanden.
Studier som utförs för att förstå egenskaperna och funktionerna hos microglia är vanligtvis in vitro-studier, eftersom det har visat sig att ett stort antal primära mikroglia kan framställas och odlas från musunghjärnor (1-3 dagar gamla), som fäster vid odlingskolvarna och växer på plastytan med andra blandade glialceller. Därefter kan ren mikroglia isoleras baserat på den olika vidhäftningen hos blandade gliaceller14,15. Denna metod kan dock bara isolera mikroglia från den perinatala hjärnan och tar flera veckor. Potentiella variabler i cellodling kan påverka mikrogliala egenskaper såsom molekylärt uttryck16. Dessutom kan mikroglia som isoleras med dessa metoder endast delta i in vitro-experiment genom att simulera tillstånden för CNS-sjukdomar och kan inte representera egenskaperna och funktionerna hos microglia i in vivo-sjukdomstillstånd. Därför är det nödvändigt att utveckla metoder för att isolera mikroglia från den vuxna mushjärnan.
Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och magnetisk separation är två allmänt använda metoder, även om de har sina egna olika begränsningar 16,17,18,19. Deras respektive fördelar och nackdelar kommer att kontrasteras i diskussionsavsnittet. Mognaden av MACS-teknik ger möjlighet att snabbt rena celler. har utvecklat en bekväm metod för att märka demyeliniserande lesioner i hjärnor20. Genom att kombinera dessa två tekniska tillvägagångssätt föreslår vi ett snabbt och effektivt kolumnärt CD11b magnetiskt separationsprotokoll, vilket ger en steg-för-steg-beskrivning för att isolera mikroglia runt demyeliniserande lesioner i vuxna mushjärnor och bevara de molekylära egenskaperna hos microglia. De fokala demyeliniserande lesionerna orsakades av stereotaktisk injektion av 2 μl lysolecithinlösning (1% LPC i 0,9% NaCl) i corpus callosum 3 dagar innan protokollet21 startades. Detta protokoll lägger grunden för att utföra nästa steg i in vitro-experiment. Dessutom sparar detta protokoll tid och är fortfarande möjligt för utbredd användning i olika experiment.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT001015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>SJA Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) Beads, human and mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>BOSTER</td>
			<td>PYG0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1013690025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoCyte Flow Cytometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>A system consisting of various parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoExpress</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1.4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>BOSTER</td>
			<td>PYG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>MshOt</td>
			<td>MZ62</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse primary microglia by magnetic-activated cell sorting in animal models of demyelination

Microglia, de bosatta medfödda immuncellerna i hjärnan, är de primära svararna på inflammation eller skada i centrala nervsystemet (CNS). Microglia kan delas in i vilotillstånd och aktiverat tillstånd och kan snabbt ändra tillstånd som svar på hjärnans mikromiljö. Microglia kommer att aktiveras under olika patologiska förhållanden och uppvisa olika fenotyper. Dessutom finns det många olika undergrupper av aktiverad mikroglia och stor heterogenitet mellan olika undergrupper. Heterogeniteten beror huvudsakligen på mikroglias molekylära specificitet. Studier har visat att mikroglia kommer att aktiveras och spela en viktig roll i den patologiska processen med inflammatorisk demyelinering. För att bättre förstå egenskaperna hos mikroglia vid inflammatoriska demyeliniserande sjukdomar som multipel skleros och neuromyelit optica spectrum disorder, föreslår vi ett perilesionellt primärt mikroglial sorteringsprotokoll. Detta protokoll använder kolumnär magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) för att erhålla högrenad primär mikroglia och bevara de molekylära egenskaperna hos microglia för att undersöka de potentiella effekterna av mikroglia vid inflammatoriska demyeliniserande sjukdomar.

Microglia isolerad med CD11b-pärlor har hög renhet Mikrogliaceller runt lesionerna i demyeliniseringsmusmodeller isolerades med hjälp av ovannämnda protokoll och testades med flödescytometri. Cellerna är fluorescerande märkta med CD11b-fluoresceinisotiocyanat (FITC) och CD45-allophycocyanin (APC) för att bestämma mikroglia i flödescytometri enligt tillverkarens instruktioner. Det finns flera litteraturer som visar att CD11b- och CD45-antikroppar räcker för att kontrollera renheten hos isol...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination at JoVE.com

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Här presenterar vi ett protokoll för att isolera och rena primär mikroglia i djurmodeller av demyeliniserande sjukdomar, med hjälp av kolumnär magnetaktiverad cellsortering.

Isolering av musens primära mikroglia genom magnetisk aktiverad cellsortering i djurmodeller av demyelinering

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Detta protokoll hjälper till att isolera mikroglia från de mikrodissekerade demyelineringsskadorna hos den vuxna mushjärnan för att studera mikrogliaegenskaperna in vivo. Denna teknik sparar tid och har lägre krav på både experimenter och utrustning. Denna metod hjälper till att isolera mikroglia från djurets hjärna, särskilt de mikrodissekerade vävnaderna i olika sjukdomstillstånd.Börja med att mikrodissekera lesionerna märkta med neutralt färgämne runt corpus callosum under ett stereomikroskop. Centrifugera den dissekerade vävnaden vid 300 gånger g i 30 sekunder för att samla provet i botten av röret. Förvärm enzymblandning ett och enzymblandning två till 37 grader Celsius i en inkubator.Tillsätt sedan 1 950 mikroliter förvärmd enzymblandning ett till ett prov och smälta i en inkubator vid 37 grader Celsius i fem minuter. Tillsätt 30 mikroliter förvärmd enzymblandning två och blanda försiktigt. Efter matsmältningen tillsätt fyra milliliter kall PBS till röret och skaka försiktigt.Centrifugera vävnadsproverna vid 300 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius och aspirera supernatanten långsamt och fullständigt. Resuspendera cellpelleten försiktigt med 1 550 mikroliter kall PBS. Tillsätt 450 mikroliter av den kalla lösningen för borttagning av skräp och blanda dem väl.Använd en 1 000 mikroliterpipett för att lägga över blandningen mycket långsamt och försiktigt med två milliliter kall PBS. Centrifugera blandningen och leta sedan efter de tre skikten. Använd en 1 000 mikroliterpipett för att helt aspirera de två översta skikten och fyll röret upp till fem milliliter med kall laddningsbuffert.Vänd försiktigt röret tre gånger. Därefter, efter centrifugering och aspiration av supernatanten, återsuspendera cellpelleten med 90 mikroliter lastbuffert och tillsätt 10 mikroliter CD11b-pärlor. Blanda väl och inkubera i 15 minuter vid fyra grader Celsius.Efter inkubationen tillsätt en milliliter av lastbufferten och tvätta cellerna genom att försiktigt pipettera vätskan upp och ner med en 1 000 mikroliterpipett. Centrifugera cellerna vid 300 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius och aspirera supernatanten helt för att ta bort de obundna pärlorna. Resuspendera cellerna i 500 mikroliter av laddningsbufferten och placera MS-kolonnen med dess separator för positivt urval i magnetfältet.Skölj kolonnen med 500 mikroliter av lastbufferten för att skydda cellerna och säkerställa effektiviteten i magnetisk sortering baserat på tillverkarens protokoll. Applicera cellsuspensionen på MS-kolumnen och kassera genomströmningen som innehåller de omärkta cellerna. Tillsätt 500 mikroliter av lastbufferten för att tvätta kolonnen och ta bort den från separatorn.Placera kolonnen på ett 15-milliliter centrifugrör och tillsätt en milliliter av lastbufferten i kolonnen. Tryck slutligen kolven till botten av kolonnen för att spola ut de magnetiskt märkta cellerna. En schematisk representation av gatingstrategin som används vid flödescytometrianalys av mikroglia isolerad från demyelineringsskador hos vuxna möss före och efter den magnetaktiverade cellsorteringen visas här.De grafiska bilderna representerar den främre spridningshöjden och sidospridningshöjden för att välja celler, framåtspridningsområdet och den framåtriktade spridningshöjden för att välja enskilda celler, och CD11b-FITC och CD45-APC för att välja myeloida celler och mikroglia. Andelen mikroglia har ökat markant efter den magnetaktiverade cellsorteringen. Den grafiska bilden representerar den grindstrategi som används vid flödescytometrianalys för levande och döda enskilda celler efter den magnetaktiverade cellsortering.Här har 7-aminoaktinomycin D och sidospridningshöjd använts för att välja de levande cellerna. När du försöker denna procedur, kom ihåg att exakt mikrodissekera de demyeliniserande lesionerna under ett stereomikroskop baserat på de neutrala röda markeringarna.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

Musmodeller av periventrikulär Leukomalacia

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

En tunn-skalle Fönster Teknik för kronisk två-photon In vivo Imaging av murina mikroglia i modeller av Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Olfactory Analyser för musmodeller av neurodegenerativ sjukdom

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Snabb och Raffinerad CD11b Magnetic Isolering av primär mikroglia med förbättrad renhet och mångsidighet

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering och isolering av mus primära mikroglia täthet lutning centrifugering

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Snabb och specifika immunmagnetisk isolering av mus primära oligodendrocyter

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Cell-baserad analys att studera antikroppsmedierad Tau Clearance av mikroglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Primär cell kultur av renade GABAergic eller Glutamatergic nerv celler etablerad genom Fluorescence-aktive rad cell sortering

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolering av regionspecifika Microglia från en vuxen mus hjärnhalva halvklotet för djup Single-cell RNA sekvensering

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...